方木通 蘇優(yōu)峰 毛智 張宏義 曾劍鋒 曾堅 曹煒鵬 王仲元

耐多藥或利福平耐藥結(jié)核病(multidrug-/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)因治療費用昂貴、藥物不良反應(yīng)大、治療效果欠佳，已越來越受到重視[1]。約80%的RR-TB 患者同時并發(fā)異煙肼耐藥，目前臨床采用的早期抗結(jié)核治療原則基本同MDR-TB。但由于早期治療方案缺乏其他藥物的表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果支撐，一旦這些藥物已發(fā)生耐藥，則會明顯影響其治療效果及預(yù)后[2-3]。因此，為進一步了解RR-TB患者對其他抗結(jié)核藥物的耐藥情況，筆者對利福平耐藥肺結(jié)核(RR-PTB)患者的表型藥敏試驗結(jié)果進行分析，為制定科學(xué)有效的治療方案提供參考。

對象和方法

一、研究對象

采用回顧性研究的方法，搜集深圳市第三人民醫(yī)院2015年1月至2020年12月346例RR-PTB患者作為研究對象，共分離346株結(jié)核分枝桿菌，其中，初、復(fù)治患者分離株分別為142株(41.04%)和204株(58.96%)。分析菌株對10種抗結(jié)核藥品[利福平(RFP)、異煙肼(INH)、鏈霉素(Sm)、利福布汀(Rfb)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)、對氨基水楊酸(PAS)、阿米卡星(Am)、丙硫異煙胺(Pto)、卷曲霉素(Cm)]的表型藥敏試驗情況及耐藥類型。所有菌株均來自GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測鑒定為結(jié)核分枝桿菌，并對RFP耐藥的530株菌株，耐藥率為11.16%(530/4750)。

二、研究方法

1.診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)初治RR-PTB患者(初始耐藥)：指初次發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核且未接受抗結(jié)核藥物治療，或不規(guī)則抗結(jié)核治療療程<1個月的患者，2次Xpert檢測痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALF)均提示RFP耐藥(A～E片段至少1個片段突變)。(2)復(fù)治RR-PTB患者(獲得性耐藥)：指不規(guī)則抗結(jié)核治療≥1個月，或初治失敗和復(fù)發(fā)的患者，至少1次Xpert檢測痰液或BALF提示為RFP耐藥。

2.Xpert檢測[5]：取1 ml痰液或BALF標(biāo)本，加入2 ml標(biāo)本處理液，渦旋儀振蕩混勻，靜置15 min后吸取2 ml液化標(biāo)本于反應(yīng)盒內(nèi)，將加好標(biāo)本的反應(yīng)試劑盒加入反應(yīng)儀內(nèi)，自動檢測，反應(yīng)結(jié)束后直接讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：依照探針循環(huán)閾值(Ct值)進行結(jié)核分枝桿菌判讀，當(dāng)內(nèi)對照探針Ct值≤38判定為結(jié)核分枝桿菌陽性。其中，Ct值<16為結(jié)核分枝桿菌高含量，Ct值介于16～22之間為中含量，Ct值介于22～28之間為低含量，Ct值>28為極低含量。當(dāng)A～E片段中至少1個片段發(fā)生突變，則判斷為RFP耐藥。

3.BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)[6]：吸取1 ml痰液或BALF標(biāo)本加入到50 ml圓底離心管內(nèi)，加入2 ml前處理液，渦旋儀振蕩消化15 min，加入40 ml 磷酸鹽緩沖液(PBS)中和離心(3000×g，離心18 min)，棄上清，加入1 ml PBS重懸沉淀，取0.1 ml接種至培養(yǎng)管內(nèi)，設(shè)定培養(yǎng)陰性結(jié)果報告時間為≥42 d，儀器自動報告陽性后取培養(yǎng)液涂片鏡檢，若檢出抗酸桿菌則為陽性，若未見抗酸桿菌則為陰性。

4.表型藥敏試驗：參照文獻[7]采用絕對濃度法，以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(由中國藥品生物制品檢定所提供)進行質(zhì)控監(jiān)測，以空白培養(yǎng)基為空白對照，以含藥羅氏管為陰性對照管。10種抗結(jié)核藥品及其低、高藥物試驗濃度分別為RFP(50、250 mg/L)、INH(1、10 mg/L)、EMB(5、50 mg/L)、Sm(10、100 mg/L)、Rfb(25、100 mg/L)、Lfx(5、50 mg/L)、PAS(1、10 mg/L)、Am(10、100 mg/L)、Pto(25、100 mg/L)、Cm(10、100 mg/L)。結(jié)果判定：含藥培養(yǎng)基生長菌落數(shù)>20個，判定為耐藥。本研究所列出的“耐藥數(shù)據(jù)”均包括低、高濃度耐藥。

5.同一例患者多次相同檢驗項目的處理方法：如同一例患者有多次相同的檢驗項目，則只納入1次陽性檢驗結(jié)果，且進行表型藥敏試驗和Xpert檢測的標(biāo)本留取時間相差不超過1個月。如出現(xiàn)表型藥敏試驗結(jié)果不一致時，則以RFP耐藥的表型藥敏試驗結(jié)果為準(zhǔn)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Prism 5.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RFP耐藥分離株對10種抗結(jié)核藥品的耐藥情況

表型藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株對10種藥品的耐藥率由高至低依次為RFP(95.95%)、INH(84.68%)、Sm(58.38%)、Rfb(57.23%)、EMB(50.29%)、Lfx(34.39%)、PAS(11.85%)、Am(10.69%)、Pto(5.78%)、Cm(5.20%)。復(fù)治患者分離株對INH、Lfx、EMB、Am的耐藥率均明顯高于初治患者分離株，見表1。

二、基于表型藥敏試驗結(jié)果的耐藥類型

346株RFP耐藥分離株RFP單耐藥率(INH敏感)為15.32%，耐多藥率為84.68%，含Lfx耐藥的準(zhǔn)廣泛耐藥率為26.30%，含二線注射劑耐藥的準(zhǔn)廣泛耐藥率為5.20%，廣泛耐藥率為6.65%。復(fù)治患者分離株的耐多藥率、準(zhǔn)廣泛耐藥率均明顯高于初治患者分離株，但RFP單耐藥率明顯低于初治患者分離株，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，見表2。

討 論

Xpert整合了結(jié)核分枝桿菌核酸及RFP耐藥基因檢測技術(shù)，敏感度及特異度均較高，具有良好的可靠性。有研究表明，Xpert檢測結(jié)果與RFP表型耐藥檢測結(jié)果具有高度一致性，可高達95%左右，已成為當(dāng)前診斷結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究中，Xpert診斷的RR-PTB患者經(jīng)表型藥敏試驗檢測的RFP耐藥率為95.95%，說明二者對RFP耐藥檢測結(jié)果高度一致；而14例Xpert檢測為RFP耐藥而表型藥敏試驗結(jié)果為敏感的患者，依據(jù)相關(guān)專家共識[4]，認(rèn)為此種情況多為表型藥敏試驗?zāi)退帣z測錯誤所致，推薦參照Xpert檢測結(jié)果。

MDR/RR-TB耐藥率在不同地區(qū)及不同人群存在較大差異，在前蘇聯(lián)的一些地區(qū)，甚至超過50%的復(fù)治肺結(jié)核患者對RFP耐藥，而在南非、肯尼亞等國家，即使是復(fù)治患者，RFP的耐藥率最高也只有7.1%，而我國新發(fā)和復(fù)治肺結(jié)核患者中的RFP耐藥率分別為7.1%和23%[1]，同時也存在各地區(qū)耐藥率差異，且不同地區(qū)RFP耐藥人群對其他抗結(jié)核藥物，尤其對INH和氟喹諾酮類藥物的耐藥率也存在較大差異[8-9]。

表1 利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌分離株對10種抗結(jié)核藥品的表型藥物敏感性試驗結(jié)果

表2 基于表型藥敏試驗結(jié)果的耐藥類型在利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌分離株中的分布情況

本研究結(jié)核分枝桿菌分離株來自4750例Xpert檢測結(jié)核分枝桿菌核酸陽性患者，其中11.16%的患者發(fā)生RFP的rpoB基因耐藥突變，耐藥率高于2016—2018年深圳市慢性病防治中心報道的耐藥率(8.7%)[10]，但與2015年我院統(tǒng)計的628例結(jié)核病患者對RFP的表型耐藥率(11.6%)非常接近[11]?？赡芘c我院是深圳市唯一一家收治結(jié)核病住院患者的定點醫(yī)院，收治的患者多以耐藥率較高的復(fù)治及有并發(fā)癥的患者為主，而就診于深圳市慢性病防治中心及慢病機構(gòu)的門診患者多為耐藥率較低的輕癥及初治患者有關(guān)。另一方面，也提示近6年來深圳市住院肺結(jié)核患者的RFP耐藥率并沒有下降，深圳市結(jié)核病耐藥監(jiān)測和治療仍任重道遠(yuǎn)，這可能與深圳市屬于特大城市，人口流動性較大，耐藥結(jié)核病疫情控制難度較高有關(guān)，也是目前其他大城市耐藥結(jié)核病疫情控制面臨的難題之一。

但值得注意的是，在RFP耐藥患者中，41.04%的患者為初治患者，說明耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播是RR-PTB的重要來源，管理并治愈RFP耐藥患者，盡早降低其傳染性是控制RR-PTB的根本策略[12]。對于復(fù)治RR-PTB患者分離株的RFP單耐藥率明顯低于初治患者分離株，認(rèn)為主要是前者對INH的耐藥率(耐多藥率)更高，導(dǎo)致其對RFP的單耐藥率相對較低。同時也發(fā)現(xiàn)，同為利福霉素類的Rfb，其耐藥率僅為57.23%，明顯低于RFP的耐藥率，這在既往的一些研究中也有報道，認(rèn)為可能是rpoB基因某些特定位點的變異僅對RFP耐藥，而對Rfb仍保持敏感的原因[13]，故既往也有研究者主張，對于RFP低濃度耐藥的患者，如果藥敏試驗提示對Rfb敏感，在沒有足夠藥物組成有效抗結(jié)核治療方案時也可以使用Rfb[14]。但隨著近年來貝達喹啉、德拉馬尼、普瑞馬尼等多種抗結(jié)核新藥的推出，世界衛(wèi)生組織及各國指南已經(jīng)不再向RR-TB患者推薦使用Rfb[2-3，15]。

INH是抗結(jié)核治療方案中的重要藥品，但其在RR-TB患者中的耐藥率也很高。本研究中，RR-PTB 患者分離株的INH耐藥率為84.68%，且復(fù)治患者分離株的耐藥率明顯高于初治患者分離株，與世界衛(wèi)生組織估算的全球INH平均耐藥水平(78%)基本一致，這也是世界衛(wèi)生組織主張將RR-TB 與MDR-TB同樣對待的重要原因[1]。但對于INH敏感的患者，INH仍可作為治療方案中的重要藥品，如世界衛(wèi)生組織推薦高劑量INH可用于使用短程標(biāo)準(zhǔn)化療方案且符合一定條件的患者[15]。

另外，Lfx也是目前被推薦用于MDR/RR-TB的首選藥物之一，其耐藥意味著MDR/RR-TB治療的難度將明顯增加，因此，Lfx或莫西沙星耐藥的MDR/RR-TB被定義為準(zhǔn)廣泛耐藥肺結(jié)核[1]。本研究中，當(dāng)以Xpert檢測結(jié)果作為RFP耐藥金標(biāo)準(zhǔn)時，Lfx的耐藥率達34.39%；當(dāng)以RFP表型耐藥結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)時，其耐藥率也達到26.30%，且復(fù)治患者分離株的耐藥率均明顯高于初治患者分離株，說明深圳市RR-TB患者分離株對Lfx的耐藥率較高，治療難度較大。而氟喹諾酮類藥物的高耐藥率帶來的主要問題是：RR-PTB患者一經(jīng)Xpert診斷，通常以氟喹諾酮類藥物作為初始抗結(jié)核治療方案的核心藥物之一，此時若該類藥物耐藥，則會明顯降低治療方案的療效，使治療失敗率及死亡率上升[16]。因此，對于RR-PTB患者，為有效制定抗結(jié)核治療方案，應(yīng)盡可能在啟動治療前或治療早期應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測是否存在氟喹諾酮類藥物的耐藥基因突變，并對培養(yǎng)陽性結(jié)果進行包括氟喹諾酮類藥物在內(nèi)的表型藥敏試驗。

在RR-PTB患者中，二線注射劑的耐藥率相差迥異，且臨床應(yīng)用價值有限。本研究中，Sm的耐藥率高達58.38%，明顯高于其他二線注射劑，可能與該藥既往被長期廣泛使用，其耐藥性又非常穩(wěn)定且復(fù)敏較難有關(guān)，提示該藥難以成為RR-PTB治療中的有效藥物，目前也不推薦使用；而Am與Cm的耐藥率雖然較低，但因同屬注射類藥物，使用不便，且其耳毒性及腎毒性較大，與不良結(jié)局多呈正相關(guān)等原因，此類注射劑藥物已逐漸淡出MDR/RR-TB的治療，尤其是Cm已被剔除出MDR/RR-TB的治療藥物分類[3,15]?；诖?，世界衛(wèi)生組織于2021年更改了準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病及廣泛耐藥結(jié)核病的相關(guān)定義，不再將二線注射劑耐藥作為這兩種結(jié)核病的必要條件[17]。而對于Pto、PAS、EMB等藥物，因其表型藥敏試驗結(jié)果與臨床實際療效相關(guān)性不佳，結(jié)果參考價值有限，且前兩種藥品的藥物不良反應(yīng)較大，與患者不良結(jié)局明顯相關(guān)，在當(dāng)前MDR/RR-TB治療中僅屬備選藥品[15]。

本研究有以下不足：首先，筆者所在醫(yī)院收治的患者以復(fù)治、病情危重、并發(fā)癥較多的患者為主，可能對總體肺結(jié)核患者的代表性有限，但作為深圳市唯一的一家結(jié)核病住院患者定點收治醫(yī)院，其耐藥數(shù)據(jù)可較好地代表深圳市住院肺結(jié)核患者。其次，因表型藥敏試驗自身局限性而需要耐藥基因檢測的補充，但本研究未常規(guī)對INH、氟喹諾酮類藥物相關(guān)耐藥基因進行檢測。最后，也未對世界衛(wèi)生組織推薦治療MDR/RR-TB的首選藥物如貝達喹啉、利奈唑胺等進行藥敏試驗。

綜上所述，經(jīng)Xpert檢測為RFP耐藥的結(jié)核分枝桿菌對RFP的表型藥敏耐藥率也較高，同時對INH和氟喹諾酮類藥物的耐藥率也較高。因此，應(yīng)盡早對Xpert檢測為RR-PTB的患者進行INH和氟喹諾酮類藥物的快速耐藥檢測，以優(yōu)化抗結(jié)核治療方案，加速降低傳染性及提高治愈率，增強RR-PTB 疫情控制。