高熠輝， 牟麗莎， 崔婷婷， 閆 欣， 徐晶瑩， 徐國彤

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092; 2. 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 深圳 518035)

先天性白內(nèi)障(congenital cataract, CC)是世界性兒童視力障礙和失明的最常見原因，約四分之一是由遺傳缺陷引起的[1]。HSF4(heat shock trans-cription factor 4, HSF4)是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族的成員[2]。Hsf4基因敲除后，小鼠具有明顯的CC表型[3]。

本課題組前期利用Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠對HSF4在白內(nèi)障發(fā)生中的調(diào)控作用展開了研究，發(fā)現(xiàn)熱休克轉(zhuǎn)錄因子4b(HSF4b)對波形蛋白(vimentin, VIM)的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用[4]。本研究利用Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠模型進(jìn)一步尋找了HSF4的另一個下游分子αB晶狀體蛋白(αB-crystallin, CRYAB)，并分析了HSF4b、CRYAB和VIM相互作用的分子機制，旨在為篩選和研發(fā)抗白內(nèi)障藥物確定方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04、pcDNA3.1-HSF4b質(zhì)粒由中科院健康所孔祥銀研究員惠贈；pGL3-Luc、pRL-TK、pTER+載體由中科院健康所金穎研究員惠贈；胎牛血清購自Gibco公司；DMEM/低糖液體培養(yǎng)基、DAPI、多聚甲醛、Triton-X-100均購自Sigma公司；胰酶、青霉素/鏈霉素購自上海碧云天有限公司；NE-PER核漿分離試劑盒、Light Shift Chemiluminescent EMSA試劑盒、Biotin 3′ End DNA Labeling試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、TRIzol total RNA提取試劑、ECL反應(yīng)試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Dynabeads磁珠均購自Thermo公司；Dual-Luciferase報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；牛血清白蛋白購自生工生物工程(上海)有限公司；2×Taq PCR Mastermix購自天根生化科技(北京)有限公司；熒光封片劑購自丹麥DakoCytomation公司。

實驗中所使用抗αB-crystallin抗體(Ab13497)購自Abcam公司；抗Vimentin抗體(26091)購自New-EastBio公司；抗HSF4b抗體(sc-398645)購自Santa-Cruz公司；Anti-rabbit-Cy3二抗(711-165-152)、Anti-mouse-Cy3二抗(715-165-150)、Anti-rabbit-HRP二抗(711-035-152)、Anti-mouse-HRP二抗(715-035-150)、Anti-goat-HRP二抗(705-035-147)均購自Jackson Immunoresearch Laboratories公司；HRP-con-jugated Beta Actin抗體(HRP-60008)購自Proteintech公司；Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse二抗(A11001)、Alexa Fluor 555 Goat anti-Rabbit二抗(A21429)均購自Invitrogen公司。

1.2 實驗動物

Hsf4野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠由中科院健康所孔祥銀研究員惠贈，Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠中Hsf4基因表達(dá)功能喪失，不表達(dá)HSF4蛋白。本研究嚴(yán)格遵守國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》、同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院《實驗動物使用和管理條例》及動物倫理學(xué)相關(guān)條例，并符合美國視覺與眼科學(xué)研究學(xué)會(ARVO)在眼科研究領(lǐng)域中對動物實驗的要求。所有動物操作方法均遵循中國衛(wèi)生部制定的動物使用規(guī)則以及動物福利要求。

1.3 實驗方法

1.3.1 SRA01/04細(xì)胞培養(yǎng) 使用DMEM/低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人SRA01/04細(xì)胞，細(xì)胞傳代采用0.05%的胰蛋白酶消化，2 d傳代1次。

1.3.2 qPCR 使用TRIzol裂解液裂解組織，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實時熒光定量PCR檢測各基因mRNA的表達(dá)，相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量PCR引物見表1。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qPCR

1.3.3 Western印跡法 取小鼠晶狀體組織，用RIPA裂解液充分裂解后，進(jìn)行BCA定量和蛋白質(zhì)變性。得到的蛋白質(zhì)提取物用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上樣并經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉1 h后，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入相應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯影采集蛋白條帶圖，并使用Image J軟件進(jìn)行條帶分析，以β-actin作為內(nèi)參，對條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.3.4 免疫熒光染色 取小鼠晶狀體組織并用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行冰凍切片，或收集SRA01/04細(xì)胞爬片。室溫下，用0.25%(細(xì)胞用0.1%)的Triton-X-100通透細(xì)胞膜10 min，加入2%牛血清蛋白室溫封閉30 min，再加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗去一抗后加上熒光二抗，室溫孵育1 h。加入DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后，用封片劑封片。用徠卡SP8激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 凝膠遷移電泳實驗 提取核蛋白后，按照BCA定量法檢測蛋白含量，來自人αB-晶狀體蛋白(αB-crystallin, CRYAB)基因的野生型探針5′-TGACATCACCATTCCAGAAGCTTCACAAGA-3′，用生物素3′末端DNA標(biāo)記試劑盒標(biāo)記。在25 ℃結(jié)合緩沖液中結(jié)合反應(yīng)20 min。對于競爭性分析，添加額外的400倍摩爾過量的未標(biāo)記野生型探針或平行突變探針5′-TGACATCACCATTACATAAGCTT-AACAAGA-3′。對于HSF4b的EMSA分析，加入HSF4b抗體，每次反應(yīng)2 μL。DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠中通過電泳分離，然后將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，交聯(lián)，化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.3.6 質(zhì)粒構(gòu)建 通過PCR擴增CRYAB啟動子DNA。正向引物為5′-TAGATCAGCTCAGGGTT-CCA-3′，反向引物為5′-CGAAGAACTGGTCGAA-3′。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物亞克隆到pGL3-Luc質(zhì)粒中，酶切位點為NheI/XhoI得到CRYAB啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性的pGL3-CRYAB-Luc質(zhì)粒，并測序驗證。HSF4b敲減使用pTER+載體，shRNA靶序列如下5′-AGTATTTCAAGCATAGCAA-3′。

1.3.7 染色質(zhì)免疫共沉淀 SRA01/04細(xì)胞過轉(zhuǎn)HSF4b質(zhì)粒后，用1%甲醛室溫交聯(lián)，加入終濃度為125 mmol/L的甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng)。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液，置于冰上10 min后離心(離心半徑8 cm，5 000 r/min，5 min)，棄上清液后得到細(xì)胞核沉淀。加入細(xì)胞核裂解緩沖液，將染色質(zhì)超聲至平均長度為0.5～2 kb，離心后(離心半徑8 cm，12 000 r/min，15 min)取上清液，留1/10作為樣品內(nèi)參。用稀釋緩沖液10倍稀釋，經(jīng)1 mg/mL BSA和0.1 mg/mL ssDNA處理的protein A sepharose預(yù)清除后，加入對照IgG或識別特異目的蛋白的抗體在4 ℃混合旋轉(zhuǎn)孵育過夜。加入經(jīng)1 mg/mL BSA和0.1 mg/mL ssDNA處理的protein A sepharose沉淀蛋白-染色質(zhì)復(fù)合物，孵育2 h，洗滌后用10% Chelex-100 beads水溶液95 ℃變性10 min，離心(離心半徑8 cm，12 000 r/min，5 min)獲得俘獲的DNA。通過PCR擴增分析免疫沉淀的DNA片段，正向引物為5′-CGCGCGTGCCTGCTTGGGATTC-3′，反向引物為5′-GAGCGGCTGGGGGGAGTGGA-3′。

1.3.8 雙報告熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性 將SRA01/04細(xì)胞接種在24孔板中，用不同定量的pcDNA3.1-HSF4b(0～400 ng，不足用pc-DNA3.1補齊)、pGL3-CRYAB-Luc(250 ng)和pRL-TK(10 ng)共轉(zhuǎn)染。24 h后，根據(jù)試劑盒說明書，用雙熒光素酶分析系統(tǒng)分析細(xì)胞裂解物，相對熒光素酶活性由pRL-TK活性標(biāo)準(zhǔn)化，用其比值代表轉(zhuǎn)錄因子的活性。

1.3.9 免疫共沉淀 將Dynabeads G磁珠預(yù)先包被鼠源IgG、鼠源抗Vimentin抗體，清洗待用；用RIPA充分裂解晶狀體，離心后(離心半徑8 cm，12 000 r/min，10 min)取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量調(diào)濃度至1 mg/mL，留取1/10總晶狀體蛋白作為樣品內(nèi)參，其余樣品分兩組加入預(yù)包被磁珠中，室溫交聯(lián)1 h，清洗蛋白質(zhì)結(jié)合的磁珠，再洗脫蛋白質(zhì)，將上樣樣品變性后，進(jìn)行Western印跡法分析，使用抗CRYAB抗體作為一抗進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB表達(dá)下調(diào)

CRYAB是晶狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，對維持晶狀體的透明發(fā)揮著重要的作用。本實驗中，首先檢測Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB的表達(dá)情況。通過Western印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，8周齡Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠的晶狀體中，CRYAB表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，并且mRNA水平的變化與蛋白的變化相一致(P<0.05)，見圖1A、B?？紤]到白內(nèi)障發(fā)病的時程等因素可能的影響，對出生后1 d小鼠晶狀體的CRYAB表達(dá)水平也進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，無論在蛋白水平(P<0.05)還是mRNA水平(P<0.05)，Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB的表達(dá)都顯著下調(diào)(圖1C、D)。同時，免疫熒光結(jié)果顯示(圖1E)，CRYAB在出生后1 d的Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中表達(dá)已經(jīng)明顯減少。以上結(jié)果表明，Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB表達(dá)下調(diào)。

圖1 Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB表達(dá)下調(diào)Fig.1 The expression of αB-crystallin in the lens of Hsf4tm1Xyk-knockout mice is down-regulatedA： 8周野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB表達(dá)水平；B： 8周野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB的mRNA表達(dá)水平；C： 出生后第1天野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB的蛋白表達(dá)水平；D： 出生后第1天野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠晶狀體中CRYAB的mRNA表達(dá)水平；E： 出生后第1天野生型和Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠的晶狀體中CRYAB表達(dá)的免疫熒光圖(標(biāo)尺： 100 μm)；數(shù)據(jù)結(jié)果表示為

為了確認(rèn)上述結(jié)果，在體外試驗中，利用HSF4b過表達(dá)和HSF4敲減兩種方式在SRA01/04細(xì)胞中檢測CRYAB的表達(dá)情況?？梢钥吹?，在SRA01/04細(xì)胞中，HSF4b過表達(dá)后，CRYAB蛋白表達(dá)呈上升趨勢，mRNA水平也與其一致(圖2A、B、C)；HSF4敲減后，無論蛋白水平還是mRNA水平，CRYAB的表達(dá)都呈現(xiàn)出下降趨勢(圖2D、E、F)。這與體內(nèi)觀察到的結(jié)果相一致。

圖2 HSF4b能夠在體外影響CRYAB的表達(dá)Fig.2 Effects on CRYAB expression by HSF4bA、B： Western印跡法檢測HSF4b過表達(dá)(OE)晶狀體上皮細(xì)胞中HSF4、CRYAB的蛋白表達(dá)水平；C： qPCR檢測HSF4b OE晶狀體上皮細(xì)胞中HSF4、CRYAB的mRNA表達(dá)水平；D、E： Western印跡法檢測shHSF4晶狀體上皮細(xì)胞中HSF4、CRYAB的蛋白表達(dá)水平；F： qPCR檢測shHSF4晶狀體上皮細(xì)胞中HSF4、CRYAB的mRNA表達(dá)水平；數(shù)據(jù)結(jié)果表示為

2.2 HSF4b能直接與CRYAB的啟動子區(qū)結(jié)合并激活表達(dá)

已知HSF4b的主要作用是轉(zhuǎn)錄因子，對CRYAB轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)進(jìn)行了分析和預(yù)測，發(fā)現(xiàn)存在經(jīng)典熱休克調(diào)控元件(heat shock element, HSE)的序列元件。為進(jìn)一步研究HSF4b是否直接可以直接結(jié)合在該區(qū)域，進(jìn)行了凝膠遷移電泳實驗。提取過表達(dá)HSF4b的晶狀體上皮細(xì)胞的核蛋白，CRYAB啟動子區(qū)域含有HSE的序列作為野生型探針，并用突變了HSE的結(jié)合位點堿基作為突變探針(圖3A)。

凝膠遷移實驗的結(jié)果所示(圖3B)： 第1泳道是野生型探針；第2泳道加入了野生型探針以及核蛋白提取物，可以看到有遷移出現(xiàn)，說明野生型探針和核蛋白能夠結(jié)合；第3泳道是冷探針的競爭實驗，第4泳道是突變冷探針的競爭實驗，說明探針結(jié)合位點的特異性，即與預(yù)測的HSE結(jié)合；第5泳道加入了抗HSF4b抗體，有超遷移條帶(supershift)出現(xiàn)，說明探針是特異結(jié)合到HSF4b上。這一凝膠遷移實驗結(jié)果說明，HSF4b可以直接與CRYAB的啟動子HSE區(qū)域結(jié)合。

同時，通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，將過表達(dá)HSF4b的晶狀體上皮細(xì)胞的蛋白與DNA交聯(lián)在一起，而后將交聯(lián)的DNA打成片段化，利用HSF4b的抗體對與HSF4b結(jié)合的DNA進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)CRYAB啟動子區(qū)域能被富集下來，而IgG作為對照卻沒有被富集下來，也表明HSF4b可以直接與CRYAB啟動子相結(jié)合(圖3C)。

圖3 HSF4b直接與CRYAB的啟動子結(jié)合并激活表達(dá)Fig.3 HSF4b is directly bound to the promoter of αB-crystallinA： CRYAB啟動子中假定的HSF4b結(jié)合元件的序列；B： 凝膠遷移實驗結(jié)果；C： 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗結(jié)果；n=3

已經(jīng)確認(rèn)HSF4b可以直接結(jié)合在CRYAB含有HSE元件的區(qū)域。為了檢驗HSF4b對下游CRYAB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的性質(zhì)，構(gòu)建了含HSE元件的CRYAB啟動子區(qū)域的pGL3-CRYAB-Luc載體。將表達(dá)HSF4b的載體和pGL3-CRYAB-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到SRA01/04細(xì)胞中，利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HSF4b對CRYAB基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，在HSF4b存在的情況下，CRYAB啟動子驅(qū)動的熒光素酶活力增強并呈劑量依賴性，表明HSF4b對CRYAB基因的表達(dá)起到轉(zhuǎn)錄激活的作用(圖4)。結(jié)合凝膠遷移實驗和染色質(zhì)共沉淀的實驗結(jié)果，表明HSF4b可以直接結(jié)合到CRYAB啟動子區(qū)域并激活CRYAB的表達(dá)。

圖4 HSF4b對CRYAB的表達(dá)起激活作用Fig.4 HSF4b activates CRYAB expression數(shù)據(jù)結(jié)果表示為

2.3 CRYAB與VIM具有相互作用

課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，HSF4可與VIM啟動子區(qū)結(jié)合并抑制VIM表達(dá)[4]，本實驗通過過表達(dá)HSF4b和敲減HSF4，也呈現(xiàn)出同樣的趨勢。因此，假設(shè)在小鼠白內(nèi)障的晶狀體中，CRYAB與VIM相互作用可能會穩(wěn)定晶狀體穩(wěn)態(tài)。為驗證二者之間是否存在相互作用，利用晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04細(xì)胞對CRYAB和VIM染色后，用Image J軟件對不同顏色強度通道也進(jìn)行了分析，可以看到在核外區(qū)域(藍(lán)色基線區(qū)域)，CRYAB和VIM呈現(xiàn)出確定的分子間的空間靠近(圖5A、B)。在確定二者在空間上的伴隨分布前提下，使用野生型小鼠晶狀體蛋白樣本進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。沉淀后通過Western印跡法分析，結(jié)果表明CRYAB與VIM具有相互作用(圖5C)。

圖5 CRYAB與VIM具有相互作用Fig.5 αB-crystallin has an interaction with Vimentin in vitro and in vivoA： 晶狀體上皮細(xì)胞中CRYAB、Vimentin共定位表達(dá)的免疫熒光圖及熒光共定位定量分析(標(biāo)尺： 25 μm)；B： 通過Confocal逐層掃描和三維圖像重建得到的立體三維圖像；C： 野生型小鼠晶狀體樣本免疫共沉淀分析；n=3

3 討 論

白內(nèi)障是以眼的晶狀體發(fā)生了影響視覺功能的混濁為特征的眼病，是世界范圍內(nèi)致盲的主要原因之一[5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界受到白內(nèi)障影響的患者高達(dá)9 500萬人，甚至有超過2 500萬成年人和兒童因患有白內(nèi)障而導(dǎo)致失明[6]。根據(jù)發(fā)病時間，白內(nèi)障可簡單分為先天性或年齡相關(guān)性，而在CC患者中，有25%～50%的病例是由遺傳改變引起的[3]。CC缺陷與編碼各種晶狀體蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、間隙連接蛋白及相關(guān)功能轉(zhuǎn)錄因子的基因突變有關(guān)[7]。有研究報道，在小鼠中靶向HSF4的缺失會導(dǎo)致晶狀體纖維細(xì)胞缺陷和白內(nèi)障，表明HSF4與晶狀體發(fā)育密不可分[8]。

HSF4屬于熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族的成員在維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、介導(dǎo)細(xì)胞分化和發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用[9]。近年來，針對HSF4在晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障發(fā)生的研究受到更多重視。根據(jù)對中國人群的調(diào)查，包含CRYAB、Hsf4等18個基因被篩選為CC的候選基因[10]。HSF4可以通過結(jié)合啟動子中的HSE來介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)[11]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠全部發(fā)生白內(nèi)障，此外存在有眼球和晶狀體均較小、虹膜粘連、晶狀體囊膜破裂、前房深且有溢出物等眼部并發(fā)癥[4,8]。這些并發(fā)癥可能與晶狀體整體發(fā)育異常有關(guān)。越來越多的研究顯示，HSF4在晶狀體發(fā)育過程中是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，表示為兩個交替轉(zhuǎn)錄的同工型HSF4a和HSF4b。鑒于僅HSF4b在晶狀體中表達(dá)，本研究僅對突變型HSF4b亞型進(jìn)行了評估[12]，并對HSF4b調(diào)控晶狀體發(fā)育的機制進(jìn)行了深入研究。

在研究HSF4b導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的機制時，尋找HSF4b的下游靶基因至關(guān)重要，尤其是在HSF4b在調(diào)節(jié)晶狀體纖維細(xì)胞分化中起到的作用。VIM是HSF4b的下游靶蛋白之一。HSF4缺失后，晶狀體內(nèi)VIM呈現(xiàn)出表達(dá)增強，導(dǎo)致晶狀體細(xì)胞脫核過程異常，誘發(fā)晶狀體發(fā)育異常和白內(nèi)障的發(fā)生[4]。而本研究關(guān)注的CRYAB是晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白之一，在晶狀體中廣泛表達(dá)。以往遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CRYAB突變可以以顯性遺傳或者隱形遺傳的方式引起CC，因此被認(rèn)為是遺傳性白內(nèi)障的重要相關(guān)基因之一[13-14]。在分子功能層面上，大量體外試驗證明，CRYAB缺失會影響細(xì)胞內(nèi)對蛋白分子的自組裝相關(guān)的穩(wěn)態(tài)維持，例如淀粉樣蛋白聚集體的形成和細(xì)胞的衰老[15]；在其他組織中還可以保護(hù)肌動蛋白微絲的完整性，免受細(xì)胞外應(yīng)激的影響[16-17]。

本研究通過系列實驗，證明了CRYAB是HSF4b下游靶分子之一。HSF4b能夠直接結(jié)合在CRYAB基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的HSE元件上，并激活CRYAB的表達(dá)。在Hsf4tm1Xyk基因敲除小鼠中，由于HSF4b的缺失，引起CRYAB表達(dá)激活減少，導(dǎo)致CRYAB表達(dá)減低；繼而，CRYAB基礎(chǔ)表達(dá)量的減低，損傷了維持晶狀體的結(jié)構(gòu)蛋白和維持其透明性的能力。這一結(jié)果說明，HSF4b對CRYAB的激活作用在晶狀體正常發(fā)育過程中是必不可少的。CRYAB表達(dá)減少，是HSF4基因敲除小鼠以及HSF4突變患者異常晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障形成的分子機制之一。

VIM是之前發(fā)現(xiàn)的另一個HSF4b的下游靶分子，HSF4b對VIM的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制作用。有體外試驗證明，CRYAB以ATP不依賴的方式極大地抑制了GFAP和VIM的體外組裝，并且該抑制也獨立于CRYAB多肽的磷酸化狀態(tài)[18]。基于這一體外試驗的假設(shè)，本研究進(jìn)一步證實，HSF4b能夠調(diào)控二者的表達(dá)，HSF4的缺失可以引起CRYAB的減少與VIM的升高，二者共同作用導(dǎo)致VIM組裝增強，影響晶狀體細(xì)胞正常分化過程中的脫核過程[4]，導(dǎo)致晶狀體發(fā)育異常和白內(nèi)障的發(fā)生。

在晶狀體發(fā)育與白內(nèi)障的發(fā)生過程中，CRYAB是HSF4b的重要靶基因之一。HSF4b對CRYAB的表達(dá)調(diào)控和CRYAB與VIM的相互作用都可以作為白內(nèi)障的干預(yù)治療靶點，為今后研發(fā)治療白內(nèi)障的藥物和基因治療等非手術(shù)治療提供了理論依據(jù)。