張立書 ， 張 琦 ， 劉安琪 ， 金 鈁

（1. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔正畸科，陜西 西安 710032； 2.中國人民解放軍陸軍第71 集團(tuán)軍醫(yī)院，江蘇 徐州 221000）

牙齒受力后, 牙周膜和牙槽骨發(fā)生活躍的組織改建是牙齒移動(dòng)的生理基礎(chǔ)[1]，從細(xì)胞層面觀察，壓力側(cè)破骨細(xì)胞生成增多，吸收壓力側(cè)的牙槽骨使牙齒向壓力側(cè)移動(dòng)， 同時(shí)張力側(cè)成骨細(xì)胞生成增多，形成類骨質(zhì)，使在張力作用下拉伸變寬的牙周膜恢復(fù)到正常牙周膜寬度[2-4]，但其具體的分子機(jī)制仍未明確。 因此，牙周組織受力后，介導(dǎo)牙齒移動(dòng)的具體機(jī)制仍是目前正畸領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Alpl 基因參與編碼組織非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNALP），而TNALP 是堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的一種，主要在骨和肝臟組織中表達(dá)，在牙齒和骨骼系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。 ALP 在成骨細(xì)胞系中表達(dá)，可作為成骨分化的重要標(biāo)志物，在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）成骨分化的早期，ALP 表達(dá)量開始升高， 其表達(dá)量的高低可作為判斷成骨細(xì)胞分化程度和功能的指標(biāo)[6]。 正畸牙移動(dòng)中張力側(cè)的骨形成與ALP 活性密切相關(guān)，但由于缺乏相應(yīng)的模式動(dòng)物，目前仍然缺乏ALP 表達(dá)減少是影響正畸牙移動(dòng)的直接體內(nèi)證據(jù)。 本研究通過構(gòu)建Alpl 半敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠， 首次觀察到Alpl 基因半敲除后，小鼠牙齒移動(dòng)受到抑制，為體內(nèi)探討牙齒移動(dòng)和牙槽骨改建的機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因小鼠 B6.129S7-Alpltm1Sor/J （編號：002741），簡稱Alpl 小鼠，購于美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室，4%多聚甲醛（賽馳生物科技有限公司，中國），裂解液（Vigen Biotec 公司，美國），山羊血清（博士德生物工程有限公司， 中國），17%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA，Pulpdent 公 司 ，美國），直徑為0.1 mm 的不銹鋼絲（天天齒科器材有限公司，中國），復(fù)合樹脂（3M 公司，美國），正畸測力計(jì)（天天齒科器材有限公司，中國），鎳鈦螺旋拉簧（北京有研特材科技有限公司，中國），冰凍切片機(jī)（Leica 公司, 德國），HE 染色試劑盒（Leica 公司,德國），ALP 抗體 (Bio-Techne 公司，美國；1∶100)，羊抗小鼠二抗（Jacson 公司，美國；1∶200），Hoechst 細(xì)胞核染料（Med Chem Express 公司，美國），micro-CT掃描及三維重建系統(tǒng)（Siemens 公司，德國），激光共聚焦顯微鏡（Nikon 公司，日本）。 小鼠基因鑒定引物序 列 如 下 ：IMR0137-5′-CCGTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGA-3′ -突 變 型 ；IMR0138-5′ -CTGGCACAAAAGAGTTGGTAAGGCAG-3′-野生型；IMR0139-5′-GATCGGAACGTCAATTAACGTCAAT-3′-通用型。

1.2 方法

1.2.1 Alpl 半敲除小鼠的鑒定 小鼠出生后3～4 周，剪去其趾尖，對小鼠進(jìn)行標(biāo)號和基因型鑒定。 首先加入裂解液， 于56 ℃水浴過夜后對趾尖組織進(jìn)行裂解，12 300 r/min 離心 30 min 后取上清液， 提取DNA 并測定濃度，常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的表達(dá)情況，由于敲除Alpl 基因的純合子小鼠具有胚胎致死性，因此，本實(shí)驗(yàn)選用半敲除的雜合子小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 常規(guī)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測血清中 Alpl 基因在野生組和Alpl 半敲除組中的表達(dá)量差異。 分別取8～10 周野生型小鼠（野生組）和Alpl 半敲除的雜合子小鼠（Alpl 半敲除組）各12 只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育，每日12 h 光照循環(huán)，造模前正常飲食和飲水，造模后每日喂軟食，禁咬硬物。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：SYXK2012-0023）。

1.2.2 構(gòu)建正畸牙移動(dòng)模型 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為野生組和Alpl 半敲除組2 組， 分別建立正畸牙移動(dòng)模型，方法參考本課題組既往報(bào)道[7]。 具體如下：常規(guī)麻醉后將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用自制開口器撐開其上下頜，暴露上頜磨牙，用乙醇棉球充分擦拭小鼠左側(cè)上頜第一磨牙和上頜切牙，將自制加力裝置的一端結(jié)扎并用樹脂粘接固定于左側(cè)上頜第一磨牙， 另一端同樣結(jié)扎并用樹脂固定于上頜切牙，使用正畸測力器測量30 g 拉力。造模后喂軟食，每日檢查加力裝置脫落情況并記錄體重，同時(shí)觀察小鼠飲食和活動(dòng)情況。 加力第7 天取上頜骨，于4%多聚甲醛中固定。

1.2.3 Micro-CT 檢測 應(yīng)用micro-CT 分別對野生組和Alpl 半敲除組小鼠左側(cè)上頜骨進(jìn)行掃描和三維重建。 觀察并比較2 組上頜第一磨牙近中移動(dòng)的距離，根據(jù)前期文獻(xiàn)中的方法[8]，測量咬合面三維重建圖中上頜第一磨牙遠(yuǎn)中邊緣嵴中點(diǎn)到上頜第二磨牙近中邊緣嵴中點(diǎn)之間的距離，每個(gè)樣本重復(fù)測量3 次后取平均值納入統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 HE 染色 樣本脫礦后用石蠟包埋并切片，常規(guī)脫蠟至水后用蘇木素染液染色5 min， 蒸餾水洗凈染液，氨水處理3 s，1%鹽酸乙醇處理1 s 后水洗終止反應(yīng)，加入伊紅染液染色20 s，蒸餾水洗凈染液后將切片過梯度乙醇脫水， 二甲苯中透明10 min，中性樹脂封片。

1.2.5 免疫熒光檢測 樣本脫礦完成后用OCT 包埋液包埋樣本，冰凍切片機(jī)切片。 將切片置于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，以多用途搖床洗3 遍,每次5 min，山羊血清封閉30 min，將ALP 抗體按 1∶100 稀釋后加入， 置 4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜， 第2 天取出后室溫下復(fù)溫30 min，PBS 洗凈一抗，按1∶200 的比例稀釋二抗，避光條件下室溫孵育 1.5 h 后用PBS 洗凈二抗，Hoechst 染液染核20 min，PBS 洗凈后用80%甘油封片。

2 結(jié)果

2.1 成功繁育Alpl 半敲除小鼠

對所繁育的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示：野生型小鼠（野生組）為1 條位于167 bp 的電泳條帶，Alpl 半敲除的雜合子小鼠（Alpl 半敲除組）為雙條帶，分別位于167 bp 和400 bp 處（圖 1A）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室提供的預(yù)測結(jié)果一致，提示本研究成功繁育Alpl 半敲除小鼠。 RT-qPCR 檢測可見，Alpl 基因在 Alpl 半敲除組中的表達(dá)量與野生組相比，顯著下降（圖1B）。 大體觀察發(fā)現(xiàn)，Alpl 半敲除組小鼠體型和活動(dòng)情況與野生組無明顯差別，可進(jìn)行正常繁育，與美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室官網(wǎng)提供的小鼠品系描述一致（圖1C）。

圖1 Alpl 小鼠基因型鑒定Figure 1 Genotyping results of Alpl mice

2.2 構(gòu)建正畸牙移動(dòng)模型

對野生組和Alpl 半敲除組小鼠上頜第一磨牙加力，每日觀察加力裝置固位情況，并記錄小鼠體質(zhì)量。 本研究中，2 組小鼠的加力裝置均固位良好，無脫落（圖2A）。 野生組和Alpl 半敲除組小鼠在正畸加力后進(jìn)食減少，體質(zhì)量在加力后前4 天明顯下降，而后飲食逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量緩慢增加，2 組小鼠體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。

圖2 構(gòu)建正畸牙移動(dòng)模型Figure 2 Establishment of orthodontic tooth movement model

2.3 Alpl 半敲除能抑制正畸牙移動(dòng)

Micro-CT 分別掃描并重建野生組和Alpl 半敲除組小鼠上頜骨，觀察并比較2 組上頜第一磨牙在加力7 d 后的移動(dòng)距離。Micro-CT 三維重建結(jié)果示，2 組上頜第一磨牙均發(fā)生近中移動(dòng)， 提示本研究中的正畸牙移動(dòng)模型構(gòu)建成功（圖3A～D）。 此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，Alpl 半敲除組小鼠上頜第一磨牙近中移動(dòng)距離和野生組相比明顯減少（圖3E），提示Alpl基因半敲除能抑制正畸力作用下的牙齒移動(dòng)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

圖3 Alpl 半敲除后，小鼠正畸牙移動(dòng)受到抑制Figure 3 The orthodontic tooth movement was inhibited after semi-knockout of Alpl

2.4 組織學(xué)觀察

HE 染色觀察野生組和Alpl 半敲除組小鼠上頜第一磨牙的橫切面，2 組小鼠牙根壓力側(cè)均可見牙周膜受擠壓而縮窄，張力側(cè)牙周膜受拉伸而寬度增加。但與野生組相比，Alpl 半敲除組小鼠牙根壓力側(cè)未見大量破骨吸收陷窩，且張力側(cè)細(xì)胞量較少（圖4）。

圖4 組織學(xué)觀察Figure 4 Histological observation

2.5 Alpl 半敲除后，ALP 在正畸牙移動(dòng)中表達(dá)減少

用免疫熒光染色法對Alpl 基因的編碼蛋白ALP 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，野生組小鼠牙根的張力側(cè)和壓力側(cè)均有 ALP 表達(dá)（圖 5A～C，5G），提示ALP 不僅參與張力側(cè)的成骨分化過程，也在壓力側(cè)的骨改建中發(fā)揮作用。而Alpl 半敲除組的牙根壓力側(cè)和張力側(cè)僅可見ALP 的少量表達(dá)（圖5D～F，5H），提示Alpl 半敲除后，ALP 在正畸牙移動(dòng)中表達(dá)顯著降低， 推測Alpl 基因通過其編碼蛋白ALP 影響牙槽骨在正畸力作用下的骨改建，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

圖5 Alpl 半敲除后，ALP 在正畸牙移動(dòng)中的表達(dá)減少Figure 5 ALP expression decreased in the process of orthodontic tooth movement after Alpl semi-knockout

3 討論

正畸牙移動(dòng)的過程是牙周組織在正畸力作用下發(fā)生改建使牙齒向加力方向移動(dòng)的過程，同時(shí)受免疫系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的影響，涉及多種類型細(xì)胞行為學(xué)改變和復(fù)雜分子調(diào)控機(jī)制， 正畸牙移動(dòng)的過程是目前正畸領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1,9-10]。 本研究通過使用體內(nèi)直接半敲除Alpl 基因的小鼠，構(gòu)建小鼠正畸牙移動(dòng)模型，對其觀察并發(fā)現(xiàn)，半敲除Alpl 小鼠在加力7 d 后，正畸牙移動(dòng)距離減?。煌瑫r(shí)，Alpl 編碼蛋白ALP 在牙周組織中的表達(dá)量明顯減少，本研究首次通過體內(nèi)失功能實(shí)驗(yàn)明確了Alpl 基因在正畸力作用下，牙槽骨改建過程中的重要作用。

Alpl 基因是ALP 的編碼基因，轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)展和應(yīng)用使人們對Alpl 基因的認(rèn)識更深了一步[11]。既往研究表明，其編碼的ALP 在胚胎發(fā)育和骨骼形成中發(fā)揮重要作用，Alpl 基因敲除的純合子小鼠具有圍產(chǎn)期致死性，提示ALP 在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。 因此，在相關(guān)研究中常使用能正常繁育的雜合子小鼠， 這種小鼠體內(nèi)ALP 合成減少且活性降低，表現(xiàn)為不同程度的骨骼發(fā)育缺陷[12]，然而，Alpl 基因在正畸領(lǐng)域的研究目前還未見報(bào)道。 本研究中所使用的Alpl 半敲除小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室，該小鼠Alpl 基因啟動(dòng)子后的外顯子被β-半乳糖苷酶和新霉素基因所替代，靶向抑制ALP 的合成，常用于人類Alpl 基因突變導(dǎo)致的低堿磷酯酶癥（Hypophosphatasia, HPP）的相關(guān)細(xì)胞和分子機(jī)制研究[13-14]。由于敲除Alpl 基因的純合子小鼠具有胚胎致死性，因此，本實(shí)驗(yàn)中Alpl 小鼠均為雜合子。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， 雜合子小鼠表現(xiàn)為1 條野生型、1 條突變型的雙電泳條帶。 RT-qPCR 結(jié)果示，Alpl 半敲除組小鼠Alpl 基因表達(dá)量明顯下降，提示Alpl 雜合子小鼠繁育成功，可進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖 1）。

牙周組織是牙齒移動(dòng)的生理基礎(chǔ)， 臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)缺乏完整牙周組織的牙齒不能發(fā)生移動(dòng)。 由于正畸牙移動(dòng)的體內(nèi)條件復(fù)雜，體外無法完全模擬，因此，建立動(dòng)物正畸牙移動(dòng)模型對深刻理解體內(nèi)多因素條件下牙周組織對正畸力的真實(shí)反應(yīng)具有重要意義[3,15]。由于加力裝置的粘接固位需要一定的操作空間，因此，口腔操作空間較大的大鼠和比格犬為常見的模式動(dòng)物， 用于正畸牙移動(dòng)的研究[16]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，從細(xì)胞和分子水平探討組織器官的功能及作用模式成為研究的熱點(diǎn)。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)基因小鼠仍是目前主流的動(dòng)物模型，被廣泛用于分子水平的研究。 而小鼠由于口腔內(nèi)操作空間有限，造模難度大，在正畸領(lǐng)域僅見少量報(bào)道[17]。本課題組前期通過實(shí)驗(yàn)摸索，成功構(gòu)建了小鼠正畸牙移動(dòng)模型，通過物理結(jié)扎和化學(xué)粘接2 種固位方法，大大提高了加力裝置在口內(nèi)的留存率[7]。Micro-CT 結(jié)果（圖 3）顯示，小鼠上頜第一磨牙向近中移動(dòng)；HE 染色結(jié)果（圖4）顯示，壓力側(cè)牙周膜壓縮變窄，張力側(cè)受牽張變寬。 這些結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，提示本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建小鼠正畸牙移動(dòng)模型，為進(jìn)一步觀察牙周組織在加力后的改建情況提供了可靠的基礎(chǔ)。

牙周組織中的干細(xì)胞在響應(yīng)正畸力和參與牙周改建中發(fā)揮了重要作用。 ALP 作為MSCs 向成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典標(biāo)志物， 在成骨細(xì)胞系中表達(dá)，其表達(dá)量的高低可用于評價(jià)MSCs 的成骨分化情況[18]。牙周膜干細(xì)胞 （periodontal ligament stem cells,PDLSCs）為一群來源于牙周膜的MSCs，體外研究中發(fā)現(xiàn)，PDLSCs 在受到張力后，ALP 表達(dá)量升高[19]。在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物正畸牙移動(dòng)模型中，內(nèi)源性ALP 活性檢測常作為牙根張力側(cè)骨形成的檢測指標(biāo)之一[6]。 然而， 目前仍然缺乏Alpl 基因及其編碼蛋白ALP 在正畸牙移動(dòng)中的功能性證據(jù)。由于敲除Alpl 基因的純合子小鼠具有胚胎致死性，因此,本研究中的Alpl小鼠均為雜合子， 盡管未完全消除Alpl 基因的影響，但本研究首次發(fā)現(xiàn)半敲除Alpl 基因可抑制正畸加力7 d 后的牙齒移動(dòng)（圖3），同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)牙周組織中ALP 的表達(dá)量與野生型小鼠相比明顯下降（圖5），推測Alpl 基因通過其編碼蛋白ALP 影響正畸力介導(dǎo)的牙周組織和牙槽骨改建。 由于小鼠磨牙較小，且壓力側(cè)和張力側(cè)細(xì)胞對正畸力的反應(yīng)并不相同，體外準(zhǔn)確提取壓力側(cè)或張力側(cè)牙周組織中細(xì)胞內(nèi)的基因和蛋白并進(jìn)行對比檢測十分困難。 因此，后期仍需引入先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，明確Alpl 基因完全敲除后，牙槽骨改建受到的影響。

綜上所述， 本研究通過使用體內(nèi)直接半敲除Alpl 基因的轉(zhuǎn)基因小鼠， 構(gòu)建正畸牙移動(dòng)模型，通過與野生型小鼠對比，發(fā)現(xiàn)Alpl 半敲除后，小鼠磨牙的移動(dòng)距離減少，牙周組織中編碼蛋白ALP 表達(dá)減少， 推測Alpl 基因在正畸牙移動(dòng)中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探討正畸牙移動(dòng)中的細(xì)胞和分子機(jī)制提供了動(dòng)物模型和理論依據(jù)。