丁允鵬， 陶狄坷， 張 帥， 孫 瑤

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

初級(jí)纖毛是細(xì)胞表面的毛狀感受器，存在于多種細(xì)胞類型中。 目前，初級(jí)纖毛已經(jīng)被證實(shí)能夠感受化學(xué)信號(hào)、機(jī)械力，并且廣泛參與多種組織器官的發(fā)育，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、譜系分化和維持干細(xì)胞干性[1-2]。 初級(jí)纖毛相關(guān)基因突變引起的纖毛病，如 Verma-Naumoff 綜合征、Senior-Loken 綜合征、Meckel-Gruber 綜合征等常出現(xiàn)短指、短肋等長(zhǎng)骨發(fā)育畸形[3-5]。 在小鼠中敲除初級(jí)纖毛相關(guān)基因也會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)骨發(fā)育畸形，如在表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子7（transcription factor 7，Sp7） 的細(xì)胞中敲除纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 80（intraflagellar transport 80，Ift80）會(huì)抑制成骨細(xì)胞分化[6]，在表達(dá) 2 型膠原（collagen 2，COL2）的軟骨細(xì)胞中敲除Ift88 會(huì)導(dǎo)致小鼠四肢短小， 生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)紊亂[7]。 上述研究結(jié)果說(shuō)明，纖毛對(duì)于長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)骨生長(zhǎng)的方式為軟骨內(nèi)成骨，其生長(zhǎng)主要依賴于長(zhǎng)骨中特異性的生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)。 生長(zhǎng)板由軟骨細(xì)胞構(gòu)成，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞沿長(zhǎng)骨長(zhǎng)軸向兩端增殖使長(zhǎng)骨增長(zhǎng)。 按照軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征可以將生長(zhǎng)板分為4 層：靜息層、增殖層、前肥大層和肥大層[8]。已有研究證實(shí),軟骨生長(zhǎng)板中有大量的細(xì)胞纖毛存在[9]，但是初級(jí)纖毛在生長(zhǎng)板各層的分布規(guī)律有待系統(tǒng)研究。 研究軟骨中初級(jí)纖毛分布特點(diǎn)，對(duì)闡釋生長(zhǎng)板發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持具有重要意義。 我們擬通過分析初級(jí)纖毛在1、4、8 周齡小鼠股骨生長(zhǎng)板的分布規(guī)律來(lái)揭示纖毛和生長(zhǎng)板發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 小鼠取材固定和切片

取 1、4、8 周齡野生型 C57BL/6J 小鼠，用 1%戊巴比妥鈉對(duì)其麻醉后使用4%多聚甲醛進(jìn)行體循環(huán)固定， 剔除軟組織后分離雙側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）脫鈣21 d。 脫鈣完成后用清水沖洗 30 min，脫水浸蠟，石蠟包埋。 以 4 μm 的厚度進(jìn)行石蠟切片， 隨后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)和免疫熒光染色。

1.2 甲苯胺藍(lán)染色

將石蠟切片置于65 ℃烘箱60 min， 脫蠟并水化。 甲苯胺藍(lán)染液（Sigma 公司，美國(guó)）室溫孵育30 min，65 ℃烘箱烘干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 免疫熒光染色

用透明質(zhì)酸酶37 ℃抗原修復(fù)60 min， 磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline，PBS） 洗 3 次，0.5%Triton 室溫打孔 10 min，PBS 洗 3 次，1%小牛血清封閉60 min，吸棄血清，按1∶200 的比例稀釋并孵育COL2（博士德生物工程有限公司，中國(guó)），ADP核糖基化因子樣蛋白13b （ADP ribosylation factor like GTPase13b，Arl13b） 或乙?；⒐艿鞍祝╝cetylated tubulin，ACE-tubulin）抗體抗體（Proteintech 公司,美國(guó)），4 ℃孵育過夜，用 PBS 洗 3 次，37 ℃孵育熒光二抗 60 min，PBS 洗 3 次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染，37 ℃孵育 5 min，用 PBS 洗 3 次，用防淬滅封片劑封片。

1.4 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)

取 2 只 1 周齡野生型 C57BL6/J 小鼠雙側(cè)股骨生長(zhǎng)板，吹打洗去表面骨髓組織，將生長(zhǎng)板置于4 mg/mL 的Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司,美國(guó)）中，37 ℃消化 40 min，用 PBS 10 倍稀釋，300×g 離心 10 min，3 mL PBS 重懸，70 μm 濾網(wǎng)過濾， 將過濾所得細(xì)胞懸液接種于60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并記為P0 代，將P1 代用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)

將P1 代軟骨細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板。肥大軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液構(gòu)成：1 nmol/L 地塞米松（Sigma 公司,美國(guó)）；50 μg/mL 抗壞血酸（Sigma 公司，美國(guó)）；100 μg/mL 丙酮酸鈉；1%ITS 添加物（賽業(yè)生物科技有限公司，中國(guó)）；1%雙抗（凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)）；5 mmol/L 甘油磷酸鈉（Sigma 公司，美國(guó)）。

1.6 細(xì)胞免疫熒光染色

4%多聚甲醛于 4 ℃ 下固定細(xì)胞 60 min，用PBS 沖洗 3 次，0.5%Triton×100 室溫打孔 5 min，用PBS 液沖洗 3 次，1%小牛血清室溫封閉 60 min， 按照 1∶200 的比例孵育 COL2，10 型膠原（collagen10，COL10）抗體（博士德生物工程有限公司，中國(guó)），Arl13b 抗體 （Proteintech 公司， 美國(guó)），4 ℃過夜，用PBS 洗 3 次， 孵育二抗，37 ℃孵育 60 min， 用 PBS洗 3 次，DAPI 復(fù)染，37 ℃孵育 5 min， 用 PBS 洗 3 次，將細(xì)胞爬片取出，于載玻片上封片。

1.7 RT-qPCR

用 TRIzol 法（TaKaRa 公司，日本）提取細(xì)胞總RNA，使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR Mix 和LightCycler96（Roche 公司,瑞士）進(jìn)行 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)及分析， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參（引物序列見表 1），通過 2-ΔΔCT法計(jì)算 mRNA 的倍數(shù)變化，并根據(jù)對(duì)照組對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence in RT-qPCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)骨發(fā)育過程中生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞存在初級(jí)纖毛

通過甲苯胺藍(lán)染色，我們發(fā)現(xiàn)小鼠股骨生長(zhǎng)板在其 1、4 周時(shí)較厚，8 周時(shí)， 隨著股骨發(fā)育接近尾聲，股骨生長(zhǎng)板逐漸變?。▓D1A～C）；在所有的時(shí)間點(diǎn)，生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞均存在初級(jí)纖毛（圖1D～J），隨著年齡增長(zhǎng)，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中的纖毛細(xì)胞比例降低。

圖1 長(zhǎng)骨發(fā)育過程中生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞存在初級(jí)纖毛Figure 1 Primary cilia of chondrocyte in femur growth plate of developing mouse

2.2 初級(jí)纖毛主要存在于生長(zhǎng)板靜息層、增殖層和前肥大層

為了進(jìn)一步研究初級(jí)纖毛在生長(zhǎng)板的分布規(guī)律，我們通過免疫熒光染色共同觀察軟骨細(xì)胞標(biāo)志物COL2 和初級(jí)纖毛標(biāo)志物乙?；⒐艿鞍祝ˋCE-tubulin），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初級(jí)纖毛主要分布于靜息層、增殖層和前肥大層，肥大層的肥大軟骨細(xì)胞少有初級(jí)纖毛（圖 2）。

圖2 有纖毛的軟骨細(xì)胞主要存在于靜息層、增殖層和前肥大層Figure 2 Ciliated chondrocytes mainly exist in resting zone, proliferative zone and prehypertrophic zone

2.3 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大化過程中初級(jí)纖毛略減少

為了研究初級(jí)纖毛在軟骨細(xì)胞肥大化中的作用，我們?cè)隗w外培養(yǎng)了軟骨細(xì)胞并誘導(dǎo)其向肥大軟骨細(xì)胞分化，7 d 后， 肥大軟骨細(xì)胞特異性基因COL10、Prg4 表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫熒光顯示大部分細(xì)胞表達(dá) COL10 （圖 3A、B、D、E），肥大軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)7 d后，初級(jí)纖毛細(xì)胞的比例略降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3I）。

圖3 生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞肥大化過程中，初級(jí)纖毛略減少Figure 3 The primary cilia were slightly reduced during growth plate chondrocytes differentiated into hypertrophic chondrocytes

2.4 提高有纖毛細(xì)胞比例伴隨肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)降低

本實(shí)驗(yàn)通過無(wú)血清饑餓軟骨細(xì)胞48 h 阻滯細(xì)胞周期，顯著提升了有纖毛細(xì)胞的比例（圖4A～E），之后進(jìn)行肥大化誘導(dǎo)，7 d 后RT-qPCR 和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)過無(wú)血清饑餓的軟骨細(xì)胞COL10 表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Prg4 的表達(dá)略低于對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4F、G）。

3 討論

長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板有一套維持穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，靜息層的骨骼干細(xì)胞周期性產(chǎn)生軟骨祖細(xì)胞，軟骨祖細(xì)胞向增殖層遷移并快速增殖促進(jìn)長(zhǎng)骨沿長(zhǎng)軸的生長(zhǎng)，增殖層末端的軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化，肥大軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)為骨化提供條件[10-11]。 生理?xiàng)l件下，增殖層軟骨祖細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞維持一定的比例，軟骨祖細(xì)胞提前分化或增殖過度活躍都會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常[12]。 生長(zhǎng)板增殖分化的調(diào)控依賴于印度刺猬因子（indian hedgehog,IHH）-甲狀旁腺激素相關(guān)肽（parathyroid hormone-related peptide,PTHrP）負(fù)反饋機(jī)制，前肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH 通過旁分泌作用促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞的增殖， 靜息層軟骨祖細(xì)胞在IHH 的刺激下分泌PTHrP 抑制軟骨祖細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其向肥大軟骨細(xì)胞分化[13]。這套負(fù)反饋機(jī)制能夠抑制軟骨的過度增殖或者分化，維持生長(zhǎng)板的動(dòng)態(tài)平衡。

Arl13b 是定位在初級(jí)纖毛的小GTP 酶，ACE-tubulin 是初級(jí)纖毛軸絲的組成部分，兩者均是常用的初級(jí)纖毛標(biāo)志物。 通過免疫熒光標(biāo)記Arl13b 和ACE-tubulin，我們發(fā)現(xiàn)在 1、4、8 周齡小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板中都存在初級(jí)纖毛，在1、4 周齡小鼠股骨生長(zhǎng)板中初級(jí)纖毛主要存在于靜息層、增殖層、前肥大層的軟骨細(xì)胞，在分化成熟的肥大軟骨細(xì)胞中則較少觀察到初級(jí)纖毛。 小鼠股骨靜息層和增殖層存在大量有纖毛的軟骨細(xì)胞，與此前報(bào)道的軟骨細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制有關(guān)。 在出生后第9 天，前肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH 能夠促進(jìn)靜息層骨骼干細(xì)胞的產(chǎn)生[14]，同時(shí)IHH 還可以刺激增殖層軟骨細(xì)胞的快速增殖以維持生長(zhǎng)板寬度[15]，而經(jīng)典的IHH-GLI 信號(hào)經(jīng)過初級(jí)纖毛介導(dǎo)。 因此，在軟骨細(xì)胞中敲除初級(jí)纖毛相關(guān)基因常導(dǎo)致生長(zhǎng)板增殖層變短[16]。

初級(jí)纖毛在生長(zhǎng)板增殖層的富集與其調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖相關(guān)，但當(dāng)軟骨細(xì)胞分化為肥大軟骨細(xì)胞后，初級(jí)纖毛會(huì)消失，并且在體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化為肥大軟骨細(xì)胞后， 有纖毛細(xì)胞比例顯著降低，說(shuō)明初級(jí)纖毛可能能夠抑制軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化， 其原因尚不清楚， 這可能與經(jīng)典的Hedgehog-GLI 信號(hào)對(duì)軟骨細(xì)胞的促增殖作用有關(guān)[17-19]。 Hedgehog-GLI 信號(hào)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，而初級(jí)纖毛是介導(dǎo)HH 信號(hào)的關(guān)鍵細(xì)胞器。 向肥大軟骨細(xì)胞分化的過程中，初級(jí)纖毛消失可能能夠抑制軟骨細(xì)胞增殖，為其向肥大軟骨細(xì)胞分化提供條件，所以在軟骨細(xì)胞分化過程中，初級(jí)纖毛會(huì)逐漸減少直至消失。 除此之外，我們發(fā)現(xiàn)有纖毛比例更高的軟骨細(xì)胞經(jīng)過肥大化誘導(dǎo)之后，肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)更低，這也提示初級(jí)纖毛可能對(duì)軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化有抑制作用。 以往的研究認(rèn)為，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖分化受生長(zhǎng)板微環(huán)境中多種因子的調(diào)控[20]，我們通過研究初級(jí)纖毛在生長(zhǎng)板的分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞可能通過解聚初級(jí)纖毛來(lái)抑制IHH 的促增殖作用，促進(jìn)自身向肥大軟骨細(xì)胞分化，為研究生長(zhǎng)板發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持提供了新思路。

綜上所述， 初級(jí)纖毛主要分布在生長(zhǎng)板靜息層、增殖層和前肥大層，分化成熟的肥大層軟骨細(xì)胞初級(jí)纖毛消失。 通過無(wú)血清饑餓法提高有纖毛細(xì)胞的比例后，軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)過程中，肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)降低。