李 陽(yáng)，陳 靜，劉紹東，沈 倩，張思平，葛常偉，劉瑞華， 馬慧娟，萬(wàn)素梅，龐朝友

(1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng) 455000)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花種植面積以及產(chǎn)量均居全國(guó)首位[1]。鹽堿化給新疆的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了挑戰(zhàn)[2]。在棉花種子萌發(fā)及幼苗時(shí)期對(duì)逆境脅迫最為敏感[3]。在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，通過噴施外源調(diào)節(jié)劑等對(duì)棉花幼苗進(jìn)行抗逆鍛煉緩解鹽脅迫的危害尤為重要。【前人研究進(jìn)展】鹽脅迫顯著抑制棉花幼苗的生長(zhǎng)以及干物質(zhì)積累，造成株高生長(zhǎng)緩慢，葉面積以及光合參數(shù)降低[4]。鹽脅迫會(huì)抑制植物進(jìn)行光合作用，一方面是無(wú)機(jī)鹽離子毒害的作用抑制了光合色素的活性；另一方面是過多的無(wú)機(jī)鹽離子影響植物細(xì)胞滲透勢(shì)從而影響光合速率。植物在逆境脅迫下凈光合速率呈下降趨勢(shì)，有機(jī)物合成減少，導(dǎo)致植物無(wú)法正常生長(zhǎng)[5]。褪黑素作為抗氧化劑，既能在植物體內(nèi)自身合成，也能通過施加外源褪黑素達(dá)到增強(qiáng)逆境脅迫抑制的目的[6]。杜天浩[7]研究表明，在鹽脅迫下，施加外源褪黑素能顯著增加番茄幼苗葉綠素的含量。根施外源褪黑素的方式能明顯減緩鹽脅迫對(duì)葡萄幼苗的損傷，并利于葡萄葉片進(jìn)行光合作用[8]。研究表明，外源褪黑素能夠促進(jìn)植物葉片光合相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)葉片光合系統(tǒng)的目的[5]。褪黑素在參與植物葉片進(jìn)行光合作用中發(fā)揮積極影響，通過對(duì)植物葉片光合結(jié)構(gòu)以及PSII合成相關(guān)蛋白的表達(dá)提高光合作用效率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)外源褪黑素能緩解棉花在逆境脅迫下抑制作用的報(bào)道相對(duì)較少，其中陳莉等[9]發(fā)現(xiàn)通過外源褪黑素浸種處理后，20 μmol/L褪黑素處理能提高棉花種子發(fā)芽率，增強(qiáng)棉花種子耐鹽性。袁志剛[10]研究表明，將100 μmol/L褪黑素進(jìn)行灌根處理后，降低NaCl脅迫下棉花葉片中的Na+含量，抑制葉綠素含量的增長(zhǎng)。通過噴施外源褪黑素抵御棉花幼苗在NaCl脅迫下，有關(guān)光合系統(tǒng)如何響應(yīng)的研究尚未報(bào)道。研究外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)及光合特性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用葉面噴施外源褪黑素的方法，研究在NaCl脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)、光合參數(shù)等生理指標(biāo)，分析外源褪黑素對(duì)棉花耐鹽能力的影響，以及外源褪黑素能夠緩解棉花幼苗在鹽脅迫下的生理機(jī)制，為研究棉花耐鹽栽培措施提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試棉花品種為新陸中70號(hào)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所溫室進(jìn)行。挑選顆粒飽滿的棉籽，用0.1% HgCl2消毒處理后清洗4～5次。種于蛭石培養(yǎng)缽，間隔1 d澆等量蒸餾水。待子葉展平，挑選生長(zhǎng)一致幼苗移入含有550 mL 1/4 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的水培盒中。7 d后轉(zhuǎn)為等量1/2 Hoagland水培盒中。待第4片真葉展平時(shí)進(jìn)行NaCl處理，并葉面噴施外源褪黑素。測(cè)定NaCl脅迫下不同時(shí)間段(1、3、6和9 d)棉花幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)、葉綠素含量及熒光、光合參數(shù)等指標(biāo)。

葉面噴施設(shè)置4個(gè)不同褪黑素(MT)濃度處理及2個(gè)對(duì)照處理，分別是：

CK1：0 μmol/L MT+0 mmol/L NaCl；

CK2：0 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T1：25 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T2：50 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T3：100 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T4：200 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 棉花苗期生長(zhǎng)指標(biāo)

噴施等量不同濃度褪黑素處理并在鹽脅迫1、3、6和9 d時(shí)取樣，測(cè)定棉花株高、莖粗、葉面積以及生物量。每個(gè)處理選取5株幼苗測(cè)定。

1.2.2.2 葉綠素含量

稱取棉花主莖葉倒三葉0.2 g，將葉片剪碎放置于20 mL玻璃試管中，加入10 mL 95%酒精并遮光浸泡48 h，在此期間多次搖晃直至葉片完全失綠，用UH5300型分光光度計(jì)(日本日立公司生產(chǎn))在波長(zhǎng)為665、649、470 nm下測(cè)定吸光度，并計(jì)算葉綠素a、葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量。

1.2.2.3 葉片光合作用參數(shù)

采用美國(guó)Li-Cor公司的便攜式光合系統(tǒng)分析儀Li-6400測(cè)定主莖葉凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等參數(shù)。使用閉路式氣路，內(nèi)置光源，并采用鋼瓶控制二氧化碳濃度，設(shè)定CO2濃度為400 μmol/mol，流速為500 μmol/s，光強(qiáng)為1 000 μmol/(m2·s)。環(huán)境溫度控制在25℃，相對(duì)濕度控制在70%左右，每個(gè)處理選取5株幼苗測(cè)定。

1.2.2.4 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)

選取棉花幼苗主莖葉倒三葉，每個(gè)處理測(cè)定5株。將幼苗葉片進(jìn)行暗適應(yīng)20 min后，用Handy-PEA熒光儀(英國(guó)漢莎公司生產(chǎn))測(cè)定葉片暗適應(yīng)初始熒光F0和最大熒光Fm，在600 μmol/(m2·s)作用光下獲取最大熒光(Fm′)和穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)，并開遠(yuǎn)紅光獲得初始熒光(Fo′)。參照Baker等[11]方法計(jì)算Fm、Fo、Fm′、Fs 和 Fo′，獲得PSII反應(yīng)中心實(shí)際光化學(xué)效率(φPSII)，非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)，PSII有效光量子產(chǎn)量(Fv′/Fm′)，光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，用DPS V7.05軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗株高、莖粗和葉面積的影響

研究表明，NaCl(CK2)脅迫會(huì)阻礙棉花幼苗生長(zhǎng)，株高隨著NaCl脅迫時(shí)長(zhǎng)受到顯著抑制，在NaCl脅迫1、3、6和9 d時(shí)與對(duì)照相比分別降低6.7%、14.1%、15.5%和18.0%。噴施不同濃度外源褪黑素處理后，延緩了NaCl脅迫對(duì)株高的影響，其中噴施100 μmol/L褪黑素效果較好。NaCl脅迫1和3 d時(shí)，噴施外源褪黑素處理對(duì)棉花幼苗莖粗和葉面積無(wú)顯著差異；NaCl脅迫6和9 d后，100 μmol/L褪黑素處理與CK2相比幼苗葉面積有顯著差異，分別提高了10.5%和8.1%。表1

表1 外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)特性變化Table 1 Effects of exogenous melatonin on growth characteristics of cotton seedlings under NaCl stress

2.1.2 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗植株干物質(zhì)積累及分配的影響

研究表明，隨著NaCl脅迫時(shí)間的增加，對(duì)棉花幼苗干物質(zhì)積累造成顯著影響。棉花幼苗地上部干重、總干重均呈顯著下降趨勢(shì)。噴施外源褪黑素處理后幼苗地上部干重、總干重均有不同程度的增加，其中噴施100 μmol/L褪黑素處理較好，總干重在鹽脅迫1、3、6和9 d時(shí)，與CK2相比分別提高了25.3%、23.0%、29.3%和53.0%。表1

2.2 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合參數(shù)的影響

2.2.1 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合色素含量的影響

研究表明，NaCl脅迫會(huì)顯著降低幼苗葉片Chla、Chlb和Chla+Chlb的含量，對(duì)Chla/Chlb影響不大，NaCl脅迫處理1 d時(shí)，棉花幼苗葉片Chla、Chlb和Chla+Chlb含量分別下降了24.8%、16.8%和22.3%。隨著NaCl脅迫時(shí)間的增加，葉片光合色素含量各指標(biāo)呈先上升后下降的趨勢(shì)。與CK2相比，NaCl脅迫3和6 d時(shí)，噴施100 μmol/L褪黑素處理顯著提高Chla含量，分別為16.2%和11.1%。表2

表2 外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合色素含量變化Table 2 Effects of exogenous melatonin on photosynthetic pigment content in leaves of cotton seedlings under NaCl stress

2.2.2 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合參數(shù)的影響

研究表明，隨著處理時(shí)間的增加，Pn、Gs、Tr均呈先上升后下降的趨勢(shì)，Ci無(wú)明顯變化。NaCl脅迫會(huì)導(dǎo)致植物凈光合速率下降。與CK1相比NaCl脅迫(CK2)顯著降低棉花幼苗葉片的Pn、Tr、Gs和Ci。噴施外源褪黑素處理后，葉片的光合氣體參數(shù)都有不同程度的增加。其中T3處理緩解效果最好，顯著提高Pn含量。與CK2相比，NaCl脅迫1、3、6和9 d時(shí)，100 μmol/L褪黑素處理下，Pn分別提高了73.4%、49.6%、42.9%和26.4%，Gs分別提高了28.6%、14.3%、31.3%和30.0%，Tr分別提高了17.3%、23.4%、37.7%和19.1%。圖1

注：(Pn)凈光合速率、(Gs)氣孔導(dǎo)度、(Ci)胞間CO2濃度、(Tr)蒸騰速率。同列中不同字母表示在P<0.05水平差異顯著

2.3 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

研究表明，PSII反應(yīng)中心實(shí)際光化學(xué)效率、PSII有效光量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)這4項(xiàng)熒光指標(biāo)在NaCl脅迫下均具有顯著差異。噴施外源褪黑素處理第1 d～第9 d中，φPSII隨著NaCl處理時(shí)間變化，基本保持在0.4～0.6。NaCl脅迫處理第1 d～第9 d中，φPSII呈先上升后下降，均低于CK1處理。噴施外源褪黑素處理提高NaCl脅迫下葉片φPSII，第9 d時(shí)φPSII值最低。Fv′/Fm′同φPSII變化趨于一致。NaCl脅迫下qP低于CK1處理，噴施外源褪黑素處理后，qP趨于平緩上升趨勢(shì)。NaCl脅迫提高NPQ，噴施外源褪黑素處理NPQ下降。圖2

2.4 相關(guān)性分析

研究表明，在處理6 d時(shí)，除了Chla/Chlb指標(biāo)之外，其他指標(biāo)與總干重達(dá)到極顯著相關(guān)性，與凈光合速率和蒸騰速率相關(guān)性較高，達(dá)到極顯著或顯著水平。通過Chla+Chlb含量的變化來(lái)影響光合系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ。表3

3 討 論

3.1 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗生長(zhǎng)的影響

NaCl脅迫嚴(yán)重阻礙棉花幼苗生長(zhǎng)，通過噴施外源褪黑素的方法能有利于減輕NaCl脅迫對(duì)棉花幼苗抑制作用，張娜等[12]研究表明，褪黑素處理能提高狼尾草種子的萌發(fā)能力，減輕了鹽脅迫對(duì)狼尾草幼苗生長(zhǎng)的影響。鹽脅迫下，外源褪黑素能有效增加大豆生物量的積累，緩解大豆株高受到抑制作用，保持幼苗葉片相對(duì)含水率的穩(wěn)定性[13]。試驗(yàn)結(jié)果表明，棉花幼苗的株高、葉面積、干物質(zhì)積累指標(biāo)與CK2相比有顯著性差異。噴施100 μmol/L褪黑素處理，能有效促進(jìn)棉花幼苗株高生長(zhǎng)及生物量增加，噴施外源褪黑素能增強(qiáng)NaCl脅迫下棉花幼苗耐鹽性，減少對(duì)棉花幼苗的傷害。

注：(φPSII)PSII反應(yīng)中心實(shí)際光化學(xué)效率、(Fv'/Fm')PSII有效光量子產(chǎn)量、(qP)光化學(xué)淬滅系數(shù)、(NPQ)非光化學(xué)猝滅系數(shù)。同列中不同字母表示在P<0.05水平差異顯著

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著

3.2 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗光合指標(biāo)的影響

植物遇到逆境時(shí)，植物葉片光合作用會(huì)受到影響，NaCl脅迫下，棉花幼苗光合色素以及光合指標(biāo)顯著降低。鹽脅迫能夠通過氣孔性限制和非氣孔性限制來(lái)調(diào)節(jié)植物的光合作用；同時(shí)也會(huì)影響植物葉綠素的合成，過多的NaCl會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)合成的葉綠素分解，造成葉綠素含量下降[14]。噴施外源褪黑素后，各指標(biāo)均有不同程度的增加。高立楊等[15]研究表明，噴施外源褪黑素可降低鹽堿復(fù)合脅迫下垂絲海棠葉片相對(duì)含水量、葉綠素相對(duì)含量和 Pn、Gs、Tr指標(biāo)的幅度，并具有明顯的濃度效應(yīng)。外施褪黑素能有效降低鹽脅迫下番茄幼苗PSII，減緩葉綠素含量及Pn降低，增強(qiáng)番茄幼苗的耐鹽能力[16]。試驗(yàn)中，NaCl脅迫下，Pn呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)镹aCl脅迫影響了棉花幼苗根系的活力，導(dǎo)致葉片氣孔部分關(guān)閉，Ci也出現(xiàn)下降趨勢(shì)。氣孔限制也是棉花幼苗葉片凈光合速率下降的原因。當(dāng)噴施100 μmol/L褪黑素處理后，Pn、Gs、Ci和葉綠素含量都有所增加，可能是因?yàn)橥屎谒貙?duì)PSII潛在的活性有促進(jìn)作用。褪黑素能有效調(diào)節(jié)NaCl脅迫下棉花幼苗葉片的光合作用，提高NaCl脅迫下棉花幼苗葉綠素的含量，對(duì)棉花幼苗耐鹽性有促進(jìn)作用。

3.3 噴施外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗熒光指標(biāo)的影響

棉花幼苗葉片PSII活性會(huì)受到NaCl脅迫的約束，葉片φPSII、Fv′/Fm′以及qP呈下降趨勢(shì)。φPSII表示PSII反應(yīng)中心實(shí)際光化學(xué)效率，由于碳固定下光合電子合成減少?gòu)亩鴮?dǎo)致φPSII下降，進(jìn)一步說(shuō)明了NaCl脅迫能夠通過非氣孔因素表達(dá)對(duì)植物光合系統(tǒng)的響應(yīng)。qP表示PSII原初電子受體QA的氧化還原狀態(tài)，qP值越大，說(shuō)明PSII電子傳遞的活性較高。

qP下降說(shuō)明了PSII受到損傷后，阻礙了光合電子的傳遞，有效反應(yīng)光下降。Fv′/Fm′下降是因?yàn)楣獠蹲胶鬀]有迅速進(jìn)行光合電子傳遞，直接通過葉綠素的轉(zhuǎn)化消耗光能，同時(shí)導(dǎo)致PSII下降。NPQ是非光化學(xué)淬滅指標(biāo)，反映了葉綠素吸收及轉(zhuǎn)化的過程。干旱脅迫下，外源褪黑素有效增強(qiáng)玉米幼苗葉綠素含量，降低NPQ，防止光合系統(tǒng)受損[17]。研究表明[18]在高鹽脅迫環(huán)境下，PSII反應(yīng)中心實(shí)際光化學(xué)效率也會(huì)受到顯著制約，其功能受到損害。在試驗(yàn)中，NaCl脅迫造成NPQ上升，同時(shí)也是造成PSII、Pn下降的原因。通過葉面噴施100 μmol/L褪黑素，φPSII、Fv′/Fm′以及qP都有不同程度提高，NPQ下降，說(shuō)明了褪黑素能有效提高棉花葉片PSII光化學(xué)效率和光合速率。

4 結(jié) 論

4.1葉面噴施外源褪黑素能延緩NaCl脅迫對(duì)棉花幼苗的損傷，有利于幼苗株高、莖粗以及葉面積的生長(zhǎng)。噴施褪黑素處理，能有效調(diào)控棉花幼苗在NaCl脅迫下生物量的變化。噴施外源褪黑素在NaCl脅迫下幼苗葉片Chlb、Chla/Chlb上無(wú)明顯表現(xiàn)，僅顯著表現(xiàn)在Chla上。外源褪黑素處理能顯著提高棉花幼苗NaCl脅迫下光合作用的能力。NaCl脅迫顯著降低幼苗葉片φPSII和Fv′/Fm′，噴施外源褪黑素能有效緩解Fv′/Fm′持續(xù)下降的趨勢(shì)。

4.2NaCl脅迫下噴施100 μmol/L褪黑素能促進(jìn)棉花幼苗生長(zhǎng)發(fā)育，顯著提高棉花幼苗葉片光合色素含量，有效提高棉花葉片PSII光化學(xué)效率和光合速率，增強(qiáng)棉花幼苗耐鹽能力。