朱曠曠， 謝建絮， 余海波， 彭 艾

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科，上海 200072)

百草枯(paraquat, PQ)作為高效、環(huán)保的除草劑，在全球范圍內(nèi)廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域清除各種雜草[1]。PQ因其劇毒性而被一些國家限制使用，盡管如此，PQ中毒致死事件的發(fā)生依舊不容樂觀。直接接觸和經(jīng)口攝入是PQ中毒的主要途徑，由于臨床缺乏特效解毒藥物，口服PQ死亡率高達(dá)90%[2]。

近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)氨基酸在活性氧類(rea-ctive oxygen species, ROS)產(chǎn)生及抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用，如支鏈氨基酸(branched-chain amino acids， BCAA)、含硫氨基酸等[3]。PQ干擾細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞鏈系統(tǒng)造成線粒體損傷，造成機(jī)體內(nèi)部氧化應(yīng)激水平激增和炎癥風(fēng)暴，是PQ中毒造成器官損傷的主要機(jī)制[4-5]?？梢?，氨基酸代謝在氧化應(yīng)激損傷中的作用機(jī)制可能在PQ誘導(dǎo)的器官損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

PQ進(jìn)入人體后迅速分布于各組織器官，且在肺、肝臟和腎臟中異常聚集[6]，然而目前關(guān)于PQ中毒后氨基酸代謝特征的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)(liquid chromatography tan-dem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)靶向檢測PQ中毒小鼠的血漿和肝臟的氨基酸水平，并進(jìn)一步探索血漿氨基酸與肝腎功能的關(guān)聯(lián)性，旨在尋找更加靈敏的輔助診斷指標(biāo)，進(jìn)而為PQ中毒早期的臨床診療以及評估策略提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑

化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品包括丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、組氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、?；撬岬?1種氨基酸及相應(yīng)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品、PQ均購自美國Sigma公司；LC-MS級試劑甲醇、乙腈、甲酸、七氟丁酸均購自美國賽默飛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只無特定病原體級別雄性小鼠(C57BL/6J，6周齡)購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)滬北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光照/黑暗循環(huán)且恒溫環(huán)境下自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會的批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號為SYXK2018-0034。

1.3 PQ小鼠模型構(gòu)建及樣品采集

將30只小鼠隨機(jī)分為3組： 空白對照組(對照組，n=10，注射無菌生理鹽水)、百草枯中毒4 h組(PQ中毒4 h組，n=10)和百草枯中毒48 h組(PQ中毒48 h組，n=10)，將百草枯粉劑溶于無菌生理鹽水中按50 mg/kg給藥[7]。給藥4 h/48 h后腹膜下注射3.5%水合氯醛0.35 mL，麻醉后收集血液置于抗凝Eppendorf管中，于5427R離心機(jī)(Eppendorf,德國漢堡公司)中，4 ℃，800×g，離心15 min，吸取血漿置于1.5 mL Eppendorf管后存于-80 ℃。分離肝組織于液氮中淬滅后存于-80 ℃。

1.4 血漿樣品制備

將標(biāo)準(zhǔn)品以及帶有相應(yīng)同位素標(biāo)記的氨基酸分別制成1 mg/mL的水溶液，隨后將兩者等體積混合后使用甲醇稀釋配制成內(nèi)標(biāo)混合液。將對照組和PQ中毒4 h組小鼠血漿置于冰上緩慢解凍后，取20 μL血漿加入混有20 μL內(nèi)標(biāo)溶液以及160 μL含0.5%甲酸的甲醇溶液的Eppendorf管中，使用MixMate混勻儀(Eppendorf,德國漢堡公司)振蕩5 min，4 ℃，13 000×g，離心10 min，取上清液存于-20 ℃。

1.5 組織樣品制備

取出對照組和PQ中毒4 h組肝臟置于冰上緩慢融化后，分離適量樣品并稱重，加入500 μL 80%的甲醇溶液(含0.1%氨水)后使用組織破碎機(jī)在4 ℃、65 Hz條件下勻漿6 min；渦旋振蕩30 s后4 ℃ 超聲振蕩30 min，于-20 ℃靜置1 h后，4 ℃靜置30 min，4 ℃，13 000×g，離心15 min，取上清液。

1.6 LC-MS/MS分析

使用LC-MS/MS靶向檢測血漿和肝臟的氨基酸水平，在配備Venusil ASB-C18(2.1 mm×150 mm,3.0 μm,博納艾杰爾科技公司)反向色譜柱的1200 Infinity液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)上分離收集的樣品。柱溫40 ℃、流動(dòng)相流速0.36 mL/min以及4 ℃條件下自動(dòng)進(jìn)樣5 μL，流動(dòng)相包括水相和有機(jī)相，分別是含有0.4%甲酸以及0.02%七氟丁酸的水(A相)和含有0.3%甲酸及0.02%七氟丁酸的乙腈(B相)，洗脫梯度為0～3.5 min，99%A；3.5～5 min，99%～15%A；5～10 min，15%～3%A；10～13 min，3%～99%A；13～15 min，99%A。使用QTRAP 4500質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下正模式電噴霧電離源離子噴霧電壓為5 500 V，氣簾氣流速2 L/h、離子源氣體1流速55 L/h、離子源氣體2流速55 L/h，源溫度550 ℃，通過注入濃度為1 μmol/L的單一化合物溶液，優(yōu)化分析物、內(nèi)標(biāo)物的解簇電勢、碰撞能量以及碰撞池出口電勢。

1.7 肝腎功能檢測

分離好血清后使用血肌酐(serum creatinine， SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書分別檢測小鼠SCr、BUN、AST、ALT的水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SIMCA-P 16.0.2軟件進(jìn)行代謝組學(xué)分析。通過主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)來減少兩組數(shù)據(jù)的維度并在無監(jiān)督模式下進(jìn)行分類，初步認(rèn)識數(shù)據(jù)的集中趨勢及離群值。使用監(jiān)督模式下的正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least square-discriminate analysis， OPLS-DA)進(jìn)一步研究兩組數(shù)據(jù)間氨基酸血漿分布特點(diǎn)，建立分類模型以及計(jì)算代謝物的變量重要性值(various important projection, VIP)。采用置換檢驗(yàn)評估擬合優(yōu)度參數(shù)(R2)和預(yù)測能力參數(shù)(Q2),對OPLS-DA建立的預(yù)測模型進(jìn)行驗(yàn)證。以VIP>1，P<0.05為條件篩選差異氨基酸。應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)分析差異氨基酸與肝腎功能的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 PQ中毒肝腎功能變化

與對照組相比，PQ中毒4 h組SCr變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.455)，BUN水平顯著降低(P=0.009)；PQ中毒4 h組肝功能指標(biāo)AST、ALT較對照組均顯著上升(P=0.012、0.023)。PQ中毒48 h組小鼠BUN較對照組顯著增高(P=0.001)，而SCr、ALT、AST水平雖呈上升趨勢，但差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，提示腎功能隨著中毒時(shí)間的推移將逐步惡化,見表1。

表1 PQ中毒小鼠肝腎功能Tab.1 Liver and kidney function of mice poisoned by paraquat

2.2 PQ中毒早期氨基酸代謝特點(diǎn)

為了觀察PQ中毒早期氨基酸代謝特征，以篩選出更加靈敏的潛在生物標(biāo)志物，通過LC-MS/MS技術(shù)靶向檢測對照組和PQ中毒4 h組小鼠血漿和肝臟的氨基酸水平。本研究成功鑒定出上述21種氨基酸(肝組織樣本中半胱氨酸水平低于檢測閾值，故未列出)，見表2～3。

表2 血漿氨基酸水平Tab.2 Plasma levels of amino acids (μg/mL)

表3 肝組織氨基酸水平Tab.3 Amino acid levels in liver tissue (μg/mg)

續(xù)表

2.2.1 氨基酸代謝的多元統(tǒng)計(jì)分析 對21種氨基酸進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，無監(jiān)督模式的PCA分析顯示，血漿氨基酸能夠按PQ組和對照組聚類分布，即氨基酸代謝水平可較好地區(qū)分兩組樣本，表明PQ中毒后的氨基酸代謝發(fā)生顯著改變。95% Hotelling’s T2置信區(qū)間線圖未發(fā)現(xiàn)有超出區(qū)間外的離群值。進(jìn)一步采用結(jié)合正交校正信號且有監(jiān)督模式的OPLS-DA分析兩組氨基酸代謝特征，在該模式下氨基酸能夠更好地區(qū)分PQ組和對照組。OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)顯示Q2回歸線與Y軸截距為負(fù)，表明OPLS-DA模型構(gòu)建有效(R2=0.486, Q2=-781)，在肝臟中亦是如此(圖1)。在OPLS-DA模型下計(jì)算出的氨基酸VIP值見表2～3。

圖1 血漿氨基酸的主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析Fig.1 Principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis of plasma amino acidsA： PCA散點(diǎn)得分圖；B： Hotelling’s T2置信區(qū)間線圖；C： OPLS-DA散點(diǎn)得分圖；D： 置換檢驗(yàn)

2.2.2 差異代謝物分析 與對照組相比，PQ中毒4 h組血漿亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、?；撬犸@著上調(diào)，蘇氨酸、精氨酸、蛋氨酸、絲氨酸顯著下調(diào)(P<0.05)；肝臟賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、?；撬犸@著上調(diào)，甘氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸顯著下調(diào)(P<0.05)。最終根據(jù)VIP>1、P<0.05篩選出7種可早期診斷PQ中毒的差異氨基酸，即牛磺酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸以及蛋氨酸。見表2～3。

2.3 差異氨基酸與肝腎功能相關(guān)性分析

通過斯皮爾曼相關(guān)性分析7種差異氨基酸與SCr、BUN、ALT和AST的關(guān)系，以進(jìn)一步探討PQ中毒4 h后氨基酸代謝與肝腎功能的潛在關(guān)聯(lián)。亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和?；撬崤cAST水平顯著正相關(guān)(均P<0.05)，亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸及牛磺酸與ALT水平顯著正相關(guān)(均P<0.05)；異亮氨酸和亮氨酸與SCr顯著負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，蛋氨酸僅與BUN水平呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，見圖2。表明PQ中毒4 h后氨基酸代謝與肝腎功能存在顯著關(guān)聯(lián)，差異氨基酸可能是評估肝腎功能的潛在指標(biāo)。

圖2 差異氨基酸與PQ中毒4 h肝腎功能相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat map of the correlation between amino acids and liver, kidney functions after 4 hours of paraquat poisoningL-leucine： 亮氨酸；L-tryptophan： 色氨酸；L-valine： 纈氨酸；L-isoleucine： 異亮氨酸；L-methionine： 蛋氨酸；L-phenylalanine： 苯丙氨酸；Taurine： ?；撬?/p>

3 討 論

PQ中毒患者主要死于肺纖維化導(dǎo)致的呼吸功能不全，肝臟和腎臟也是PQ中毒早期的主要靶器官。據(jù)報(bào)道，PQ誘導(dǎo)的急性腎損傷可導(dǎo)致PQ無法及時(shí)排泄，進(jìn)一步加重PQ濃度蓄積[8]。然而，Mohamed等[9-10]證實(shí)SCr并非PQ中毒后反應(yīng)腎功能損傷的良好標(biāo)志，應(yīng)該尋求如胱抑素C、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白這類更為靈敏特異的生物標(biāo)志物評估腎損傷。在本研究中，PQ中毒4 h 后SCr未發(fā)生顯著改變，而BUN較對照組顯著降低，這可能是PQ中毒后引起小鼠消化系統(tǒng)功能的紊亂、厭食導(dǎo)致。PQ中毒48 h后BUN較對照組顯著增高表明PQ中毒后腎功能的持續(xù)損害，而SCr雖有增高趨勢但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟作為人體最大的代謝器官，在機(jī)體解毒以及對抗外源性氧化物質(zhì)中起到重要作用。PQ中毒引起肝損傷的主要特點(diǎn)是肝轉(zhuǎn)氨酶的升高和組織病理學(xué)的顯著改變[11]。與之前的研究一致[12]，本研究PQ中毒4 h組的AST、ALT水平顯著增高，雖然PQ中毒48 h組AST、ALT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但也表現(xiàn)出增高趨勢，這表明PQ引起的肝臟急性損傷占主導(dǎo)地位，在短期內(nèi)可能隨著時(shí)間的延長有所波動(dòng)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

本研究通過LC-MS/MS技術(shù)檢測血漿與肝臟的氨基酸代謝水平，發(fā)現(xiàn)PQ中毒后氨基酸代謝發(fā)生明顯改變。PCA和OPLS-DA的多元統(tǒng)計(jì)分析顯示，氨基酸可以有效區(qū)分PQ中毒4 h組與對照組。通過VIP>1且P<0.05篩選出?；撬?、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸以及蛋氨酸是作為區(qū)分PQ中毒與健康對照的關(guān)鍵因素。

氨基酸參與多種病理生理進(jìn)程，?；撬崾且环N不參與蛋白質(zhì)合成的含硫氨基酸，骨骼肌中含量豐富，其主要食物來源于海鮮[13]。?；撬岵粌H可作為氧化還原穩(wěn)態(tài)和骨骼肌功能的調(diào)節(jié)劑，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如帕金森、阿爾茨海默癥模型中也發(fā)揮了保護(hù)作用[13-15]。在氧化應(yīng)激環(huán)境下，牛磺酸可代謝成?；撬崧劝罚M(jìn)而與核因子E2相關(guān)因子1(nuclear factor E2-related factor 1, Nrf2)的抑制蛋白即Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)結(jié)合，隨后導(dǎo)致與Keap1偶聯(lián)的Nrf2易位到細(xì)胞核內(nèi)并與各種抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)各種抗氧化反應(yīng)酶相關(guān)基因的編碼[13]。除了在轉(zhuǎn)錄水平上影響氧化應(yīng)激水平外，?；撬徇€可以獨(dú)立于?；撬崧劝分苯蛹せ頝rf2合成抗氧化相關(guān)的酶[13]。蛋氨酸是合成?；撬岬那绑w氨基酸，在轉(zhuǎn)硫途徑中降解為半胱氨酸，隨后被氧化為半胱氨酸亞磺酸鹽，最終在半胱氨酸亞磺酸脫羧酶的催化下分解為?；撬醄16]。本研究發(fā)現(xiàn)PQ中毒4 h組血漿?；撬岜磉_(dá)顯著上調(diào)，而?；撬崆绑w氨基酸蛋氨酸顯著下調(diào)。這可能是由于PQ中毒早期氧化應(yīng)激水平升高導(dǎo)致的?；撬崴酱鷥斝栽龈?。不難預(yù)測PQ在體內(nèi)持續(xù)蓄積發(fā)生失代償后，蛋氨酸水平會進(jìn)一步減少，一方面會導(dǎo)致?；撬岬暮慕撸硪环矫嬉矔箼C(jī)體內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)酶性物質(zhì)(如超氧化物歧化酶)活性降低和非酶性物質(zhì)(如谷胱甘肽)的減少，氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步加重[17]。另外，在肝臟組織中同樣發(fā)現(xiàn)牛磺酸水平顯著增高，推測這可能是代償性反應(yīng)引起的肝臟合成增加。

色氨酸是含量最少的一種營養(yǎng)必須氨基酸，主要在吲哚胺2,3-二加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase， IDO)的催化下經(jīng)犬尿氨酸途徑代謝,而IDO的活性很大程度上受到炎癥因子的驅(qū)動(dòng)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[18]。在PQ中毒4 h后，色氨酸在血漿中均明顯上調(diào)，其可能原因是IDO的活性在PQ環(huán)境下受到抑制，導(dǎo)致免疫防御功能和調(diào)控作用的減弱，在體內(nèi)誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。另外，研究中發(fā)現(xiàn)色氨酸和苯丙氨酸與小鼠AST、ALT活性顯著正相關(guān)，色氨酸和苯丙氨酸均屬于芳香族氨基酸，主要在肝臟中代謝。因此，當(dāng)肝臟發(fā)生損害時(shí)可能會損害苯丙氨酸的代謝，導(dǎo)致苯丙氨酸在血漿中的濃度增高[19]，這與本研究結(jié)果一致。

亮氨酸、纈氨酸、和異亮氨酸統(tǒng)稱為BCAA，屬于營養(yǎng)必須氨基酸，氧化后促進(jìn)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化來為細(xì)胞提供能量[20]。然而有研究表明BCAA濃度過高不僅將激活NADPH氧化酶的催化亞基，還會導(dǎo)致線粒體功能障礙進(jìn)而誘發(fā)過量ROS以及通過激活核因子κB途徑來促進(jìn)外周血單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[21-22]。這些結(jié)果表明支鏈氨基酸有助于反應(yīng)不同病理狀態(tài)下的炎癥過程，本研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒4 h組中血漿和肝組織的BCAA均顯著增高，提示PQ中毒后BCAA濃度升高所致內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷可能是肺纖維化的潛在機(jī)制[23]，有待進(jìn)一步研究。

既往很多報(bào)道表明補(bǔ)充BCAA可有效緩解慢性肝臟疾病[24-25]，牛磺酸缺乏也會導(dǎo)致肝功能異常[26]。本研究結(jié)果顯示，PQ中毒4 h后?；撬帷CAA與肝功能顯著負(fù)相關(guān)，提示PQ導(dǎo)致的肝臟損害后BCAA、?；撬岽鷥斝栽龈咭跃徑馐軗p的肝功能。血漿中蛋氨酸水平與PQ中毒4 h組小鼠的BUN顯著正相關(guān)，與Cooke等[27]發(fā)現(xiàn)在飲食上蛋氨酸限制能夠表現(xiàn)出腎臟保護(hù)作用的結(jié)果一致，機(jī)制可能與下調(diào)炎癥和纖維化有關(guān)。

綜上所述，本研究篩選出?；撬帷⒗i氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸以及蛋氨酸等7種氨基酸，可作為早期診斷PQ中毒并評價(jià)肝腎功能的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)也為臨床早期診治提供了新策略。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先樣本量較少，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；其次是本實(shí)驗(yàn)僅對PQ中毒早期的氨基酸進(jìn)行了檢測，PQ中毒后續(xù)的氨基酸代謝如何變化以及潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。