石一峰，黃英如，劉云霄，張 松，冼 華

1.重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院骨傷教研室，重慶 400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶 400016

周圍神經(jīng)長段缺損是嚴重的周圍神經(jīng)損傷，受來源限制，自體神經(jīng)移植不能滿足其修復需求［1-2］。同種異體神經(jīng)具有自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu)，最有可能替代自體神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損。周圍神經(jīng)冷凍保存能為神經(jīng)缺損修復提供充足的神經(jīng)移植物。但冷凍保存過程中細胞內(nèi)外冰晶的形成和滲透應力變化等，會影響冷凍保存后周圍神經(jīng)施萬細胞（Schwann cells，SCs）的活性［3-4］。而SCs 作為周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能細胞，是周圍神經(jīng)損傷后促神經(jīng)再生營養(yǎng)成分的主要來源，對神經(jīng)損傷后的軸突再生起著重要的作用［5-6］。因此，冷凍保存后具有活性SCs 的周圍神經(jīng)，對異體移植后神經(jīng)再生具有重要作用。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是機體在各種應激條件（包括缺血、熱應激、氧化應激等［7-8］）下產(chǎn)生的一類對細胞具有保護作用的蛋白質(zhì)分子家族。HSP70作為HSP 家族中的主要成員，能增強細胞的耐受性，保護細胞免受致命刺激引起的細胞損傷［9-10］。有研究［11-12］表明，心肌細胞、胃黏膜細胞能夠通過誘導HSP70 高表達保護自身免受H2O2誘導的凋亡。

本研究模擬體外熱應激環(huán)境，誘導周圍神經(jīng)表達HSP70，觀察HSP70對冷凍保存周圍神經(jīng)SCs的活性及異體移植后受者神經(jīng)再生的影響，探討HSP70 減輕周圍神經(jīng)冷凍保存損傷的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～7 周齡SPF 級雌性SD 大鼠87 只（重慶醫(yī)科大學動物中心提供），體質(zhì)量160～200 g，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（渝）2018-0003。6～7 周齡SPF 級雌性Wistar 大鼠39 只（遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供），體質(zhì)量160～200 g，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001。實驗大鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，12 h 明暗交替，相對濕度65%～75%，室溫22～24 ℃。動物使用許可證號SYXK（渝）2018-0003。實驗符合重慶醫(yī)科大學動物實驗研究倫理標準。

1.2 主要試劑與儀器

HSP70、 主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）抗體（英國Abcam），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9、MHC-Ⅰ抗體（美國Affinity），高糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（上海吉泰依科賽生物科技有限公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），生物機能實驗系統(tǒng)（型號BL-420N，成都泰盟軟件有限公司）。

1.3 SD大鼠坐骨神經(jīng)熱應激預處理

取SD 大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，無菌操作下分別截取兩側(cè)坐骨神經(jīng)片段15 mm，室溫下生理鹽水沖洗。隨機將大鼠坐骨神經(jīng)置于高糖型DMEM 培養(yǎng)基［含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素混合溶液（雙抗）］中，分別于37、42和45 ℃體外進行預處理1 h（記為37 ℃組、42 ℃組和45 ℃組，每組36根神經(jīng)）。另外設置未經(jīng)熱應激預處理但需要進行冷凍保存的對照組（Con 組，36 根神經(jīng)）以及未經(jīng)熱應激預處理且不進行冷凍保存的新鮮神經(jīng)組（Fresh 組，30 根神經(jīng)）。各組坐骨神經(jīng)用于移植術(shù)及相關(guān)檢測。

1.4 SD大鼠坐骨神經(jīng)的冷凍保存及復溫

高糖型DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS、1% 雙抗、0.2 mol/L海藻糖）中分別加入5%、10%、20%的二甲基亞砜（DMSO）和乙二醇（DMSO 與乙二醇體積比1∶1），配制成含5%、10%、20%冷凍保護劑的冷凍保存液。

上述37 ℃組、42 ℃組、45 ℃組、Con組大鼠坐骨神經(jīng)先后在含5%、10%冷凍保護劑的冷凍保存液中室溫靜置10 min；然后于含20%冷凍保護劑的冷凍保存液中，4 ℃靜置30 min，-20 ℃靜置1 h，-80 ℃靜置1 h；最后于液氮保存4周。

保存4 周后的坐骨神經(jīng)于37 ℃水浴鍋中復溫3 min，先后在含10%、5%冷凍保護劑的冷凍保存液中室溫靜置10 min，再于含10% FBS 和1%雙抗高糖DMEM 培養(yǎng)基中室溫靜置10 min。

1.5 SD大鼠坐骨神經(jīng)異體移植

取受體Wistar 大鼠，麻醉同前，暴露右大腿中部坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣5 mm 處造成10 mm神經(jīng)缺損。將37 ℃組、42 ℃組、45 ℃組、Con 組、Fresh 組SD 大鼠坐骨神經(jīng)（每組6 根）修剪至10 mm，用于修復對應Wistar大鼠坐骨神經(jīng)10 mm 缺損（分別為37 ℃-Allo 組、42 ℃-Allo組、45 ℃-Allo組、Con-Allo組、Fresh-Allo組，每組6 只Wistar 大鼠）。同時設置Wistar 大鼠坐骨神經(jīng)同系移植組（Fresh-Iso組）；取9只Wistar大鼠，將其中3只處死取雙側(cè)坐骨神經(jīng)移植至6 只受體大鼠坐骨神經(jīng)缺損處。手術(shù)顯微鏡下行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合4～6針，逐層縫合切口。手術(shù)操作由單人完成。

1.6 檢測指標

1.6.1 Western blotting 檢測坐骨神經(jīng)HSP70 表達 取37 ℃組、42 ℃組、45 ℃組、Con組SD大鼠坐骨神經(jīng)（每組6根），加入裂解液，組織勻漿后13 700×g離心15 min，取上清液。BCA法蛋白定量后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，封閉，TBST洗膜，加HSP70（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）抗體孵育，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗孵育，化學發(fā)光顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6.2 Western blotting 檢測坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及caspase-3、caspase-9 表達 取37 ℃組、42 ℃組、45 ℃組、Con組冷凍保存4周的SD 大鼠坐骨神經(jīng)和Fresh組SD 大鼠坐骨神經(jīng)（每組6 根），Western blotting 檢測MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達。上述各組再取6 根神經(jīng)，同樣方法檢測caspase-3和caspase-9蛋白的表達。

1.6.3 流式細胞術(shù)檢測冷凍保存后坐骨神經(jīng)細胞的存活率 將上述冷凍保存4 周的坐骨神經(jīng)和Fresh 組坐骨神經(jīng)（每組6 根），用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，置于6 孔板中，用直頭眼科剪剪碎神經(jīng)組織至長度約1 mm，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min。收集上清液，用DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。按照上述方法重復3 次。收集細胞懸液，40 μm 篩網(wǎng)過濾，100×g離心5 min。棄去上清液，用PBS 吹打分散細胞，制成4×105個/mL 的單細胞懸液。根據(jù)Annexin VFITC/PI 試劑盒說明書染色，流式細胞術(shù)檢測各組坐骨神經(jīng)活細胞的存活情況。

1.6.4 Western blotting 檢測冷凍保存后坐骨神經(jīng)體外表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的情況 取上述冷凍保存4周的坐骨神經(jīng)和Fresh 組坐骨神經(jīng)（每組6 根），修剪至長度約3 mm，置于含10% FBS 和1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，每2 d 換液。按照上述Western blotting 步驟檢測BDNF和GDNF的表達。

1.6.5 移植術(shù)后電生理檢測 移植術(shù)后20 周，每組大鼠于原切口暴露坐骨神經(jīng)（每組6 只），刺激電極置于距梨狀肌下緣3 mm 處神經(jīng)干，接收電極置于腓腸肌中間距外踝上方10 mm處，地線接地遠離兩電極。BL-420N機能實驗系統(tǒng)測定肌肉復合動作電位（compound muscle action potential，CMAP） 和神經(jīng)傳導速度（nerve conduction velocity，NCV）。刺激頻率為1 Hz，刺激電流4 mA。

1.6.6 再生神經(jīng)組織學分析 電生理檢測后，切取各組移植神經(jīng)中部5 mm 片段。每組隨機選取2 個樣本，超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染，透射電鏡觀察再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)；其余樣本半薄切片，甲苯胺藍染色，每張切片隨機取5 個視野，CCD 光譜測量系統(tǒng)分析。Image-ProPlus 6.0軟件分析再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量及髓鞘厚度。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 坐骨神經(jīng)HSP70表達

檢測不同溫度預處理坐骨神經(jīng)和Con 組坐骨神經(jīng)HSP70 蛋白的表達。結(jié)果（圖1）顯示：42 ℃組HSP70蛋白表達水平高于37 ℃組、45 ℃組和Con 組（均P＜0.05）；45 ℃組HSP70 蛋白表達水平與Con 組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），但37 ℃組與Con 組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.086）。

圖1 坐骨神經(jīng)HSP70表達Fig 1 Expression of HSP70 in sciatic nerve

2.2 冷凍保存后坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及caspase-3、caspase-9的表達

Western blotting 檢測冷凍保存4 周的坐骨神經(jīng)和新鮮坐骨神經(jīng)中MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達。結(jié)果（圖2）顯示：42 ℃組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白與37 ℃組、45 ℃組、Con 組比較差異無統(tǒng)計學意義，但與Fresh 組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001，P=0.000）。

圖2 坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達Fig 2 Expression of MHC-Ⅰand MHC-Ⅱin sciatic nerve

Western blotting 檢測冷凍保存4 周的坐骨神經(jīng)和新鮮坐骨神經(jīng)中caspase-3、caspase-9蛋白的表達。結(jié)果（圖3）顯示：42 ℃組caspase-3、caspase-9蛋白表達低于37 ℃組、45 ℃組、Con組，但高于Fresh組（均P＜0.05）。

圖3 坐骨神經(jīng)caspase-3和caspase-9表達Fig 3 Expression of caspase-3 and caspase-9 in sciatic nerve

2.3 冷凍保存后坐骨神經(jīng)細胞的存活情況

流式細胞術(shù)檢測冷凍保存4周的坐骨神經(jīng)和新鮮坐骨神經(jīng)細胞存活情況。結(jié)果（圖4）顯示：42 ℃組活細胞數(shù)高于37 ℃組、45 ℃組、Con 組（均P=0.000），但低于Fresh組（P=0.000）。

圖4 坐骨神經(jīng)細胞存活情況Fig 4 Survival of sciatic nerve cells

2.4 冷凍保存后坐骨神經(jīng)體外表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的情況

Western blotting 檢測冷凍保存4 周的坐骨神經(jīng)和新鮮坐骨神經(jīng)體外培養(yǎng)7 d 后BDNF、GDNF 的表達。結(jié)果（圖5）顯示：42 ℃組BDNF、GDNF 的表達水平較37 ℃組、45 ℃組、Con 組升高（均P=0.000），與Fresh 組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖5 培養(yǎng)7 d后坐骨神經(jīng)中BDNF和GDNF的表達Fig 5 Expression of BDNF and GDNF in sciatic nerve cultured for 7 d

2.5 坐骨神經(jīng)移植術(shù)后電生理檢測

坐骨神經(jīng)移植術(shù)后20周，電生理檢測結(jié)果（圖6）顯示：42 ℃-Allo組CMAP、NCV優(yōu)于37 ℃-Allo組、45 ℃-Allo組、Con-Allo組、Fresh-Allo組（均P=0.000）；42 ℃-Allo組、Con-Allo組與Fresh-Iso組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖6 術(shù)后20周各組坐骨神經(jīng)CMAP檢測Fig 6 Detection of CMAP of sciatic nerve in each group at the 20th week after surgery

2.6 再生神經(jīng)組織學分析

坐骨神經(jīng)移植術(shù)后20 周，甲苯胺藍及電鏡結(jié)果（圖7）顯示：42 ℃-Allo組有髓神經(jīng)纖維數(shù)、髓鞘厚度均優(yōu)于37 ℃-Allo 組、45 ℃-Allo 組、Con-Allo 組、Fresh-Allo 組（均P=0.000）；42 ℃-Allo 組、Con-Allo 組與Fresh-Iso組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。

圖7 術(shù)后20周再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)和再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)Fig 7 Number of myelinated nerve fibers and the ultrastructure of regenerated nerve at the 20th week after surgery

3 討論

由于存在新的神經(jīng)損傷和神經(jīng)來源限制等問題，自體神經(jīng)移植無法適應不同部位、不同程度周圍神經(jīng)缺損修復的需求［1-2］。具有來源優(yōu)勢的同種異體神經(jīng)與自體神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)相同，是自體移植的很好替代。周圍神經(jīng)冷凍保存能為神經(jīng)缺損的修復提供充足的移植物，然而，低溫冷凍保存過程中細胞內(nèi)外冰晶的形成和滲透應力變化等情況，會造成組織、細胞冷凍保存損傷［3-4］。周圍神經(jīng)冷凍保存過程中SCs 的損傷，可能不利于冷凍保存周圍神經(jīng)同種異體移植后受者神經(jīng)的再生。

本研究應用HSP70 減輕周圍神經(jīng)冷凍保存損傷。首先，將大鼠坐骨神經(jīng)在體外不同溫度熱應激預處理1 h，結(jié)果顯示大鼠坐骨神經(jīng)體外42 ℃熱應激預處理可以誘導HSP70高表達；然后，將熱應激預處理后的坐骨神經(jīng)在液氮中保存4周，結(jié)果顯示42 ℃組caspase-3、caspase-9表達水平低于37 ℃組、45 ℃組和Con組，而其神經(jīng)活細胞存活率則明顯高于其他冷凍保存組（37 ℃組、45 ℃組、Con組），并且42 ℃組坐骨神經(jīng)體外表達BDNF、GDNF 能力也高于37 ℃組、45 ℃組和Con組；最后，用冷凍保存坐骨神經(jīng)同種異體移植修復周圍神經(jīng)缺損，結(jié)果顯示同種異體移植術(shù)后20周，高表達HSP70的坐骨神經(jīng)-冷凍保存移植組（42 ℃-Allo 組）神經(jīng)再生效果明顯優(yōu)于非高表達HSP70的坐骨神經(jīng)-冷凍保存移植組（37 ℃-Allo組、45 ℃-Allo組）和新鮮坐骨神經(jīng)-冷凍保存移植組（Con-Allo組）。

HSP 是原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)的高度保守的蛋白，在正常生理條件下低水平表達，包括HSP90、HSP70、HSP27等［7-8］。HSP70是進化中高度保守的蛋白，在營養(yǎng)缺失、氧化應激、熱應激等條件下高表達，通過“分子伴侶”的作用保護蛋白質(zhì)免于錯誤折疊和聚集的危險［9-10］。研究［13］發(fā)現(xiàn)，HSP70 高表達是保護腎小管上皮細胞抵抗低溫保存和復溫損傷的原因之一。HSP70 已被證明與凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor 1，APAF-1）相結(jié)合，抑制凋亡體的形成，進而阻止caspase-9 的成熟和下游caspase-3 的激活［14-15］。在本研究中，我們應用HSP70 來減輕周圍神經(jīng)冷凍保存損傷。首先通過體外不同溫度（37 ℃、42 ℃、45 ℃）熱應激預處理大鼠坐骨神經(jīng)1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)在體外42 ℃熱應激預處理能誘導HSP70 高表達；隨之，我們將體外熱應激預處理后的大鼠坐骨神經(jīng)于液氮中保存，結(jié)果顯示，42 ℃組caspase-3、caspase-9 表達水平更低，細胞存活率更高，說明熱應激預處理誘導HSP70 高表達減輕了坐骨神經(jīng)的冷凍保存損傷。

SCs作為周圍神經(jīng)的主要膠質(zhì)細胞，在周圍神經(jīng)損傷后，為再生軸突提供物理支持，并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，構(gòu)建軸突生長的微環(huán)境［16-17］。SCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力對冷凍保存后同種異體移植受者神經(jīng)再生具有積極意義［18-19］。本研究中，我們將冷凍保存后的坐骨神經(jīng)體外培養(yǎng)1周，以評價冷凍保存坐骨神經(jīng)SCs表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力。結(jié)果提示，液氮冷凍保存后的坐骨神經(jīng)具有表達BDNF 和GDNF 的能力，而以42 ℃組BDNF 和GDNF 表達水平最高；異體移植術(shù)后20 周，高表達HSP70 的冷凍保存移植組（42 ℃-Allo 組） CMAP、NCV、有髓神經(jīng)纖維數(shù)、髓鞘厚度均優(yōu)于非高表達HSP70 的冷凍保存移植組（37 ℃-Allo 組、45 ℃-Allo 組）和新鮮冷凍保存移植組（Con-Allo 組），其移植后的神經(jīng)再生效果明顯。這些結(jié)果表明，周圍神經(jīng)冷凍保存后存活的SCs，仍具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學功能，有利于同種異體移植后受者神經(jīng)再生。

冷凍保存的周圍神經(jīng)同種異體移植修復神經(jīng)缺損的效果，除了與冷凍保存后神經(jīng)存活SCs 的活性有直接關(guān)系外，還與冷凍保存周圍神經(jīng)的免疫原性有關(guān)［20］。在本研究中，坐骨神經(jīng)冷凍保存后MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達，42 ℃組與37 ℃組、45 ℃組、Con組間差異無統(tǒng)計學意義。這表明高表達HSP70 的坐骨神經(jīng)冷凍保存后維持較高的SCs 存活率，沒有導致冷凍保存神經(jīng)免疫原性的增加，這對冷凍保存周圍神經(jīng)修復神經(jīng)缺損的臨床應用具有積極意義。

綜上所述，體外熱應激預處理能誘導大鼠坐骨神經(jīng)表達HSP70，坐骨神經(jīng)高表達HSP70 能減輕其冷凍保存損傷，提高保存后活性SCs 數(shù)量，促進同種異體移植后受者神經(jīng)再生。但HSP70 減輕坐骨神經(jīng)冷凍保存損傷的可能機制，以及HSP 家族其他成員對坐骨神經(jīng)冷凍保存損傷的影響，還需要進一步研究。