李雙燕，翁佳雯，俞露，丁軼

510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院/南方醫(yī)院 放療科(李雙燕、翁佳雯、俞露、丁軼)；677000云南 臨滄，云南省臨滄市人民醫(yī)院 腫瘤科(李雙燕)

結(jié)直腸癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位，死亡率位居第2位[1-2]。在我國，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，已位居第2位，死亡率位居第5位[3]。目前，放射治療是各大腫瘤診治指南推薦的針對結(jié)直腸癌的重要治療方法[4-7]。局部晚期直腸癌可采用新輔助放療聯(lián)合化療作為標(biāo)準(zhǔn)治療模式， 約2/3的患者可實現(xiàn)原發(fā)灶縮小、降期，并提高局控率[8-9]。 在結(jié)腸癌中，放療可應(yīng)用于初始不可切、術(shù)后殘留及復(fù)發(fā)和肝肺寡轉(zhuǎn)移灶等，并可使患者從放療治療中獲益[10-11]。然而，腫瘤細胞的輻射抵抗常使得放療達不到預(yù)期治療效果。因此，亟需對結(jié)直腸癌輻射抵抗的分子機制進行研究，尋找有效的新靶點，最終改善患者預(yù)后。

乙醛脫氫酶家族1號成員L1亞型(ALDH1L1)是葉酸代謝中重要的酶，可參與一碳單位的循環(huán)，其啟動子常甲基化導(dǎo)致基因低表達，是候選的腫瘤抑制因子及侵襲性癌癥的潛在標(biāo)記物[12-14]。乙醛脫氫酶家族1號成員L2亞型(ALDH1L2)則是ALDH1L1的線粒體同源物，兩者結(jié)構(gòu)功能類似，均可將10-甲?；臍淙~酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸和CO2，同時產(chǎn)生NADPH[15-17]。有報道稱ALDH1L2為絲氨酸向甘氨酸轉(zhuǎn)化和甘氨酸降解提供四氫呋喃，且參與依賴CoA的途徑，如β-氧化，三羧酸循環(huán)和膽汁酸的生物合成等[17-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1L2在人結(jié)直腸癌、胰腺癌組織中表達異常，且與患者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率相關(guān)[20-21]。因此，ALDH1L2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

過氧化物酶體通路主要包含發(fā)生在過氧化物酶體的生理、生化過程。過氧化物酶體是胞內(nèi)必需的細胞器，其內(nèi)包含豐富的酶類，包括氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等[22-23]。其主要參與胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)代謝，抗氧化及脂肪酸氧化[24-25]。而胞內(nèi)氧化還原水平則與細胞輻射抗性、輻射抵抗密切相關(guān)[26-27]。

本課題組前期研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)ALDH1L2在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用。既往文獻報道，ALDH1L2與結(jié)直腸癌患者的奧沙利鉑耐藥相關(guān)[19]，但是ALDH1L2是否與結(jié)直腸癌患者的輻射抵抗相關(guān)尚未可知。因此，本研究嘗試探討ALDH1L2是否影響結(jié)直腸癌細胞的輻射敏感性，為ALDH1L2是否介導(dǎo)結(jié)直腸癌輻射抵抗提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、Opti-MEM培養(yǎng)液購于美國GIBCO公司；PCR八連管、6孔平底細胞培養(yǎng)板購于美國NEST公司；β-Actin多克隆抗體、ALDH1L2多克隆抗體購于中國三鷹公司；彗星電泳法檢測細胞損傷試劑盒購于中國凱基公司；SYBR Green熒光PCR染料購于日本Takara公司。

1.2 儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計均購于美國Thermo公司；蛋白電泳儀、ChimiDoc XRS高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)均購于美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀(PRISM 7500)購于美國ABI公司；熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 生信分析

分別通過GEPIA網(wǎng)站(gepia.cancer-pku.cn)和腫瘤與癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫分析ALDH1L2在各種惡性腫瘤的表達情況及與結(jié)直腸癌患者生存的相關(guān)性。下載GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE17538芯片分析ALDH1L2表達水平與結(jié)直腸癌患者無疾病生存率的相關(guān)性。利用Genecards網(wǎng)站(www.genecards.org)對ALDH1L2基因的染色體位置和編碼蛋白質(zhì)定位進行分析。通過THE HUMAN PROTEIN ATLAS數(shù)據(jù)庫分析ALDH1L2蛋白在結(jié)直腸癌患者中的免疫組化染色情況。利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)軟件(www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)對TCGA中結(jié)直腸癌患者數(shù)據(jù)進行KEGG通路分析。GSEA分析中主要使用c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集，設(shè)定隨機組合次數(shù)為1 000次，P≤0.05的KEGG通路為顯著富集通路。

1.4 細胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細胞HCT 116、SW480、SW620、Caco-2、RKO、HCT-15細胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)方法進行傳代，選擇對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.5 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

胰酶消化并離心得到細胞團塊，加入Trizol并冰上靜置使其充分裂解。1∶5加入氯仿，上下顛倒并冰上靜置至分層明顯。4℃，12 000 rpm 離心15 分鐘，吸取上清至滅酶EP管中。加入等體積異丙醇，充分混均，靜置后4℃，12 000 rpm 離心15 分鐘，棄上清。使用75%乙醇洗滌RNA兩次，棄乙醇，室溫干燥5分鐘。加入DEPC水溶解，檢測RNA樣品的濃度和純度并逆轉(zhuǎn)得到cDNA。

1.6 qRT-PCR檢測基因表達水平

按照SYBR Green熒光染料說明書配制20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)條件如表2所示，引物序列如表3所示。

表1 Real-Time PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)條件

表3 引物序列

1.7 細胞轉(zhuǎn)染

1.7.1 過表達質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染 將結(jié)直腸癌細胞接種于六孔板中，細胞密度達到70%～80%時利用Lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，提取細胞RNA和蛋白質(zhì)，進行后續(xù)實驗。

1.7.2 干擾RNA轉(zhuǎn)染 將結(jié)直腸癌細胞接種于六孔板中，當(dāng)細胞長至70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。Si RNA序列分別為#1(5′-CTGTGTTCAAGCTTCCTAAATGG-3′)、#2(5′-CAGTTCATTCCCATGGATATAAT-3′)、#3(5′-CCCATGGATATAATTGATAGTCC-3′)，轉(zhuǎn)染48 小時后提取細胞RNA和蛋白質(zhì)，進行后續(xù)實驗。

1.8 平板克隆形成實驗

細胞轉(zhuǎn)染后，按照一定數(shù)量接種于六孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別接受2、4、6、8 Gy 6MeV X線照射，培養(yǎng)7～14 d。待六孔板出現(xiàn)肉眼可見的克隆點時甲醇固定，結(jié)晶紫染色，并拍攝平板克隆。

1.9 Western blot實驗

收集細胞，提取蛋白，檢測蛋白濃度，加入緩沖液煮沸變性。上膠電壓65 V電泳30 min，下膠100 V電泳1 h，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，抗體孵育，發(fā)光顯像。用Image J軟件進行灰度值分析。

1.10 γ-H2AX實驗

將SW480腸癌細胞暴露于8 Gy的X射線，HCT 116腸癌細胞暴露于4 Gy的X射線下；根據(jù)設(shè)定的時間梯度(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h)收集細胞、提取蛋白、測蛋白濃度、蛋白變性，進行γ-H2AX實驗。

1.11 彗星試驗

X射線8 Gy照射SW480細胞，4Gy照射HCT 116細胞，培養(yǎng)2小時后，胰酶消化收集細胞，用彗星電泳法檢測細胞損傷試劑盒，進行DNA損傷檢測。碘化丙啶染色后，使用熒光顯微鏡拍攝彗星圖像，利用CASP軟件統(tǒng)計分析彗星頭、尾的DNA占比。

1.12 細胞ROS水平檢測

細胞孵育10 μM/L的DCFH-DA探針20 min后，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，對細胞進行6 Gy輻射后30 min內(nèi)消化細胞成單細胞懸液，進行流式細胞學(xué)檢測分析。

1.13 細胞凋亡檢測

細胞進行6 Gy輻射后，使用不含EDTA的胰酶消化細胞呈單細胞懸液，PBS清洗細胞兩次，加入binding buffer孵育細胞，加入Annexin-V-APC和PI，室溫避光孵育15分鐘，進行流式細胞學(xué)檢測。

1.14 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)和圖表表示，測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Graph Pad Prism 7軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ALDH1L2與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌和直腸癌患者數(shù)據(jù)進行生信分析，結(jié)果提示:ALDH1L2與結(jié)直腸癌患者的無病生存率(disease-free survival，DFS)相關(guān)，高表達ALDH1L2提示患者更短的DFS(P=0.018，HR=2.60)(圖1A左側(cè))。同時利用GEO數(shù)據(jù)庫芯片GSE17538在結(jié)直腸癌患者中進行生存分析，同樣發(fā)現(xiàn)高表達ALDH1L2提示患者更短的DFS(P=0.03，HR=2.006，95%CI1.096～3.673)(圖1A右側(cè))。通過Genecards網(wǎng)站對該基因進行生信分析，提示ALDH1L2位于12號染色體q臂23區(qū)3亞帶(圖1B)，其編碼的蛋白質(zhì)主要分布于胞內(nèi)線粒體、核仁和胞漿，同時也作為分泌型蛋白分布于胞外(圖1C)。利用在線開放的THE HUMAN PROTEIN ATLAS數(shù)據(jù)庫調(diào)取了ALDH1L2蛋白在結(jié)直腸癌患者(HPA039481)中的免疫組化結(jié)果圖，提示ALDH1L2蛋白主要定位于胞漿和細胞膜上(圖1D)，較好地佐證了之前的生信預(yù)測結(jié)果。同時，還發(fā)現(xiàn)在TCGA結(jié)腸癌患者中，ALDH1L2存在2.51%的突變率，以錯義突變?yōu)橹鳎辉谥蹦c癌中有類似的結(jié)果，ALDH1L2存在1.46%的突變率，也以錯義突變?yōu)橹?圖1E、F)。綜上，提示ALDH1L2與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)。

圖1 ALDH1L2在結(jié)直腸癌中的特性

2.2 ALDH1L2與輻射敏感性相關(guān)

為了探究ALDH1L2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用，首先檢測了ALDH1L2在人源性結(jié)直腸癌細胞的本底表達情況。通過對HCT-15、HCT 116、SW480、SW620、Caco-2和RKO六株細胞進行Western blot及qRT-PCR實驗，驗證了ALDH1L2在多種結(jié)直腸癌細胞中存在表達，且在SW620、RKO和HCT 116細胞中表達相對較高，SW480和Caco-2細胞中表達相對較低，整體與細胞的輻射敏感性存在一定的相關(guān)性(圖2)。

圖2 人源性結(jié)直腸癌細胞中ALDH1L2表達水平

2.3 ALDH1L2的過表達與敲低

為了更好探究ALDH1L2在結(jié)直腸癌細胞中發(fā)揮的作用，針對SW480細胞進行了過表達，HCT 116腸癌細胞進行了敲低。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腸癌細胞株SW480后行qRT-PCR、western blot檢測ALDH1L2表達量，結(jié)果提示與對照組相比實現(xiàn)過表達(fold change=110.1，P=0.001)(如圖3A、C)。經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染腸癌細胞株HCT 116后行qRT-PCR、western blot檢測ALDH1L2，發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，1號序列及3號序列可敲低ALDH1L2(1號序列fold change=0.309，P<0.001；3號序列fold change=0.3210，P<0.001)(如圖3B、D)。

圖3 ALDH1L2過表達與敲低驗證(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05)

2.4 ALDH1L2是輻射敏感基因

為了探究ALDH1L2是否參與調(diào)控結(jié)直腸癌細胞輻射敏感性，我們在ALDH1L2轉(zhuǎn)錄水平較低且為輻射抵抗株的SW480細胞中穩(wěn)定過表達ALDH1L2，在轉(zhuǎn)錄水平較高且為輻射敏感株的HCT 116細胞中敲低ALDH1L2，并進行平板克隆實驗(圖4A、B)。克隆形成后，計算SW480與HCT 116細胞的存活分?jǐn)?shù)(表4、5)。結(jié)果顯示ALDH1L2過表達后SW480細胞D0值升高(表4)，存活曲線左移(圖4C)，提示對輻射更敏感；而敲低ALDH1L2后HCT 116細胞D0值下降(表5)，存活曲線右移(圖4D)，促使細胞對輻射更抵抗。綜上，體外實驗提示ALDH1L2是一個輻射敏感基因。

圖4 ALDH1L2過表達和敲低后進行平板克隆實驗

表4 各組SW480細胞經(jīng)不同照射劑量的存活分?jǐn)?shù)(%)

表5. 各組HCT 116細胞經(jīng)不同照射劑量的存活分?jǐn)?shù)(%)

2.5 ALDH1L2抑制DNA損傷修復(fù)

為了探究ALDH1L2是否進一步影響輻射誘導(dǎo)的DNA損傷，檢測了輻射后不同時間胞內(nèi)的γ-H2AX水平。結(jié)果表明，輻射后γ-H2AX水平明顯升高，在SW480細胞中1小時達到峰值，在HCT 116細胞中0.5小時達到峰值，然后隨著時間的推移逐漸降低。在γ-H2AX水平達到峰值之后，SW480細胞株ALDH1L2過表達組與對照組相比下降較慢(圖5A)，而在HCT 116 細胞株ALDH1L2敲低組比對照組下降較快(圖5B)，驗證了ALDH1L2抑制細胞的DNA損傷修復(fù)。

圖5 Western blot檢測SW480、HCT 116在X射線照射后γ-H2AX在不同時間點的表達水平

2.6 ALDH1L2促進DNA雙鏈斷裂

同時，還進行了彗星實驗測定輻射后細胞的DNA雙鏈斷裂水平。結(jié)果提示SW480 OE細胞的彗尾明顯延長，彗星頭部占總DNA的比例明顯降低(P<0.001，圖6A)，HCT 116-Si1細胞在輻射后顯示出比對照細胞更短的彗尾，頭部DNA占總DNA的比例明顯增加(P<0.001，圖6B)。綜上，提示ALDH1L2促進DNA雙鏈斷裂。

圖6 彗星實驗探究ALDH1L2對細胞DNA損傷水平的影響

2.7 ALDH1L2可能通過過氧化物酶體通路調(diào)控細胞輻射敏感性

結(jié)合前面數(shù)據(jù)提示ALDH1L2是一個輻射敏感基因，為了更好地探究它是通過什么途徑來發(fā)揮作用，利用GSEA生信分析對TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者進行了分析。通路富集結(jié)果提示，ALDH1L2低表達與多條通路相關(guān)，其中脂肪酸代謝通路(NES=1.68，P=0.028)與過氧化物酶體通路(NES=1.49，P=0.047)存在顯著的統(tǒng)計學(xué)富集(圖7A、B)。因過氧化物酶體是參與細胞ROS清除、調(diào)控細胞輻射敏感性的關(guān)鍵通路，故對過氧化物酶體通路中的關(guān)鍵基因進行了檢測。qRT-PCR實驗結(jié)果提示通路中關(guān)鍵基因PGC1A、SOD2和CAT呈現(xiàn)出顯著改變。即，當(dāng)ALDH1L2過表達時，上述基因轉(zhuǎn)錄水平降低；而ALDH1L2敲低時，上述基因轉(zhuǎn)錄水平增加(圖7C)。在細胞進行輻射后，利用western blot實驗檢測了上述3個基因的蛋白水平，結(jié)果提示與轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢相同(圖7D)。通過DCFH-DA探針結(jié)合流式細胞學(xué)檢測，結(jié)果提示經(jīng)過6 Gy照射后，SW480 OE細胞內(nèi)呈現(xiàn)更高水平的ROS，而HCT 116-Si1細胞則呈現(xiàn)出較低水平的ROS(圖7E)。通過Annexin-V-APC/PI雙染細胞結(jié)合流式細胞學(xué)檢測，結(jié)果提示，在輻射后SW480 OE細胞凋亡水平增加，而HCT 116-Si1細胞則呈現(xiàn)出相反趨勢(圖7F)，且反映凋亡的效應(yīng)蛋白Caspase 3及cleaved-Caspase 3的表達也符合流式結(jié)果趨勢(圖7D)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是癌癥死亡的重要原因之一。放射治療是腸道腫瘤治療的主要手段之一。既往有文獻發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中多種葉酸代謝相關(guān)酶表達異常，其中ALDH1L2常表達上調(diào)[19-21]。有學(xué)者提出，ALDH1L2與奧沙利鉑耐藥相關(guān)[19]，但它在腸癌放療中發(fā)揮的作用尚并不明確。

本研究首先通過生信分析發(fā)現(xiàn)ALDH1L2可能與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)，其次體外實驗表明ALDH1L2在腸癌細胞均有表達，且與輻射敏感存在一定相關(guān)性。根據(jù)多項研究[28-32]，提示SW480、HCT-15是相對輻射抵抗的腸癌細胞株，而SW620、RKO、HCT 116、Caco-2則是相對輻射敏感細胞。ALDH1L2在結(jié)直腸癌細胞中蛋白表達與mRNA表達水平不匹配，其原因通過查閱文獻，得出可能是由于不同人源性腸癌細胞株背景不同，存在不同的突變等因素，影響到了該基因轉(zhuǎn)錄后的修飾，最終使得轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平不匹配[32]。本研究分別選取了SW480和HCT 116細胞株進行實驗，SW480中過表達ALDH1L2會導(dǎo)致細胞受到的輻射損傷增加，敲低HCT 116中的ALDH1L2使細胞對輻射抵抗能力增強，最后平板克隆和彗星實驗也得出類似的結(jié)論。由此可見ALDH1L2是輻射敏感基因。最后，通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)ALDH1L2與過氧化物酶體通路密切相關(guān)，并通過qRT-PCR、western blot及流式細胞學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)ALDH1L2可下調(diào)過氧化物酶體通路關(guān)鍵分子PGC1A及下游基因SOD2、CAT的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，使得細胞ROS清除能力降低，受照射后胞內(nèi)ROS水平累積，導(dǎo)致細胞凋亡增多，最終使得細胞呈現(xiàn)出輻射敏感性增加的表型。本研究的成果在于發(fā)現(xiàn)了ALDH1L2是輻射敏感基因，且可能通過過氧化物酶體通路介導(dǎo)細胞的輻射抗性，可能在腸癌患者放射治療抵抗的分子機制中發(fā)揮一定的作用。

但本研究也存在著不足之處。首先，我們發(fā)現(xiàn)ALDH1L2參與調(diào)控過氧化物酶體通路關(guān)鍵分子PGC1A的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平，但具體分子機制尚不清楚。再者，本研究僅采用了SW480和HCT 116兩株腸癌細胞株進行表型、功能和分子機制研究，ALDH1L2在其他腸癌細胞株中是否有同樣的功能仍需進一步實驗證實。

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