周佳琪 魏 杰 王 洪 劉甦蘇 光姣娜 熊 芮 王辰飛 范昌發(fā) 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

清道夫受體B2蛋白(SCARB2)又稱為2型溶酶體整合膜蛋白(lysosomal integral membrane protein type 2，LIMP2)，是一種溶酶體膜糖蛋白，屬于B族清道夫受體家族，分布于人體大多數(shù)組織，主要參與膜泡運(yùn)輸及溶酶體成熟過程，也可作為EV71和CVA16的受體導(dǎo)致兒童患手足口病[1-3]。近年來，手足口病作為小兒急性傳染病嚴(yán)重威脅兒童的健康，腸道病毒中的 EV71 和 CVA16為手足口主要的病毒型別，感染者嚴(yán)重可以危害生命[4]。由于hSCARB2基因可以在小鼠的肌肉和腦組織中高表達(dá)，促進(jìn)病毒對小鼠的感染和復(fù)制能力[5]。因此，對R26-hSCARB2小鼠的研究是認(rèn)識與研究兒童手足口病的模型基礎(chǔ)。

在一定范圍內(nèi)波動的血液生理生化指標(biāo)是每種實(shí)驗(yàn)動物特有的生物學(xué)指標(biāo)，這些指標(biāo)可以反映動物的生理狀態(tài)和健康狀態(tài)，可以為病理學(xué)、毒理學(xué)、探討發(fā)病機(jī)理等研究選擇合格的實(shí)驗(yàn)動物提供參考[6-8]。

目前，對于R26-hSCARB2小鼠的生理生化等部分生物學(xué)特性未有相關(guān)報道，本研究通過對不同周齡和性別的R26-hSCARB2小鼠的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，為深入研究該小鼠提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及處理

取4周齡和8周齡的R26-hSCARB2小鼠各20只，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量分別為：4周齡(15.14±0.93)g，8周齡(20.43±0.85)g，均來自本單位實(shí)驗(yàn)動物資源研究所，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2017-0005。利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)將同源重組產(chǎn)生的靶向載體導(dǎo)入C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞的rosa26位點(diǎn)，在屏障環(huán)境中完成囊胚顯微注射、胚胎移植等操作，PCR檢測陽性即為陽性轉(zhuǎn)基因鼠。4周齡和8周齡R26-hSCARB2小鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，環(huán)境設(shè)施合格證：SYXK(京)2017-0013。

空腹12 h后的小鼠，采集靜脈血加入稀釋液后用來測定生理指標(biāo)，取全血分離血清后用來測定生化指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)和相關(guān)操作均按照實(shí)驗(yàn)動物福利倫理“3R”原則規(guī)程進(jìn)行，并由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審批[中檢動(福)第(B)021號]。

1.2 主要儀器

日本光電Mek7222血細(xì)胞分析儀；奧林巴斯AU400全自動生化分析儀。

1.3 試劑

檢測生理指標(biāo)所用的試劑、稀釋液和溶血劑購自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司；檢測生化指標(biāo)所用的試劑購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

采用日本光電Mek-7222血球分析儀測定嗜堿性粒細(xì)胞絕對值(BAS)、嗜堿性粒細(xì)胞百分率(BAS%)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對值(EOS)、嗜酸性粒細(xì)胞百分率(EOS%)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血紅蛋白濃度(HGB)、淋巴細(xì)胞絕對值(LYM)、淋巴細(xì)胞百分率(LYM%)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、單核細(xì)胞絕對值(MON)、單核細(xì)胞百分率(MON%)、平均血小板體積(MPV)、中性粒細(xì)胞絕對值(NEUT)、中性粒細(xì)胞百分率(NEUT%)、血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)，共計(jì)22項(xiàng)血液生理指標(biāo)。

采用奧林巴斯AU400全自動生化分析儀測定白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素(BUN)、鈣(Ca)、總膽固醇(CHO)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、磷(P)、甘油三酯(TG)和總蛋白(TP)，共計(jì)12項(xiàng)血液生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 比較不同性別的4周齡R26-hSCARB2小鼠血液生理生化指標(biāo)

在測定的22項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)中，不同性別的4周齡R26-hSCARB2小鼠WBC具有極顯著差異(P<0.01)，LYM和NEUT%指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)，其余生理指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1所列。

表1 不同性別的4周齡R26-hSCARB2小鼠的血液生理指標(biāo)Table 1 Blood physiological values of 4-week-old R26-hSCARB2 mice in different genders

在測定的12項(xiàng)生化指標(biāo)中，CHO和TG具有極顯著差異(P<0.01)，BUN具有顯著差異(P<0.05)，其余生化指標(biāo)差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2所列。

表2 不同性別的4周齡R26-hSCARB2小鼠的血清生化指標(biāo)Table 2 Serum biochemical values of 4-week-old R26-hSCARB2 mice in different genders

2.2 比較不同性別的 8 周齡R26-hSCARB2小鼠血液生理生化指標(biāo)

在測定的22項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)中，不同性別的8周齡R26-hSCARB2小鼠有BAS%、LYM、MON%及WBC指標(biāo),具有極顯著差異(P<0.01)，EOS%、NEUT、PDW及PLT指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3所列。在測定的12項(xiàng)生化指標(biāo)中，CHO、P及TP 指標(biāo)具有極顯著差異(P<0.01)，ALB、ALP、GLU及TG指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4所列。

表3 不同性別的8周齡R26-hSCARB2小鼠的血液生理指標(biāo)Table 3 Blood physiological values of 8-week-old R26-hSCARB2 mice in different genders

表4 不同性別的8周齡R26-hSCARB2小鼠的血清生化指標(biāo)Table 4 Serum biochemical values of 8-week-old R26-hSCARB2 mice in different genders

2.3 比較不同周齡的R26-hSCARB2小鼠之間的生理生化指標(biāo)

在測定的4周和8周齡R26-hSCARB2小鼠的22項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)中，LYM、LYM%、MON、MON%、PLT、RDW及WBC具有極顯著差異(P<0.01)，MPV、NEUT、NEUT%及PCT共4項(xiàng)指標(biāo)具有顯著差異(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5所列。

表5 不同周齡的R26-hSCARB2小鼠的血液生理指標(biāo)Table 5 Blood physiological values of R26-hSCARB2 mice in different ages

在測定的4周和8周齡R26-hSCARB2小鼠的12項(xiàng)生化指標(biāo)中， ALB、ALP、ALT、AST、BUN、Ca、CHO、CREA、GLU、P、TG及TP共 12項(xiàng)生化指標(biāo)均具有極顯著差異(P<0.01)，見表6所列。

表6 不同周齡的R26-hSCARB2小鼠的血清生化指標(biāo)Table 6 Serum biochemical values of R26-hSCARB2 mice in different ages

3 討論

3.1 性別對于R26-hSCARB2小鼠的影響

在測定的4周齡R26-hSCARB2小鼠，22項(xiàng)生理指標(biāo)中，LYM、NEUT%及WBC指標(biāo)上存在顯著差異，且均為雌性指標(biāo)高于雄性；8周齡R26-hSCARB2小鼠BAS%、EOS%、LYM、MON%、NEUT、PDW、PLT及WBC共計(jì)8項(xiàng)指標(biāo)上存在顯著差異，其中EOS%、LYM、NEUT、PDW及WBC這5項(xiàng)指標(biāo)為雌性高于雄性，BAS%和MON%指標(biāo)為雄性高于雌性。

在測定的12項(xiàng)生化指標(biāo)中，4周齡R26-hSCARB2小鼠BUN、CHO及TG指標(biāo)上存在顯著差異，且CHO和TG指標(biāo)均為雄性含量高于雌性，BUN含量則是雌性高于雄性； 8周齡R26-hSCARB2小鼠ALB、ALP、CHO、GLU、P、TG及TP共計(jì)7項(xiàng)指標(biāo)存在顯著差異，其中ALP為雌性高于雄性，TP、ALB、GLU、P、CHO及TG均為雄性高于雌性。4周齡和8周齡的R26-hSCARB2小鼠的CHO和TG水平均為雄性高于雌性，在未進(jìn)行基因改造的C57BL/6小鼠與中青年男女中也有同樣的結(jié)果[9-10]，說明性別可能會影響生物的激素水平。

3.2 年齡對與R26-hSCARB2小鼠的影響

4周齡和8周齡R26-hSCARB2小鼠在測定的22項(xiàng)生理指標(biāo)中， LYM、LYM%、MON、MON%、MPV、NEUT、NEUT%、PLT、PCT、RDW及WBC共計(jì)11項(xiàng)指標(biāo)存在顯著或極顯著差異。由此可見，不同周齡的R26-hSCARB2小鼠在血小板、白細(xì)胞等白細(xì)胞亞群方面具有顯著差異，除嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞外，其他白細(xì)胞亞群均具有顯著差異，說明隨著周齡的增加，R26-hSCARB2小鼠的免疫水平有相應(yīng)的改變。

測定的12項(xiàng)生化指標(biāo)在不同周齡小鼠間全部具有極顯著差異，均為8周齡含量高于4周齡的含量，反映出周齡對R26-hSCARB2小鼠的肝功能、脂代謝和內(nèi)分泌功能上有較大影響。

3.3 對于R26-hSCARB2小鼠的選擇

小鼠為生物醫(yī)學(xué)研究做出了十分突出的貢獻(xiàn)，因?yàn)樗鼈兪悄壳芭嘤废底疃?、用量最大且?biāo)準(zhǔn)化程度較高的實(shí)驗(yàn)動物[11]。血液生理生化指標(biāo)可以反映動物的新陳代謝及生理功能狀況，能夠衡量動物是否健康以及遺傳是否穩(wěn)定，也可以作為臨床疾病診斷的依據(jù)，對科學(xué)研究具有重要的參考價值[12]。在進(jìn)行相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)的時候，要充分考慮品種、品系、性別、周齡等因素對實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)生物學(xué)指標(biāo)的影響，同時也要考慮到這些因素所產(chǎn)生的影響的大小[13-14]。

本研究檢測了R26-hSCARB2小鼠的血液生理生化指標(biāo)，分析了性別和周齡對于該小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)性別和周齡都會影響該小鼠的血液生理生化指標(biāo)，小鼠周齡對血液生理生化指標(biāo)存在較大影響，可以為R26-hSCARB2小鼠的應(yīng)用研究提供一定的參考。