黃 榮，朵 紅，沈秀英，付 永，張學(xué)勇，馬怡雋，陳有錄，郭志宏

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

位于青藏高原北部的青海省由于其特殊的地理位置和氣候環(huán)境條件是人畜共患包蟲病的高發(fā)流行地區(qū)，也是世界上棘球蚴病流行最嚴重的地區(qū)[1]，棘球蚴病嚴重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和廣大牧民群眾的身心健康。青藏高原存在著細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲3種棘球絳蟲，其宿主為犬和野生犬科動物(主要是狐貍和狼)。犬是最重要的終末宿主和傳染源[2-4]，犬棘球絳蟲的感染率高達64.56%[5]，在2012—2016年中國棘球蚴流行區(qū)犬糞棘球絳蟲抗原檢測調(diào)查中，青海省的感染率最高[6]。近年來，青海省政府在全省實施了“月月投藥，犬犬驅(qū)蟲”的措施，有效控制了家養(yǎng)犬、人及家畜棘球絳蟲及棘球蚴的感染。但由于棘球蚴病的傳播，尤其在多房棘球絳蟲和人泡性包蟲病的傳播中，野生犬科動物狐貍是公認的最易感染多房棘球絳蟲的宿主。野生犬科動物，主要捕食各種嚙齒類動物，并且狐貍是犬科動物中活動范圍最廣的一類動物，所以狐貍也是多房棘球絳蟲重要的終末宿主[7]。瑞士和波蘭隨著赤狐數(shù)量的增加，人群中泡性包蟲病(AE)的新增病例不斷上升[8-9]。有關(guān)青藏高原野生犬科動物棘球絳蟲感染調(diào)查的報道很少，尤其是針對野生狐貍棘球絳蟲的防控研究未見報道。本研究通過對野生犬科動物的糞便檢查和動物剖檢，調(diào)查了青海省部分地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲的流行病學(xué)。2014年2月至2018年7月通過對野生狐貍洞穴周邊糞便調(diào)查及驅(qū)蟲，探索了野生狐貍棘球絳蟲的防控方法，為野生動物包蟲病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野外動物糞便收集

在青海省海北藏族自治州海拔高度3 000～4 000 m的祁連縣和海晏縣，青海南部海拔4 000 m以上的玉樹藏族自治州稱多縣和果洛藏族自治州達日縣，野外采集疑似野生動物糞便樣品160 份。-80 ℃冰箱保存2周以上，讓棘球絳蟲蟲卵失活，用蔗糖漂浮法做糞便蟲卵檢查[10]。

1.2 動物剖檢

從2014年2月至2018年7月分別收集了祁連、海晏、稱多、達日4縣的狐貍尸體共67只，從稱多縣收集狼腸道1副。收集到的材料在-80 ℃冰箱保存2周以上，讓棘球絳蟲蟲卵失活。剖檢時進行編號，採取部分肌肉或肝臟用于動物種類鑒定。分段剪取胃腸，翻洗沉淀后收集蟲體并逐條計數(shù)、登記。用PBS 液清洗收集，75%乙醇固定、保存，并進行蟲種鑒定。

1.3 動物種類鑒定

將野外收集的疑似狐貍和狼糞便，在冷凍狀態(tài)下用ASL緩沖液(QIAamp DNA Stool Mini Kit，Qiagen)按文獻[11]報道的方法進行沖洗，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen)提取糞便表面的宿主DNA。對剖檢動物的肌肉或肝臟用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Tokyo，Japan)試劑盒提取DNA。以上提取的DNA在D-loop領(lǐng)域用哺乳動物通用引物 prL(5′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′)和prH(5′-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3′)進行擴增[11]，擴增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.4 蟲體和蟲卵DNA鑒定

將野外收集的動物糞便內(nèi)的蟲卵，按形態(tài)進行分類，分別取20～40個蟲卵用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Tokyo，Japan)試劑盒提取DNA。動物腸道內(nèi)的蟲體也按形態(tài)進行分類，分別採取部分蟲體用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取DNA。對收集的絳蟲在線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ(CO1)領(lǐng)域，用絳蟲通用引物2575(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和 3021(5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)進行擴增[12]，對其他蟲種在ITS2領(lǐng)域，用 LC1(5′-CGAGTATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和HC2(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGG-3′)引物進行擴增[13]，擴增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.5 驅(qū)蟲試驗

1.5.1 驅(qū)蟲藥物

艾普銳克吡喹酮咀嚼片(北京中農(nóng)華威制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號為20161013)。

1.5.2 方法

分別在3處狐貍窩兩邊5～6 m的位置，挖長15～20 cm，高10 cm，深6～9 cm的小洞投放帶誘食劑的驅(qū)絳蟲藥物吡喹酮，第一次用少量的羊肉包裹驅(qū)蟲藥，3 d后進行第二次投放驅(qū)蟲藥，投藥方法同前。第二次投藥10 d后收集周邊狐貍糞便進行棘球絳蟲蟲卵檢查，以后在投藥6個月、1年、2年的時候收集周邊狐貍糞便進行蟲卵檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 野外動物糞便檢查

野外收集到160份疑似犬科動物糞便，經(jīng)DNA鑒定，53份為野生犬科動物糞便，其中9份為紅狐糞便(同源性一致率達98%～100%，GenBank ID：AB292754)，24份為藏狐糞便(同源性一致率達99%～100%，GenBank ID：JF520840)，13份為沙狐糞便(同源性一致率達97%～100%，GenBank ID：KJ140137)，7份為狼糞便(同源性一致率達99%～100%，GenBank ID：KY996529.1)；從53份糞便中檢查出19份感染6種寄生蟲，包括4種絳蟲、1種蛔蟲和1種吸蟲，詳見表1。

表1 野生犬科動物糞便蟲卵檢查結(jié)果表

由表1可知，53份糞便樣品中檢出獅弓首蛔蟲10份，感染率高達18.87%(10/53)，有翼翼形吸蟲和帶狀帶絳蟲的感染率為5.7%(3/53)，稱多縣採集的9份藏狐糞便中，2份檢出石渠棘球絳蟲蟲卵。多房棘球絳蟲的感染率為11.3%(6/53)，其中7份狼糞便中3份為陽性，說明野生犬科動物糞便中多房棘球絳蟲的感染率較高，會造成環(huán)境污染。

2.2 動物剖檢及寄生蟲檢查

剖檢了67只狐貍，經(jīng)DNA鑒定，33只為紅狐、25只為藏狐、9只為沙狐，檢查狼腸道1副。動物種類和腸道寄生蟲感染情況見表2。

表2 野生犬科動物種類及腸道蠕蟲感染調(diào)查結(jié)果表

由表2可知，剖檢的67只狐貍中，海晏縣有紅狐29只、藏狐8只，祁連縣9只均為沙狐，達日縣4只均為紅狐，稱多縣17只均為藏狐。67只狐貍中有60只感染8種寄生蟲，感染率為89.55%(60/67)，狼的小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)101條線中絳蟲(Mesocestoideslitteratus)。線中絳蟲和獅弓首蛔蟲為野生犬科動物腸道寄生蟲的優(yōu)勢蟲種，感染率最高達61.76%(42/68)和36.76%(25/68)，有翼翼形吸蟲的感染率也達17.65%。玉樹州剖檢的17只藏狐中，6只感染石渠棘球絳蟲。多房棘球絳蟲的感染率為13.24%(9/68)，藏狐、紅狐和沙狐均有感染。海晏縣和稱多縣的藏狐中發(fā)現(xiàn)多頭絳蟲。

2.3 驅(qū)蟲藥物投放前后狐貍糞便檢查

藥物投放前分別在3處野生狐貍窩周邊收集了37份疑似狐貍糞便，經(jīng)宿主鑒定11份為藏狐糞便。從11份糞便中發(fā)現(xiàn)獅弓首蛔蟲、多房棘球絳蟲和帶狀帶絳蟲3種寄生蟲蟲卵。第二次投藥后6個月的檢查中又發(fā)現(xiàn)有翼翼形吸蟲卵，1年后糞便中再次出現(xiàn)多房棘球絳蟲蟲卵(表3)。

表3 根據(jù)糞便DNA確定動物種類和糞便蟲卵檢查

3 討論與結(jié)論

據(jù)報道，青海省生息著藏狐和紅狐2種狐貍[14]，但本研究中，通過形態(tài)學(xué)和DNA鑒定認為青海省分布著紅狐、藏狐和沙狐3種狐屬動物，這和馮祚建和龔明昊的報道一致[15-16]。剖檢的67只狐貍，其中60只感染8種寄生蟲，感染率為89.55%(60/67)，在收集到的一份狼小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)101條線中絳蟲(Mesocestoideslitteratus)，說明青藏高原野生犬科動物寄生蟲的感染率和感染強度很高。其中線中絳蟲和獅弓首蛔蟲的感染率最高，分別為 61.76%(42/68)和36.76%(25/68)，是青海省野生犬科動物腸道蠕蟲的優(yōu)勢蟲種。線中絳蟲的感染率高是由于野生狐貍和狼主要捕食中間宿主的小型嚙齒類動物引起的感染。在收集的糞便蟲卵檢查中未發(fā)現(xiàn)線中絳蟲蟲卵，這可能是由于許多線中絳蟲卵在成蟲副子宮器內(nèi)外層形成一個包囊，隨糞便排出的蟲卵也包裹在包囊之中，不易檢出。另外，一般的絳蟲卵也是隨孕節(jié)脫落排出體外，這就決定了蟲卵檢查的局限性。家養(yǎng)犬用吡喹酮驅(qū)蟲后再檢查糞便，能大大提高絳蟲卵的檢出率[17]。在狐貍腸道和糞便蟲卵檢查中檢出了多頭絳蟲及蟲卵，牛羊等反芻動物是多頭絳蟲的中間宿主，多頭蚴主要寄生在腦部，引起牛羊運動機能失調(diào)影響采食，最后導(dǎo)致死亡。野生狐貍可能在草原上采食了感染多頭蚴的牛羊腦部感染了多頭絳蟲。

青海省海北、果洛、玉樹藏族自治州野生狐貍和狼均有多房棘球絳蟲感染，糞便檢查和動物解剖檢查中狐貍的感染率為11.3%和13.42%，經(jīng)SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進行單因素對比分析，兩種檢查結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，說明用糞便檢查的方法能夠代表剖檢法進行野生犬科動物棘球絳蟲的感染調(diào)查。同時，在本次調(diào)查中狼糞便中也發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲蟲卵，狼作為包蟲病的終末宿主，在包蟲病傳播中也是不可忽視的傳染源。本次調(diào)查僅僅在稱多縣的藏狐中發(fā)現(xiàn)石渠棘球絳蟲，石渠棘球絳蟲是否有一定的終末宿主選擇性，有待進一步研究。

野生狐貍棘球絳蟲防控試驗中，使用吡喹酮咀嚼片驅(qū)蟲前在狐貍糞便中檢出多房棘球絳蟲蟲卵，表明該地區(qū)野生狐貍小腸內(nèi)寄生多房棘球絳蟲。在投藥后的6個月內(nèi)糞便中未檢出多房棘球絳蟲蟲卵，說明該藥物有良好的驅(qū)蟲效果，可以作為野生狐貍棘球絳蟲的防控藥物使用。驅(qū)蟲1年后又重新檢出該蟲卵，說明野外存在重復(fù)感染，應(yīng)該定期進行投藥驅(qū)蟲。

隨著生態(tài)環(huán)境的逐步改善和人民群眾對動物保護意識的提高，青藏高原野生動物數(shù)量不斷增加。野生狐貍和狼的活動區(qū)域越來越接近人們的生活范圍，通過野生犬科動物傳播包蟲病的風(fēng)險日趨嚴重，應(yīng)引起足夠重視。