任元靜，強(qiáng)家旭，陳 卉，宋 巍

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

膽管癌屬于一種消化道的惡性腫瘤疾病，包括肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)。由于其特殊的位置易于侵犯肝門(mén)部的肝組織、血管、神經(jīng)及淋巴組織，以至于根治性手術(shù)難度相當(dāng)大，手術(shù)切除率低，愈后較差。不幸的是，膽管癌的總體發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，這嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。相關(guān)研究報(bào)道，大多數(shù)膽管癌患者是在癌癥晚期診斷出的，接受切除和移植并不能改善治療效果，但仍是獲得長(zhǎng)期生存率和治愈的唯一可能性手段[3]。對(duì)于晚期無(wú)法手術(shù)的患者可以通過(guò)藥物輔助性治療來(lái)達(dá)到手術(shù)治療的最低要求。針對(duì)一條通路或單一靶點(diǎn)的藥物在治療初期療效常常很好，但隨后往往由于腫瘤細(xì)胞通過(guò)其他的通路逃避藥物治療，而導(dǎo)致療效顯著下降。多靶點(diǎn)藥物和組合治療策略目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱門(mén)領(lǐng)域[4]。多數(shù)化療藥物對(duì)于晚期癌癥患者的治療所獲得的生存率不佳，而且化療常常使人體產(chǎn)生耐藥性和副作用，故尋找出高敏感、低毒副作用的膽管癌治療藥物是十分必要的。本文通過(guò)對(duì)多種傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行篩選以及對(duì)其聯(lián)合作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而為抗膽管癌的聯(lián)合用藥方案和治療提供新的思路。

1 方法

1.1 藥物與試劑

RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；MTT購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；胰酶和青-鏈霉素溶液購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；大血屯、升麻、蘇木、枟香、黃連、土槿皮、連翹、黃柏等多種藥用植物根莖葉購(gòu)自張仲景大藥房。

1.2 中草藥提取

利用分體式全自動(dòng)微電腦陶瓷壺將200 g中藥和2 L純凈水混合液熬至150 mL的藥液。接著將藥液用冷凍干燥機(jī)干燥脫水研碎。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

人膽管癌細(xì)胞QBC-939為本實(shí)驗(yàn)室保存。QBC-939接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將提取粉末溶于超純水配制成100 mg/mL母液，過(guò)濾除菌后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將QBC-939細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔板；待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用含有不同濃度的藥物培養(yǎng)液代替初始培養(yǎng)液繼續(xù)放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；接著向每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h；最后，棄去上述培養(yǎng)液加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)混勻后于490 nm處檢測(cè)吸光值(OD值)。兩兩聯(lián)合藥物培養(yǎng)液濃度比例為11(聯(lián)合藥物終濃度為25、50、100、200、300、400 μg/mL)。每個(gè)藥物試驗(yàn)至少重復(fù)三次。

1.5 中值效應(yīng)分析

通過(guò)以相應(yīng)藥物的IC50為基礎(chǔ)，增加聯(lián)合使用的藥物總劑量，通過(guò)MTT試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的存活率。根據(jù)Chou-Talalay中效原理，由Compusyn軟件計(jì)算藥物聯(lián)合指數(shù)CI(combination index)[5-6]以及劑量減少指數(shù)DRI(drug reduction index)。DRI是衡量相同的藥物作用水平下，協(xié)同使用相比單獨(dú)使用每種藥物時(shí)，劑量減少倍數(shù)的指數(shù)。DRI值越大意味著相同治療效果下，聯(lián)合相比于單味藥減少的越多，但不一定是協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 多種單藥對(duì)QBC-939細(xì)胞的抑制作用

聯(lián)合指數(shù)計(jì)算須基于聯(lián)合藥物各濃度的抑制率，故通過(guò)設(shè)置較長(zhǎng)濃度區(qū)間，初步確定8種單藥在不同濃度下的抑制效果并由此確定各種單藥的IC50值。分別使用不同濃度(5、25、50、100、200、400 μg/mL)的單藥處理膽管癌QBC-939細(xì)胞24 h，之后檢測(cè)細(xì)胞存活率，得到各種中藥分別對(duì)膽管癌細(xì)胞QBC-939的半數(shù)抑制濃度IC50值，如圖1所示。其中，蘇木(IC50= 91.63±23.27 μg/mL)、升麻(IC50= 91.5±31.76 μg/mL)、大血屯(IC50= 61.73±58.70 μg/mL)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的抑制作用較好，即較低的IC50值。其他單中藥IC50值如表1所示。

圖1 8種中藥的IC50值

表1 8種中藥對(duì)QBC-939細(xì)胞的抑制作用

2.2 聯(lián)合中藥的協(xié)同作用

由8種中藥兩兩組合，共28種組合。通過(guò)MTT法從28種組合中篩選出對(duì)膽管癌細(xì)胞QBC-939有顯著抑制作用的6種組合：黃連-蘇木、黃連-黃柏、蘇木-黃柏、連翹-升麻、枟香-連翹和枟香-升麻。6種中藥組合的濃度-抑制率成梯度關(guān)系(見(jiàn)圖2(a)、圖2(b))。其中黃連-蘇木、黃連-黃柏、蘇木-黃柏、連翹-升麻、枟香-連翹5種組合呈協(xié)同作用，枟香-升麻呈拮抗作用，如圖3、圖4、圖5和表2所示。同時(shí)，通過(guò)比較每種中藥組合在相同抑制率水平時(shí)，聯(lián)合使用兩種藥物的濃度與該兩種藥物單獨(dú)使用的濃度，可得到藥物的濃度減少倍數(shù)，即DRI劑量減少指數(shù)，見(jiàn)表3。

(a) (b)

由表2、表3和圖3可知：黃連-黃柏組合在25%抑制率時(shí)，聯(lián)合黃柏使用的黃連濃度相比單獨(dú)使用的黃連濃度減少2.258 3倍，即DRI=3.029 3；同時(shí)，聯(lián)合使用的黃柏濃度減少3.029 3倍，并且黃柏濃度隨著抑制率增加而顯著減少；當(dāng)抑制率達(dá)到90%時(shí)，黃柏濃度減少1 154.08倍。由于聯(lián)合用藥濃度相比單獨(dú)用藥濃度顯著減少，所以黃連-黃柏組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。當(dāng)蘇木-黃柏組合在高抑制率區(qū)間時(shí)，聯(lián)合使用的蘇木與黃柏的濃度相比較兩種藥物單獨(dú)使用的濃度顯著減少，在75%～90%抑制率區(qū)間時(shí)，蘇木濃度減少2.301 9～3.819倍；黃柏濃度減少457.023～4 935.35倍，因此黃連-蘇木組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。

圖3 黃連-黃柏、蘇木-黃柏藥物組合的聯(lián)合曲線

由表2、表3和圖4可以發(fā)現(xiàn)：當(dāng)黃連-蘇木組合在高抑制率區(qū)間，聯(lián)合使用的黃連與蘇木的濃度相比較藥物單獨(dú)使用的濃度顯著減少，當(dāng)75%～90%抑制率時(shí)，黃連濃度減少7.845 6～10.013 8倍；蘇木濃度減少2.824 1～4.042 1倍，因此黃連-蘇木組合表現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)。同時(shí)，枟香-連翹組合僅在0%～25%低抑制率區(qū)間，表現(xiàn)出強(qiáng)協(xié)同作用(CI<0.5)，聯(lián)合使用的枟香與連翹的濃度相比較單獨(dú)使用的濃度減少。但在75%～90%高濃度區(qū)間，枟香-連翹組合表現(xiàn)拮抗作用(CI>1)。

圖4 枟香-連翹、黃連-蘇木藥物組合的聯(lián)合曲線

由表2、表3和圖5可知：枟香-升麻組合在不同抑制率時(shí)，聯(lián)合使用的枟香與升麻的濃度相比較單獨(dú)使用的濃度都沒(méi)有顯著降低。因此，枟香與升麻呈拮抗作用(CI>1)。另一方面，連翹-升麻組合僅在75%～90%高抑制率區(qū)間表現(xiàn)出協(xié)同作用(CI<1)，聯(lián)合使用的連翹與升麻濃度相比較單獨(dú)使用的濃度分別減少5.622～5.062 9倍和1.324 5～3.068 6倍。

圖5 枟香-升麻、連翹-升麻藥物組合的聯(lián)合曲線

表2 藥物組合在不同抑制率中的聯(lián)合指數(shù)CI

表3 藥物組合在不同組合中的劑量減少指數(shù)DRI

3 討論

傳統(tǒng)中草藥以天然藥物治療疾病在我國(guó)有著悠久的歷史，其活性更多地依賴于多種成分的組合，而不僅僅是其中單一的某種成分。許多中草藥可以通過(guò)靶向腫瘤發(fā)生過(guò)程中的多個(gè)步驟，能夠抑制腫瘤的發(fā)展，它既具有阻滯劑，抑制腫瘤起始發(fā)生的作用，又具有抑制腫瘤發(fā)展過(guò)程中惡性細(xì)胞增殖的作用[7-9]。中藥聯(lián)合化療藥物還可以降低化療藥物帶來(lái)的副作用，提高治療效果[10-12]。滕文靜等，在溫陽(yáng)散寒中藥抗肺癌的研究中，基于溫陽(yáng)扶正抗癌的理論，通過(guò)收集文獻(xiàn)報(bào)道以溫陽(yáng)法治療惡性腫瘤最有效的五味中藥進(jìn)行體內(nèi)Lewis小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中藥中的生物堿類成分蓽茇明堿具有明顯地抑瘤作用[13]。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究試圖從中國(guó)傳統(tǒng)的中草藥中尋找具有抗腫瘤的藥物。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較人膽管癌QBC-939細(xì)胞對(duì)31種中草藥的敏感性，從中篩選得到大血屯、升麻、蘇木、枟香、黃連、土槿皮、連翹、黃柏8種具有抑制膽管癌細(xì)胞增殖效果的藥物。

中藥復(fù)方在抗腫瘤方面的研究是近年來(lái)的熱點(diǎn)，單一藥物成分有時(shí)容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性、抵抗性，從而表現(xiàn)出較低的抑制效果。左金丸是一個(gè)典型的中藥復(fù)方，由黃連和吳茱萸以61比例組成。黃連中的主要成分有逆轉(zhuǎn)MDR的效果，吳茱萸可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。左金丸在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性結(jié)直腸癌。左金丸可以增加結(jié)腸癌 HCT116/L-OHP細(xì)胞、胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞和肝癌 Bel/Fu MDR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[14]。表明中藥與化療藥物的聯(lián)合使用在抗腫瘤增殖方面具有潛能。本研究通過(guò)檢測(cè)由8種中藥組成的28種中藥組合對(duì)膽管癌細(xì)胞QBC-939的增殖抑制作用發(fā)現(xiàn)：黃連-蘇木，黃連-黃柏，蘇木-黃柏，枟香-連翹和連翹-升麻5種藥物組合在抑制膽管癌增殖過(guò)程中具有協(xié)同效應(yīng)。表明聯(lián)合中藥相對(duì)于單藥使用具有更好的抗腫瘤增殖效果，中藥組合具有體外抗膽管癌細(xì)胞QBC-939的作用，能夠?yàn)槟懝馨┑呐R床治療提供一定理論基礎(chǔ)。