張民秀 謝芝勛 謝志勤 謝麗基 張艷芳 鄧顯文 曾婷婷 范晴 羅思思 黃嬌玲

摘要：【目的】建立同時鑒別ALV和CIAV的二重熒光環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法，為臨床上快速診斷及有效防控ALV和CIAV的單一或混合感染提供技術(shù)支持?！痉椒ā繀⒖糀LV（A亞群、B亞群、C亞群、D亞群和J亞群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列，設(shè)計2套用于LAMP的特異性引物，并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆蓋區(qū)域分別設(shè)計雙標記探針[ALV-Probe（5'端標記FAM熒光基團，3'端標記BHQ3淬滅基團）和CIAV-Probe（5'端標記CY5熒光基團，3'端標記BHQ3淬滅基團）]。在Loopamp LA-320C實時濁度儀中反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于多色熒光系統(tǒng)內(nèi)進行觀察分析;并通過特異性試驗、靈敏度試驗及臨床樣品檢測驗證二重熒光LAMP檢測方法的適用性和可靠性。【結(jié)果】優(yōu)化后的二重熒光LAMP反應(yīng)體系20.0 μL：DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40.0 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.4 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.4 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，以ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：62 ℃反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。建立的二重熒光LAMP檢測方法能特異性同時檢測ALV和CIAV，對其他禽類病原體無特異性擴增;檢測CIAV和ALV單一模板的下限均為102拷貝/?L，檢測混合模板時ALV的檢測下限為102拷貝/?L、CIAV的檢測下限為103拷貝/?L。應(yīng)用建立的二重熒光LAMP檢測方法對13份咽喉和泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，其檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果的吻合率達100%?！窘Y(jié)論】建立的二重熒光LAMP檢測方法能實現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)鑒別診斷ALV和CIAV，具有特異性好、敏感性高及污染風險小等優(yōu)點，且檢測結(jié)果可通過多色熒光系統(tǒng)進行肉眼觀察，適用于ALV和CIAV的臨床快速篩查。

關(guān)鍵詞： 禽白血病病毒（ALV）;雞傳染性貧血病毒（CIAV）;二重熒光LAMP;探針;特異性;敏感性

中圖分類號： S854.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-2007-08

A duplex fluorescence LAMP assay for identification of avian leukosis virus and chicken infectious anemia virus

ZHANG Min-xiu， XIE Zhi-xun*， XIE Zhi-qin， XIE Li-ji， ZHANG Yan-fang，

DENG Xian-wen， ZENG Ting-ting， FAN Qing， LUO Si-si， HUANG Jiao-ling

（Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，

Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To establish a duplex fluorescence loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method for simultaneous identification of avian leukosis virus（ALV） and chicken infectious anemia virus（CIAV）， and provide technical support for clinical rapid diagnosis and effective prevention and control of single or mixed infections of ALV and CIAV. 【Method】According to the conserved sequences of the ALV（A， B， C， D and J subgroups） pol gene and the CIAV VP2 gene， two sets of specific primers were designed for LAMP，and a double labeled probe was designed in the areas covered by F1c and B1c of ALV and CIAV sequences， respectively[ALV-probe （5' end was labeled with a FAM fluorescent dye， 3' end was labeled with a BHQ3 quencher dye） and CIAV- probe （5' end was labeled with a CY5 fluorescent dye， 3' end was labeled with BHQ3 quencher dye）]. After the reaction in the Loopamp LA-320C turbidimeter， the results could be observed in the polychromatic fluorescence system. The applicability and reliability of the duplex fluorescence LAMP test method were validated by specificity testing， sensitivity testing， and clinical sample testing. 【Result】The duplex fluorescence LAMP was optimized in 20 μL volume containing DNA /cDNA template 2.0 μL， 2×Reaction Mix 10.0 μL， Bst DNA polymerase 0.8 μL， internal primers ALV-FIP， ALV-BIP， CIAV-FIP and CIAV-BIP （working concentration 40.0 μmol/L） 0.8 μL each. External primers were ALV-F3， ALV-B3， CIAV-F3 and CIAV-B3（working concentration 5.0 μmol/L） 0.4 μL each. ALV-Probe（working concentration 0.5 μmol/L） 0.4 μL ， CIAV-Probe（working concentration 0.5） μmol/L） 0.8 μL ， making up to 20.0 μL volume with ddH2O. Amplification procedure： the reaction mixture was incubated at 62 ℃ for 60 min and inactivation at 80 ℃ for 5 min. The results showed that duplex LAMP detection method could simultaneously detect ALV and CIAV， and had no specific amplification for other avian pathogens; the minimum detection limit of single template of CIAV and ALV in sensitivity test were 102 copies/?L. The minimum detection limit of mixed template in sensitivity test was 102 copies/?L for ALV and 103 copies/?L for CIAV; 13 throat and cloacal swabs were detected by the duplex fluorescence LAMP. The results were consistent with those of ALV and CIAV by single PCR me-thods， and the coincidence rate was 100%. 【Conclusion】The duplex fluorescence LAMP method for simultaneous detection of ALV and CIAV in this study has the advantages of good specificity， high sensitivity and low pollution. The detection results can be observed by naked eyes in the polychromatic fluorescence system， which is applicable for rapid clinical screening of ALV and CIAV.

Key words： avian leukosis virus（ALV）; chicken infectious anemiavirus（CIAV）; duplex fluorescence LAMP; probe; specificity; sensitivity

Foundation item：Guangxi Science Base and Talents Special Project（Guike AD17195083）; Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA17204057）; Guangxi Bagui Scholars Project（2019-79）; National 10000 Talents Plan for Leading Talents in Scientific and Technological Innovation（W02060083）

0 引言

【研究意義】目前，養(yǎng)殖雞群中免疫抑制性病毒二重及多重感染的現(xiàn)象普遍存在。禽白血病（Avian leukosis，AL）和雞傳染性貧血（Chicken infectious anemia，CIA）是常見的雞免疫抑制病，引起這2種疾病的病原體分別是禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）和雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV），二者共同感染時能顯著降低疫苗的免疫效果，造成雞群無法有效抵抗其他病毒感染而繼發(fā)相關(guān)疾病，繼而影響雞群健康及其養(yǎng)殖經(jīng)濟效益（于帥，2015;李鑫，2016）。我國的養(yǎng)殖雞群普遍存在CIAV感染，且常與ALV、馬立克氏病病毒（MDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）等共同感染，其中CIAV與ALV共同感染的陽性率高達10.8%（王仙等，2017）。此外，禽類弱毒疫苗中存在CIAV和ALV污染，給養(yǎng)禽業(yè)的安全健康生產(chǎn)帶來巨大威脅（胡曉苗等，2014;房立春等，2016）。因此，建立一種快速鑒別檢測CIAV和ALV的方法，對凈化及控制CIAV和ALV感染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是將LAMP反應(yīng)試劑混合后，在等溫（60～65 ℃）條件下進行核酸擴增，其結(jié)果通過肉眼觀察產(chǎn)物的渾濁度、濁度儀檢測反應(yīng)混合物的沉淀濁度或目測擴增產(chǎn)物是否發(fā)出熒光即可判斷，具有快速、簡便和敏感等優(yōu)點（林文慧等，2015;侯謙等，2020）。在我國已有許多學者運用該技術(shù)建立針對禽類單一病原體的LAMP檢測方法（康忠惠，2011;Peng et al.，2011;Xie et al.，2014;Luo et al.，2015;黃海超等，2018），包括針對ALV和CIAV的單重LAMP檢測方法（鄧顯文等，2011;康忠惠，2011;劉業(yè)兵等，2011;黃海超等，2018）;同時開發(fā)出針對多種病原體的二重及多重LAMP檢測方法（姜侃等，2015;Nyan and Swinson，2015;范晴等，2017;李森等，2018）。Mahony等（2013）通過設(shè)計3套鑒別H1亞型、H3亞型和B型人流感病毒的LAMP引物，反應(yīng)混合物放入熒光PCR儀內(nèi)進行反應(yīng)，根據(jù)熒光定量PCR熔解曲線的熔解溫度差異可鑒定區(qū)分不同病原體。姜侃等（2015）基于LAMP-熔解曲線診斷成功建立了鑒別食源性沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的二重LAMP檢測方法。Nyan和Swinson（2015）成功建立了鑒別人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、戊型肝炎病毒（HEV）、登革熱病毒（DENV）和西尼羅河病毒（WNV）的多重LAMP診斷方法，通過在每個靶序列的B2和B1c間設(shè)計1條與靶序列互補的雙標記探針，擴增產(chǎn)物在紫外燈下發(fā)光，因此通過電泳可觀察不同病毒形成的梯形條帶差異進行判斷。范晴等（2018）通過設(shè)計鑒別口蹄疫病毒（FMDV）和水泡性口炎病毒（VSV）的LAMP引物套，并分別在FMDV和VSV的內(nèi)引物（FIP）5'端引入不同發(fā)射波長的熒光基團，反應(yīng)結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行電泳并置于多色熒光成像系統(tǒng)下分析，根據(jù)不同目標病原體產(chǎn)物發(fā)出的熒光顏色進行判定。Suzuki等（2018）在不同病毒的環(huán)引物5'端引入不同發(fā)射波長的熒光基團，并于反應(yīng)前在管蓋內(nèi)側(cè)加入陽離子多聚物聚乙烯亞胺，反應(yīng)結(jié)束后顛倒反應(yīng)管使管底的特異性產(chǎn)物與陽離子多聚物聚乙烯亞胺聚合，短暫離心后，管底產(chǎn)生不同顏色沉淀，根據(jù)在紫外光產(chǎn)生的沉淀顏色即可鑒定區(qū)分病原體。方慶等（2020）嘗試在F1c和B1c覆蓋的區(qū)域設(shè)計1條雙標記探針，成功建立了雞細小病毒（ChPV）熒光LAMP檢測方法，只需將反應(yīng)后的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)下觀察，若反應(yīng)管出現(xiàn)相應(yīng)的熒光則判定為陽性，能減少開蓋帶來的污染風險。【本研究切入點】鑒于LAMP檢測方法具有快速、簡便和敏感等優(yōu)點，已開發(fā)出針對ALV和CIAV的單重LAMP檢測方法（鄧顯文等，2011;黃海超等，2018），但至今未見針對ALV和CIAV二重LAMP檢測方法的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在LAMP檢測方法中引入雙標記探針引物，建立能同時鑒別ALV和CIAV的二重熒光LAMP檢測方法，為臨床上快速診斷及有效防控ALV和CIAV的單一或混合感染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5（Duck/HK/313/78）和H7亞型（Duck/HK/47/76）cDNA由香港大學惠贈，雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）AV6株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，禽脊髓腦炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）AE1163株由美國康乃狄格大學惠贈，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）GX6/02株、H9亞型AIV（Duck/Guangxi/1/00）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）S1133株、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）2012001-1株、禽傳染性支氣管病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）GXIB/02株、雞馬立克病病毒（Mareks disease virus，MDV）2012006-1株、禽4型腺病毒（Fowl adenovirus group 4，F(xiàn)AdV-4）GX2018001株、ALV A亞群GX11 0521株、B亞群GX111230株和J亞群2012004-C5株及CIAV GXC060821株由廣西獸醫(yī)研究所保存提供。13份臨床樣品來源于廣西某規(guī)?；u場采集的咽喉和泄殖腔拭子，經(jīng)普通PCR鑒定，陽性樣品送至華大基因生物科技（深圳）有限公司測序。按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明提取不同病毒和臨床樣品的RNA或DNA，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA/DNA模板-20 ℃保存?zhèn)溆?。LAMP DNA擴增試劑盒和Loopamp LA-320C實時濁度儀購自榮研生物科技（中國）有限公司，EasyPure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，NanoDrop2000核酸測定儀購自Thermo Fisher Scientific公司，多色熒光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1. 2 引物和探針設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中ALV（A、B、C、D和J亞群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列，利用MEGA 4.0和Primer Explorer V4設(shè)計LAMP引物，其中，外引物包括ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3，內(nèi)引物包括ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP，內(nèi)引物FIP=F1c+F2，BIP=B1c+B2。利用Primer Premier 5.0在ALV和CIAV的F1c和B1c覆蓋區(qū)域分別間設(shè)計1條探針，即ALV-Probe（5'端標記FAM熒光基團，3'端標記BHQ3淬滅基團）和CIAV-Probe（5'端標記CY5熒光基團，3'端標記BHQ3淬滅基團）。引物和探針序列如表1所示，引物委托華大基因生物科技（深圳）有限公司合成，探針委托寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司合成。同時基于ALV的env基因和CIAV的VP2基因，合成特異性引物：ALV-F（5'-GGATGAGGTGACTA AGAAAG-3'）和ALV-R（5'-CGAACCAAAGGTAAC ACACG-3'），擴增片段長度545 bp;以及CIAV-F（5'-CTAAGATCTGCAACTGCGGA-3'）和CIAV-R（5'-CCTTGGAAGCGGATAGTCAT-3'），擴增片段長度441 bp。特異性引物委托華大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1. 3 陽性質(zhì)粒標準品制備

使用外引物ALV-F3/ALV-B3和CIAV-F3/CIAV-B3對陽性ALV cDNA和CIAV DNA模板進行截短目的基因擴增，目的片段長度分別為217和201 bp，將PCR擴增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。利用NanoDrop 2000紫外分光光度計測量ALV和CIAV的陽性重組質(zhì)粒濃度，再根據(jù)分子量及濃度計算拷貝數(shù)。

1. 4 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.8 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，ddH2O補足至20.0 μL。同時設(shè)空白對照，以無RNAase水為模板加入反應(yīng)管中。將反應(yīng)管置于Loopamp LA-320C實時濁度儀中調(diào)整反應(yīng)溫度（60、61、62、63和64 ℃）反應(yīng)60 min，以確定最佳反應(yīng)溫度，80 ℃滅活5 min，試驗結(jié)束后將反應(yīng)管直接置于多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)進行判定。

確定最佳反應(yīng)溫度后，按ALV-FIP/ALV-BIP∶CIAV-FIP/CIAV-BIP∶ALV-F3/ALV-B3∶CIAV-F3/CIAV-B3∶ALV-Probe∶CIAV-Probe不同比例進行引物濃度優(yōu)化，不同比例的引物終濃度（μmol/L）分別為1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.02∶0.02、1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.02和1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.01;按最佳反應(yīng)溫度在Loopamp LA-320C實時濁度儀中進行反應(yīng)，根據(jù)實時濁度儀擴增曲線效果及反應(yīng)管在多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)的成像效果確定引物最佳濃度及其比例。

1. 5 二重熒光LAMP結(jié)果判定

二重熒光LAMP在實時濁度儀反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)，選擇多通道凝膠成像。由于ALV-Probe 5'端標記的熒光基團為FAM，通道1選擇520 nm為發(fā)射波長，ALV陽性產(chǎn)物反應(yīng)管在該通道顯示綠色熒光，而陰性對照管無綠色熒光;CIAV-Probe 5'端標記的熒光基團為CY5，通道2則選擇670 nm發(fā)射波長，CIAV陽性產(chǎn)物反應(yīng)管在該通道下顯示紅色熒光，而陰性對照管無紅色熒光;當反應(yīng)管中既有ALV陽性擴增產(chǎn)物又有CIAV陽性擴增產(chǎn)物時，反應(yīng)管在2個通道下均能發(fā)出熒光，且反應(yīng)管顯示橘黃色。

1. 6 二重熒光LAMP特異性試驗

根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴增程序，逐一將陽性ALV（A亞群、B亞群和J亞群）、CIAV、ALV及CIAV混合模板，以及FAdV-4、ARV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AEV、REV、IBV、IBDV和MDV的cDNA/DNA模板加入LAMP反應(yīng)體系中，以驗證二重熒光LAMP的特異性。

1. 7 二重熒光LAMP靈敏度試驗

1. 7. 1 單一病原體模板檢測的靈敏度分析 制備好的ALV和CIAV陽性重組質(zhì)粒按計算出的拷貝數(shù)，分別梯度稀釋為106、105、104、103、102、101和100拷貝/?L。根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴增程序，取不同濃度的重組質(zhì)粒2.0 ?L依次加入反應(yīng)管中，混勻后置于Loopamp LA-320C實時濁度儀中進行反應(yīng)。

1. 7. 2 2種病原體模板同時檢測的靈敏度分析

將ALV和CIAV陽性重組質(zhì)粒等量混合，然后梯度稀釋為106、105、104、103、102、101和100拷貝/?L，根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴增程序，取不同濃度的重組質(zhì)粒2.0 ?L依次加入反應(yīng)管中，混勻后置于Loopamp LA-320C實時濁度儀中進行反應(yīng)。

1. 8 臨床樣品檢測

使用建立的二重熒光LAMP對13份臨床樣品（咽喉和泄殖腔棉拭子）進行檢測，將檢測結(jié)果與這2種病毒的常規(guī)PCR檢測結(jié)果進行比較，以驗證二重熒光LAMP的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 二重熒光LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

將含20.0 ?L反應(yīng)混合物的反應(yīng)管置于Loopamp LA-320C實時濁度儀中，分別于60、61、62、63和64 ℃下反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。結(jié)果顯示，當反應(yīng)溫度為62 ℃時，濁度儀曲線圖的空白對照未起峰，且ALV和CIAV在此溫度下最早進入指數(shù)增長期，因此確定最佳反應(yīng)溫度為62 ℃。ALV-FIP/ALV-BIP∶CIAV-FIP/CIAV-BIP∶ALV-F3/ALV-B3∶CIAV-F3/CIAV-B3∶ALV-Probe∶CIAV-Probe的最佳終濃度（μmol/L）比例為1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.02。

優(yōu)化后的二重熒光LAMP反應(yīng)體系20.0 μL：DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40.0 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.4 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.4 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，以ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：62 ℃反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。

2. 2 二重熒光LAMP檢測方法特異性試驗結(jié)果

特異性試驗結(jié)果顯示，建立的二重熒光LAMP檢測方法僅擴增出陽性ALV（A亞群、B亞群和J亞群混合模板）的cDNA和CIAV的DNA，部分擴增結(jié)果如圖1所示。ALV陽性反應(yīng)管在520 nm通道下呈綠色熒光，CIAV陽性反應(yīng)管在670 nm通道下呈紅色熒光，ALV和CIAV混合模板在2個通道下均呈現(xiàn)出相應(yīng)的熒光，混合色呈橘黃色，而其他病毒和空的對照均未擴增出任何產(chǎn)物及發(fā)出熒光（圖2）。

2. 3 二重熒光LAMP檢測方法敏感性試驗結(jié)果

采用建立的二重熒光LAMP檢測方法分別檢測單模板ALV和CIAV的敏感性，實時濁度儀監(jiān)測結(jié)果顯示，單獨檢測ALV cDNA模板或CIAV DNA模板的下限均為102拷貝/?L（圖3-A和圖4-A），將實時濁度儀反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)中，熒光結(jié)果也顯示在單模板存在的情況下，2種病原體的最低檢測下限均為102拷貝/?L（圖3-B和圖4-B）。同時檢測ALV cDNA模板和CIAV DNA模板時，ALV的檢測下限為102拷貝/?L，CIAV的檢測下限為103拷貝/?L（圖5）。

2. 4 二重熒光LAMP檢測方法的臨床應(yīng)用效果

采用建立的二重熒光LAMP檢測方法對13份臨床樣品進行檢測，其檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果的吻合率達100%。13份臨床樣品中，有5份樣品為CIAV單一感染，有1份樣品為ALV單一感染，有1份樣品為ALV和CIAV混合感染（圖6）。

3 討論

LAMP具有檢測快速、敏感度高、特異性好且無需特殊儀器等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床病原診斷（Peng et al.，2011;彭宜等，2013;Xie et al.，2014;Luo et al.，2015），但至今應(yīng)用較成熟的均為單重LAMP檢測方法。近年來，多重LAMP檢測技術(shù)的開發(fā)成為鑒別不同動物病原體的研究熱點（姜侃等，2015;Nyan and Swinson，2015;范晴等，2017;李森等，2018）。常規(guī)LAMP檢測結(jié)果的判定主要依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物直接凝膠電泳觀察梯形條帶、實時濁度儀形成的副產(chǎn)物磷酸鎂曲線、肉眼判斷白色沉淀及擴增產(chǎn)物加入熒光顯色劑顯色等方法，但這些方法均不能準確地對多重病原體進行鑒別診斷。目前，國內(nèi)研究報道能實現(xiàn)真正意義上鑒別診斷的多重LAMP有3種方法：①基于擴增產(chǎn)物酶切處理的特異序列識別法，通過在LAMP內(nèi)引物中引入限制性內(nèi)切酶位點，在進行恒溫擴增完畢后對擴增產(chǎn)物進行酶切處理，然后根據(jù)酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中的不同位置來區(qū)分不同產(chǎn)物，但該方法耗時較長，且需要開蓋處理產(chǎn)物，增加了擴增產(chǎn)物對實驗室污染的風險（范晴等，2017）。②依賴于熒光PCR檢測儀，根據(jù)擴增產(chǎn)物熔解曲線出現(xiàn)特征峰的不同熔解溫度判斷病原體，但該方法可能由于同一病原體不同來源模板其擴增產(chǎn)物的熔解溫度不同，而導致判斷結(jié)果出現(xiàn)偏差，具有一定的局限性（姜侃等，2015）。③在內(nèi)引物FIP的5'端引入不同發(fā)射波長的熒光基團，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后能在不同發(fā)射波長通道下發(fā)出不同熒光，而以此區(qū)分不同病原體，但該方法也需開蓋電泳，易造成實驗室污染（范晴等，2018）。

在參考方慶等（2020）建立雞細小病毒（ChPV）熒光LAMP檢測方法的基礎(chǔ)上，本研究通過在ALV和CIAV靶基因上的F1c和B1c引物間設(shè)計攜帶不同熒光基團的雙標記探針，依靠靶基因不斷擴增導致探針不斷裂解，將帶有陽性擴增產(chǎn)物的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)中，陽性擴增產(chǎn)物在相應(yīng)的發(fā)射波長通道內(nèi)發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色能準確判定病原體，具有以下優(yōu)點：①設(shè)計的探針只與特異性模板發(fā)生雜交，增加了反應(yīng)的特異性，避免假陽性;②檢測反應(yīng)只需60 min，且可在水浴鍋內(nèi)完成反應(yīng)，反應(yīng)敏感高效;③無需開蓋即能準確判定結(jié)果，污染風險小。本研究采用2種熒光基團（FAM和CY5），但這2種熒光基團的發(fā)射波長不同，分別是520和670 nm，在完成LAMP反應(yīng)后只需將反應(yīng)管置于多色熒光系統(tǒng)內(nèi)進行觀察，在520 nm通道下能觀察到ALV陽性反應(yīng)管呈綠色熒光，在670 nm通道下能觀察到CIAV陽性反應(yīng)管呈紅色熒光，二者互不干擾，而其他病毒和空白對照均不發(fā)光，因此能準確判斷檢測結(jié)果。由于二重熒光LAMP檢測方法涉及到熒光探針，其價格相對較高，加之二重LAMP檢測方法需配備多色熒光系統(tǒng)才能進行觀察判定，也增加檢測成本，因此該方法不易在基層和現(xiàn)場推廣引用。

4 結(jié)論

建立的二重熒光LAMP檢測方法能實現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)鑒別診斷ALV和CIAV，具有特異性好、敏感性高及污染風險小等優(yōu)點，且檢測結(jié)果可通過多色熒光系統(tǒng)進行肉眼觀察，適用于ALV和CIAV的臨床快速篩查。

參考文獻：

鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，劉加波，龐耀珊，謝麗基，彭宜，范晴. 2011. 雞傳染性貧血病毒病LAMP快速可視化檢測方法的建立[J]. 家畜生態(tài)學報，32（6）：57-60. doi：10.3969/j.issn.1673-1182.2011.06.011. [Deng X W，Xie Z X，Xie Z Q，Liu J B，Pang Y S，Xie L J，Peng Y，F(xiàn)an Q. 2011. Development of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for visual detection of chicken infectious anemia[J]. Acta Ecologae Animalis Domastici，32（6）：57-60.]

范晴，謝芝勛，謝志勤，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基，黃莉. 2017. 口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鑒別檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學報，37（10）：1829-1834. doi：10.16303/j.cnki.1005-4545.2017.10.03. [Fan Q，Xie Z X，Xie Z Q，Pang Y S，Deng X W，Xie L J，Huang L. 2017. Development of duplex reverse transcription loop-media-ted isothermal amplification assay for detection of foot-and-mouth disease virus and vesicular stomatitis virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（10）：1829-1834.]

范晴，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王盛，羅思思，鄧顯文，劉加波. 2018. 二重熒光RT-LAMP方法鑒別檢測口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，49（5）：996-1004. doi：10.11843/j.issn.0366-6964. 2018.05.014. [Fan Q，Xie Z X，Xie Z Q，Xie L J，Huang J L，Zhang Y F，Zeng T T，Wang S，Luo S S，Deng X W，Liu J B. 2018. Development of a duplex fluorescence-based reverse transcript loop-mediated isothermal amplification assay for detection of foot-and-mouth disease virus and vesicular stomatitis Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，49（5）：996-1004.]

方慶，謝芝勛，張艷芳，張民秀，羅思思，謝麗基，范晴，曾婷婷，黃嬌玲，鄧顯文，謝志勤，劉加波. 2020. 雞細小病毒熒光LAMP檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，50（4）：412-416. doi：10.16656/j.issn.1673-4696.2020.0059. [Fang Q，Xie Z X，Zhang Y F，Zhang M X，Luo S S，Xie L J，F(xiàn)an Q，Zeng T T，Huang J L，Deng X W，Xie Z Q，Liu J B. 2020. Establishment of fluorescence LAMP for detection of chicken parvovirus[J]. Veterinary Science in China，50（4）：412-416.]

房立春，李曉晗，任志浩，李陽，王一新，崔治中，常爽，趙鵬. 2016. 弱毒疫苗中雞傳染性貧血病毒低劑量污染對SPF雞體重和疫苗免疫抗體的影響[J]. 病毒學報，32（2）：190-194. doi：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002906. [Fang L C，Li X H，Ren Z H，Li Y，Wang Y X，Cui Z Z，Chang S，Zhao P. 2016. Effect of low dose of chicken infectious anemia virus in attenuated vaccine on SPF chicken body weight and vaccine immune antibody[J]. Chinese Journal of Virology，32（2）：190-194.]

侯謙，代軍飛，張杰. 2020. LAMP的發(fā)展及在口蹄疫診斷中的應(yīng)用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，32（6）：99-104. doi：10.19386/j.cnki.jxnyxb.2020.06.18. [Hou Q，Dai J F，Zhang J. 2020.Development of LAMP and its application indiagnosis of foot-and-mouth disease[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，32（6）：99-104.]

胡曉苗，沈?qū)W懷，戴銀，趙瑞宏，侯宏艷，潘孝成，周學利，張丹俊，朱傳明. 2014. PCR法檢測活毒疫苗中禽白血病病毒污染[J]. 中國獸醫(yī)雜志，50（9）：23-25. doi：10.3969/j.issn. 0529-6005.2014.09.007. [Hu X M，Shen X H，Dai Y，Zhao R H，Hou H Y，Pan X C，Zhou X L，Zhang D J，Zhu C M. 2014. Study on PCR method for the detection of avian leukemia virus pollution in live vaccines[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，50（9）：23-25.]

黃海超，陳軒，楊素，趙海燕，曹偉勝，邵建宏，趙福振，沙才華，李忠. 2018. 禽白血病病毒K亞群RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，48（2）：161-166. doi：10.16656/ j.issn.1673-4696.2018.0025. [Huang H C，Chen X，Yang S，Zhao H Y，Cao W S，Shao J H，Zhao F Z，Sha C H，Li Z. 2018. Development of RT-LAMP method for the detection of avian leukosis virus subgroup K[J]. Chinese Ve-terinary Science，48（2）：161-166.]

姜侃，張慧，汪新，劉鵬鵬，黃建鋒，周志南. 2015. 多重LAMP—熔解曲線法檢測食品中兩種食源性致病菌[J]. 食品與機械，31（2）：92-97. doi：10.13652/j.issn.1003-5788.2015. 02.018. [Jiang K，Zhang H，Wang X，Liu P P，Huang J F，Zhou Z N. 2015. Development of multiplex LAMP combined with melting curves analysis for detection of two kinds of food borne pathogens[J]. Food & Machinery，31（2）：92-97.]

康忠惠. 2011. A、B亞群禽白血病病毒LAMP檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學. doi：10.7666/d.y1973658. [Kang Z H. 2011. Development and preliminary application of loop-mediated isothermal amplification（LAMP） for the detection of avian leukosis virus subgroup A and B[D]. Harbin：Northeast Agricultural University.]

李森，王源升，余紅偉，李瑜，夏革清. 2018. 三種食源性致病菌的多重LAMP檢測方法研究[J]. 海軍工程大學學報，30（1）：75-79. doi：10.7495/j.issn.1009-3486.2018.01.015. [Li S，Wang Y S，Yu H W，Li Y，Xia G Q. 2018. Deve-lopment of multiplex loop-mediated isothermal amplification assays to detect three kinds of food-borne pathogens[J]. Journal of Naval University of Engineering，30（1）：75-79.]

李鑫. 2016. 禽白血病病毒及雞傳染性貧血病病毒對禽流感疫苗免疫效果的影響[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院. [Li X. 2016. Impact of avian leukosis virus and chicken infection anemia virus on the avian influenza vaccine[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]

林文慧，鄒秉杰，宋沁馨，周國華. 2015. 多重環(huán)介導等溫擴增技術(shù)研究進展[J]. 遺傳，37（9）：899-910. doi： 10.16288/j. yczz.15-141. [Lin W H，Zou B J，Song Q X，Zhou G H. 2015. Progress in multiplex loop-mediated isothermal amplification technology[J]. Hereditas（Beijing），37（9）：899-910.]

劉業(yè)兵，張磊，孫躍輝，毛婭卿，立俊平，寧宜寶. 2011. 可視化的RT-LAMP方法檢測禽白血病病毒[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，42（1）：150-156. [Liu Y B，Zhang L，Sun Y H，Mao Y Q，Li J P，Ning Y B. 2011. Visualized detection of avian leukosis virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，42（1）：150-156.]

彭宜，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，范晴，羅思思. 2013. H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術(shù)的建立[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，44（2）：323-327. doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2013.2.323. [Peng Y，Xie Z X，Liu J B，Pang Y S，Deng X W，Xie Z Q，Xie L J，F(xiàn)an Q，Luo S S. 2013. Development of a reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay for visual detection of H5 subtypeavian influenza virus[J]. Journal of Southern Agriculture，44（2）：323-327.]

王仙，閆彩虹，羊揚，金文杰. 2017. 雞傳染性貧血病病毒與三種致家禽腫瘤病毒混合感染的流行病學研究[J]. 中國家禽，39（13）：21-25. doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2017. 13.005. [Wang X，Yan C H，Yang Y，Jin W J. 2017. Epidemiological study of co-infection of chicken infectious anemia virus and three oncogenic viruses[J]. China Poultry，39（13）：21-25.]

于帥. 2015. 四川部分地區(qū)CIAV分子流行病學調(diào)查及CIAV與ALV-J共感染雞對疫苗免疫效果的影響[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學. [Yu S. 2015. Molecular epidemiology of CIAV in some areas of Sichuan and CIAV co-infected with ALV-J affect vaccine effectiveness[D]. Yaan：Sichuan Agricultural University.]

Luo S S，Xie Z X，Xie L J，Liu J B，Xie Z Q，Deng X W，Huang L，Huang J L，Zeng T T，Khan M I. 2015. Reverse-transcription，loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses influenza virusess[J]. Virology Journal，12：145. doi：10.1186/s12985-015-0378-1.

Mahony J，Chong S，Bulir D，Ruyter A，Mwawasi K，Waltho D. 2013. Multiplex loop-mediated isothermal amplification （M-LAMP） assay for the detection of influenza A/H1，A/H3 and influenza B can provide a specimen-to-result diagnosis in 40 min with single genome copy sensitivity[J]. Journal of Clinical Virology，58（1）：127-131. doi：10.1016/j.jcv.2013.06.006.

Nyan D C，Swinson K L. 2015. A novel multiplex isothermal amplification method for rapid detection and identification of viruses[J]. Scientific Reports，5：17925. doi：10.1038/ srep17925.

Peng Y，Xie Z X，Liu J B，Pang Y S，Deng X W，Xie Z Q，Xie L J，F(xiàn)an Q，F(xiàn)eng J X，Khan M I. 2011. Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Virology Journal，8：337.doi：10.1186/1743-422X-8-337.

Suzuki R，Tanaka H，Suzuki K，F(xiàn)ukuta S，Kato S，Ohno T. 2018. Multiplex loop-mediated isothermal amplification assay for the identification of three major whitefly species in the greenhouse[J]. Journal of Applied Entomology，142（8）：745-754. doi：10.1111/jen.12522.

Xie L J，Xie Z X，Zhao G Y，Liu J B，Pang Y S，Deng X W，Xie Z Q，F(xiàn)an Q，Luo S S. 2014. A loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of duck circovirus[J]. Virology Journal，11：76. doi：10.1186/1743-422X-11-76.

（責任編輯 蘭宗寶）