朱 晨，林汝堃，區(qū)炳雄，陳志杰，羅超華，莫志賢，李 璟

(1. 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，2. 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，3. 南方醫(yī)科大學中心實驗室，廣東 廣州 510515)

嗎啡濫用是全球性的公共衛(wèi)生問題，長期使用嗎啡引起的大腦神經(jīng)化學物質(zhì)變化與基因表達改變密切相關(guān)[1]。越來越多的證據(jù)顯示，成癮性物質(zhì)能誘導 miRNAs表達水平的變化，而成癮相關(guān)腦區(qū)中miRNAs表達的改變直接參與了對成癮行為的調(diào)節(jié)[2]。青風藤和鉤藤是中藥戒毒復方的常用藥，結(jié)合本研究團隊前期大量的臨床和基礎研究[3]，選用青風藤和鉤藤的主要生物堿：青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿進行抗嗎啡依賴機制研究。本研究通過建立嗎啡依賴斑馬魚模型，探討青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿抗嗎啡依賴的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑鹽酸嗎啡(解放軍總后勤部藥物供應站，批號：710303)；美沙酮(天津中央藥業(yè)有限公司，批號：020111)；青藤堿(湖南正清制藥集團，批號：20000528)；鉤藤堿(江西佰草源生物科技有限公司，批號：BCY-0246)；異鉤藤堿(江西佰草源生物科技有限公司，批號：BCY-0778)；三卡因甲基磺酸鹽(美國Sigma公司，批號：MS222)。

1.2 主要儀器斑馬魚CPP箱(16 cm×9 cm×9 cm)；Noldus Ethovision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；Agilent 2200 TapeStation(美國Agilent Technologies公司)；ND-1000 Nanodrop(美國Thermo Fisher公司)；Qubit 2.0(美國Life Technologies公司)；Hiseq 2500(美國Illumina公司)；梯度PCR儀(美國ABI公司)；實時定量PCR(美國Roche公司)。

1.3 實驗動物斑馬魚(野生型，雌雄各半，體質(zhì)量約0.35g，6-10個月)由南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選實驗室提供。養(yǎng)魚系統(tǒng)為上海海圣斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(水溫為28 ℃)；魚用鹽水濃度為0.03%-0.04%；pH值為7.2-7.6；光照條件為14 h光照(8 ∶00 am-10 ∶00 pm)，10 h黑夜(10 ∶00 pm-8 ∶00 am)。

2 方法

2.1 條件性位置偏愛(Conditioned place preference，CPP)模型的建立嗎啡依賴斑馬魚條件性位置偏愛模型的建立方法參考本課題組前期文獻報道[4]。CPP實驗共分為3個階段，共持續(xù)9 d。第1階段(d 1-3)為實驗前基線測定，斑馬魚適應性喂養(yǎng)結(jié)束后，將斑馬魚放置在CPP箱中，觀察并記錄其在CPP箱中的運動，剔除對白箱明顯偏愛的斑馬魚(≥95%的斑馬魚天性偏愛黑箱)。第2階段(d 4-8)為正式實驗階段，將符合基線測定的斑馬魚隨機分為6組(n=10)，分別為對照組、模型組(40 mg·kg-1)、美沙酮組(40 mg·kg-1)、青藤堿組(80 mg·kg-1)、鉤藤堿組(100 mg·kg-1)和異鉤藤堿組(100 mg·kg-1)。在d 4、d 6、d 8上午8 ∶00，將斑馬魚麻醉后進行嗎啡腹腔注射，隨后放入CPP箱中的伴藥箱(白箱)中訓練45 min；在d 5、d 7同一時間，將斑馬魚麻醉后進行生理鹽水腹腔注射，隨后放入CPP箱中的偏愛箱(黑箱)中訓練45 min；d 4-8下午8 ∶00，除對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，其余給藥組分別給予各自藥物。第3階段(d 9)即末次給予嗎啡24 h后進行CPP測定，觀察并記錄斑馬魚在CPP箱中的停留時間和運動軌跡，用Noldus Ethovision XT 8.5軟件進行分析。行為學測定結(jié)束后，將斑馬魚冷凍處死，剪下頭部，顯微鏡下取出腦組織，-80 ℃保存。

2.2 小RNA測序根據(jù)TRIzol試劑盒說明書進行總RNA提取，利用ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation進行濃度和純度檢測；通過質(zhì)檢的樣品，以1 μg Total RNA≥50 ng small RNA起始量進行文庫構(gòu)建，主要步驟為：3’adaptor 連接、5’adaptor 連接、第一鏈cDNA合成、PCR擴增、片段大小選擇和文庫質(zhì)檢；通過質(zhì)檢的文庫，按照 HiSeq 2500 User Guide中所述的方法進行上機樣本制備；上機操作如下：使用Single Read Flow Cell，按照HiSeq 2500 User Guide的指示進行HiSeq2500上機操作，并運行single-end(1×50)標準測序程序；測序程序運行完畢，對所得數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。

2.3 qRT-PCR驗證dre-miR-723-5p的表達根據(jù)TaKaRa PrimeScript RT試劑盒和TaKaRa TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行對斑馬魚腦中dre-miR-723-5p含量進行檢測。qRT-PCR實驗均在LightCycler? 96 real time PCR系統(tǒng)上操作。實驗中涉及的基因引物是由廣州瑞博生物科技有限公司設計提供，其中dre-miR-723-5p的引物序列為(上游引物: 5′-GACAGUUUUAAAUGAUGUUACUUU-3′；下游引物: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′)；18S rRNA (上游引物：5′-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3′；下游引物：′-CGGAG GTTCGAAGACGATCA-3′)。

2.4 靶基因預測和生物信息學分析使用三個靶基因數(shù)據(jù)庫(miRanda、PITA和RNAhybrid)對dre-miR-723-5p靶基因進行預測，使用Kobas 3.0對預測的靶基因進行GO和KEGG通路分析。

3 結(jié)果

3.1 青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿可以有效抑制嗎啡依賴引起的斑馬魚行為學變化如Fig 1所示，與對照組相比，模型組斑馬魚在伴藥箱中的停留時間和運動軌跡明顯增加(P<0.01)，提示嗎啡依賴斑馬魚CPP模型成功建立；與模型組相比，美沙酮組、青藤堿組、鉤藤堿和異鉤藤堿組斑馬魚在伴藥箱中的停留時間和運動軌跡明顯減少(P<0.01)，表明給予藥物處理可明顯抑制嗎啡依賴引起的斑馬魚CPP效應，而上述各給藥組間差異無顯著性。

Fig 1 Effects of sinomenine, isorhynchophylline, and rhynchophylline on time spent in drug-pair box and movement track in zebrafish n=10)

3.2 青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿可以改善嗎啡依賴引起的斑馬魚腦中miRNAs的表達變化如Fig 2所示，與對照組相比，模型組中有17個miRNAs的表達明顯下調(diào)，37個miRNAs的表達明顯上調(diào)(Fig 2A)；與模型組相比，美沙酮組中有9個miRNAs的表達明顯下調(diào)，10個miRNAs的表達明顯上調(diào)(Fig 2B)；與模型組相比，青藤堿組中有4個miRNAs的表達明顯下調(diào)，8個miRNAs的表達明顯上調(diào)(Fig 2C)；與模型組相比，鉤藤堿組中有6個miRNAs的表達明顯下調(diào)，8個miRNAs的表達明顯上調(diào)(Fig 2D)；與模型組相比，異鉤藤堿組中有21個miRNAs的表達明顯下調(diào)，14個miRNAs的表達明顯上調(diào)(Fig 2E)。在上述miRNAs中，有5個miRNAs(dre-miR-124-3p, dre-miR-723-5p, dre-miR-1306, dre-miR-2189, 和dre-miR-735-5p)在各組中均存在差異表達(Fig 2F，Tab 1)。

Fig 2 Expression profiles of miRNAs between six groups

Tab 1 Differentially expressed miRNAs in zebrafish brain

3.3 qRT-PCR驗證dre-miR-723-5p的表達為了驗證小RNA測序的結(jié)果，本研究選擇差異表達量最大的dre-miR-723-5p進行qRT-PCR驗證。如Fig 3所示，qRT-PCR結(jié)果與小RNA測序結(jié)果一致(對照組：2-ΔΔct=1；模型組：2-ΔΔct=8.63；美沙酮組：2-ΔΔct=2.53；青藤堿組：2-ΔΔct=2.34；鉤藤堿組：2-ΔΔct=2.72；異鉤藤堿組：2-ΔΔct=2.22)(Fig 3)。

Fig 3 Expression of dre-miR-723-5p confirmed by

3.4 dre-miR-723-5p靶基因預測及靶基因GO和KEGG通路分析如Fig 4所示，3個數(shù)據(jù)庫共同預測dre-miR-723-5p的靶基因為99個(Fig 4A)；GO分析結(jié)果顯示，這些靶基因主要富集在生物過程、細胞組成和分子功能三個方面；KEGG通路分析結(jié)果顯示，這些基因可能與MAPK信號通路、溶酶體、細胞因子受體相互作用和細胞凋亡有關(guān)(Fig 4C)。

Fig 4 GO and KEGG pathway analysis of putative dre-miR-723-5p target genes

4 討論

嗎啡的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果極佳，是臨床上治療疼痛的一線藥物，但其長期使用易導致依賴。CPP常被用于藥物心理依賴性潛力和特征研究。研究表明，將CPP試驗在人體上，受試人與受試動物一樣，給予成癮物質(zhì)后，均表現(xiàn)出對伴藥側(cè)的偏愛，提示機體對藥物的主觀反應與機體產(chǎn)生位置偏愛關(guān)系密切[5]。在本研究中，與對照組相比，斑馬魚腹腔注射嗎啡(40 mg·kg-1)后，經(jīng)過CPP訓練，其在伴藥箱(白箱)中的停留時間和運動軌跡明顯增加，表明嗎啡依賴斑馬魚CPP模型成功建立。與模型組相比，青藤堿組、鉤藤堿組和異鉤藤堿組斑馬魚在伴藥箱中的停留時間和運動軌跡明顯減少，表明青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿可抑制嗎啡引起的斑馬魚CPP效應。

清風膠囊主要用于控制海洛因成癮者的早期戒斷癥狀，青藤堿是清風膠囊的主要活性成分。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以通過調(diào)節(jié)小鼠大腦中TH、NR2B和MOR的表達來逆轉(zhuǎn)嗎啡誘導的獎賞作用[6]，還可以通過NMDAR1/CAMKII/CREB通路在體內(nèi)和體外發(fā)揮對嗎啡依賴性的保護作用[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大葉鉤藤對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗驚厥和神經(jīng)保護作用。本團隊前期研究表明，鉤藤堿可以抑制甲基苯丙胺誘導的小鼠和斑馬魚的CPP行為，并抑制腦中TH蛋白的表達[8]。鉤藤堿可抑制苯丙胺依賴大鼠的CPP效應，并降低伏隔核和杏仁核中NR2B蛋白和NR2B mRNA的表達。此外，鉤藤堿還可以抑制METH誘導的大鼠伏核中GluR2/3亞基蛋白的上調(diào)和下丘腦中GluR2/3亞基蛋白的表達下調(diào)[9]。

近年來研究表明，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，其中包括腦和脊髓這些阿片類藥物的高度活躍區(qū)域[10]。miRNA對于基因表達調(diào)控的十分重要，它們參與了機體多數(shù)生理過程，例如藥物成癮、疼痛感、神經(jīng)元發(fā)育、病毒感染和阿片樣物質(zhì)受體調(diào)控等。研究發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡處理后，人胚胎腎293/μ細胞中的miR-139-5p表達上調(diào)[11]；小鼠背根神經(jīng)節(jié)中miR-375的表達水平明顯下調(diào)，且miR-375的表達水平上調(diào)與嗎啡耐受相關(guān)[12]，表明miRNA參與了阿片類物質(zhì)的成癮。

本研究通過小RNA測序?qū)Π唏R魚腦中miRNA表達譜進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組中的54個miRNAs發(fā)生了明顯變化。與模型組斑馬魚相比，美沙酮組中的19個miRNAs，青藤堿組中的12個miRNAs，鉤藤組中的14個miRNAs和異鉤藤堿組中的35個miRNAs的表達具有明顯差異。經(jīng)過韋恩分析發(fā)現(xiàn)，有5個miRNAs是在各組中均表現(xiàn)出差異表達的，其中兩個在模型組中的表達明顯上調(diào)(dre-miR-124-3p、dre-miR-723-5p)，在經(jīng)過藥物美沙酮、青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿治療后明顯下調(diào)；三個在模型組中的表達明顯下調(diào)(dre-miR-1306、dre-miR-2189、dre-miR-735-5p)，經(jīng)過藥物治療后均明顯上調(diào)。dre-miR-723-5p是其中差異表達量最大的miRNA?；诖耍狙芯客ㄟ^qRT-PCR驗證其在斑馬魚腦中的表達，該結(jié)果與測序結(jié)果相吻合。目前，關(guān)于dre-miR-723-5p的研究很少，本實驗發(fā)現(xiàn)并驗證dre-miR-723-5p在嗎啡依賴斑馬魚腦中的差異表達，為嗎啡依賴研究提供了新的方向。

為了進一步了解dre-miR-723-5p的生物學功能，本研究通過靶基因預測數(shù)據(jù)庫(PITA、miRDB、RNAhybrid)對dre-miR-723-5p進行靶基因的預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了99個潛在靶基因，包括生物過程、細胞組成及分子功能三個部分，涵蓋了調(diào)節(jié)對外部刺激的反應、正面調(diào)節(jié)軸突再生、囊泡與高爾基體融合和高爾基空泡運輸?shù)确矫?。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要涉及了MAPK信號通路、溶酶體、細胞因子受體相互作用和細胞凋亡。研究證實，MAPK信號通路介導神經(jīng)可塑性的變化，并參與外周和中樞的疼痛調(diào)節(jié)。對促進神經(jīng)元進程和大腦保護具有顯著的積極調(diào)節(jié)作用[13]。溶酶體途徑是神經(jīng)元存活許多方面的常見紐帶之一，其功能障礙主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老有關(guān)。溶酶體形態(tài)和功能障礙被認為是阿爾茨海默病的最早病理改變[14]。在海洛因成癮大鼠的大腦中廣泛存在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞凋亡的現(xiàn)象[15]，且長期使用嗎啡可導致大鼠海馬細胞凋亡程度的異常增加[14]。KEGG通路分析結(jié)果表明，dre-miR-723-5p靶基因與腦部疾病和藥物成癮密切有關(guān)。

綜上，嗎啡依賴斑馬魚腦中miRNA表達譜及中藥活性成分青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿的作用，并對相關(guān)miRNA進行驗證、靶基因預測、GO分析和KEGG通路分析。在miRNA水平上揭示了青藤堿、鉤藤堿和異鉤藤堿抗嗎啡依賴的分子機制，這可能為中藥抗阿片類藥物依賴研究提供新思路。