吳聰敏, 馬蘭, 吳永紅, 俞元春*

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 南京 210037；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所， 南京 210008)

生長(zhǎng)素又叫吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，是最早發(fā)現(xiàn)的在自然界中普遍存在的一類(lèi)植物激素[7]。IAA作用機(jī)理分為兩方面，一是使細(xì)胞壁軟化、松弛，增加細(xì)胞的滲透性和可塑性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)；二是促進(jìn)蛋白質(zhì)和RNA合成，增加原生質(zhì)體含量，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。IAA具有多方面的生理效應(yīng)，也具有“雙重作用”，即低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)[9]，可用于植物修復(fù)技術(shù)[10]。有研究報(bào)道，植物和微生物均可產(chǎn)生IAA，如藤黃微球菌[11]、馬鈴薯根際細(xì)菌[12]。IAA可以影響多種微生物的基因表達(dá)[13]，也是微生物與植物相互作用中的一種信號(hào)分子。Sun等[14]將IAA施加于食蟲(chóng)草后發(fā)現(xiàn)，IAA是決定同一生態(tài)位真菌種間競(jìng)爭(zhēng)的主要因素；外源生長(zhǎng)素還能促進(jìn)寄主的病原菌易感性和疾病癥狀發(fā)展[15]。

周叢生物以往都是通過(guò)自然形成過(guò)程和人工采集方式來(lái)富集與培養(yǎng)的，但無(wú)法滿(mǎn)足生態(tài)工程需要。目前已形成較成熟的方法，采用纖維材料富集并使用WC(woods hole culture )培養(yǎng)液作為室內(nèi)培養(yǎng)基對(duì)周叢生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，但由于載體培育出的周叢生物存在生物量小、群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等弊端，在工業(yè)生產(chǎn)等大規(guī)模應(yīng)用中仍具有一定差距。Biology生態(tài)測(cè)試板是一種常用的可表征群落生理特征的方法[16]。目前通過(guò)生態(tài)板來(lái)分析IAA對(duì)周叢生物微生物群落影響的研究較少。本研究利用Biology生態(tài)板分析了不同濃度IAA處理對(duì)周叢生物微生物群落的代謝功能的影響，探討了其碳源利用特性，旨在為周叢生物的富集與擴(kuò)大提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 周叢生物的培育

試驗(yàn)選用南京市玄武湖的水源，按照試驗(yàn)用水與WC培養(yǎng)液體積比為1 000∶11來(lái)配置人工廢水培養(yǎng)試驗(yàn)所需的周叢生物。試驗(yàn)用水的pH為7.9±0.03，全氮為(1.180±0.02) mg·L-1，NO3--N為(0.670±0.02)mg·L-1，NH4+-N為(0.510±0.01) mg·L-1，全磷為(0.120±0.01) mg·L-1，TDP為(0.035±0.001)mg·L-1。采用長(zhǎng)5 cm、寬2 cm的工業(yè)彈性材料作為周叢生物的富集載體，加入上述比例配置的人工廢水，將其置于恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)，期間保持2 500 lx的光照強(qiáng)度，28 ℃溫度和12 h/12 h的光暗比。定期觀(guān)察周叢生物的生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)20 d后，載體表面出現(xiàn)一層墨綠色粘稠物質(zhì)，此時(shí)周叢生物生長(zhǎng)成熟，可進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將培育好的周叢生物從載體上取下，配置濃度梯度分別為0(CK)、5、10、25、50、100 mg·L-1的吲哚乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，先分別向150 mL的錐形瓶中加入1 g含水量為92%～97%的周叢生物(采用烘干法，根據(jù)烘干前后周叢生物的質(zhì)量確定其含水量)，再加入100 mL不同濃度梯度的吲哚乙酸。以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)節(jié)溶液的pH。培養(yǎng)室條件：光照強(qiáng)度為2 500～3 000 lx，溫度為(28±1) ℃，光暗比為12 h/12 h。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1周叢生物微生物碳源代謝能力的測(cè)定

試驗(yàn)采用含有31種碳源(包含10種糖類(lèi)、7種羧酸、6種氨基酸、4種多聚物、2種酚酸和2種胺類(lèi))的Biology生態(tài)測(cè)試板來(lái)分析周叢生物的微生物群落代謝特征[16]。微生物作用于底物發(fā)生氧化還原電位使四氮唑藍(lán)發(fā)生氧化還原進(jìn)行染色，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

1.3.2生態(tài)測(cè)試板接種液的配制 在超凈工作臺(tái)中，稱(chēng)取1 g周叢生物置于150 mL無(wú)菌錐形瓶中，加入27 mL 0.85%已滅菌的NaCl溶液和滅菌的玻璃珠，封口后，振蕩30 min。靜置5 min后取5 mL懸液于25 mL V型槽中，再加入20 mL已滅菌的0.85% NaCl，混勻。最后使用移液槍將上述溶液加到每個(gè)孔中，每孔150 μL。將接種好的微孔板放在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144、168 h在ELXS08-Biology微孔板讀數(shù)儀(BIO-TEK Instruments INC，USA)上測(cè)定590 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)均設(shè)有3個(gè)平行。使用Excel 2013和Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、繪圖；使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)的差異性。

Biology分析中平均每孔顏色變化率(average well color development，AWCD)與多樣性指數(shù)[17]的計(jì)算方法如下。

AWCD=∑ (Ci-R)/n

(1)

式中，Ci為第i個(gè)碳源孔在590 nm波長(zhǎng)下的吸光值；R為對(duì)照孔的吸光值；n為碳源數(shù)(本研究中為31)。

Shannon多樣性指數(shù)(H)[18]可以表征微生物群落的豐富度，其計(jì)算公式如下。

H=-∑(Pi×lnPi)

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(3)

式中，Pi代表第i個(gè)碳源孔吸光度值的相對(duì)比值；Ci為第i個(gè)碳源孔的吸光值；R為對(duì)照孔的吸光度值。

Simpson多樣性指數(shù)(D)[18]可以反映微生物群落的優(yōu)勢(shì)物種，其計(jì)算公式如下。

D=1-∑(Pi)2

(4)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(5)

式中，Pi代表第i個(gè)碳源孔吸光度值的相對(duì)比值；Ci為第i個(gè)碳源孔的吸光值；R為對(duì)照孔的吸光度值。

Mclntosh指數(shù)(U)[18]用于評(píng)估微生物群落的物種相似性與均一性，其計(jì)算公式如下。

U=∑(ni)2

(6)

ni=Ci-R

(7)

式中，ni表示第i個(gè)碳源孔的相對(duì)吸光值；Ci為第i個(gè)碳源孔的吸光值；R為對(duì)照孔的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度IAA對(duì)周叢生物碳代謝活性的影響

施加不同濃度IAA后，周叢生物的平均每孔顏色變化率(AWCD)隨時(shí)間的變化如圖1所示。培養(yǎng)起始的24～96 h內(nèi)，AWCD快速增長(zhǎng)，此時(shí)周叢生物微生物碳代謝旺盛；96 h后，各處理的AWCD增長(zhǎng)速率逐漸降低，進(jìn)入平穩(wěn)期。不同處理下周叢生物的AWCD均呈現(xiàn)出隨時(shí)間增加而升高的趨勢(shì)。試驗(yàn)開(kāi)始后，5、10 mg·L-1低濃度IAA處理下周叢生物的AWCD均低于對(duì)照組。培養(yǎng)到72 h后，在不同濃度IAA處理下AWCD之間的差異開(kāi)始呈現(xiàn)顯著性(P<0.05)。96 h時(shí)，25、50、100 mg·L-1高濃度IAA處理組的周叢生物AWCD顯著高于低濃度處理組的AWCD(P<0.05)。

2.2 不同濃度IAA下周叢生物對(duì)不同碳源的代謝能力

由圖2可知，在試驗(yàn)96 h時(shí)，施加不同濃度IAA處理下周叢生物微生物群落對(duì)不同碳源的代謝能力存在差異。50 mg·L-1IAA處理組周叢生物微生物對(duì)多聚物的利用能力最高，為1.57，較對(duì)照組增加了3.29%。對(duì)照組中微生物對(duì)多聚物和氨基酸的利用能力較高，分別為1.52和1.26。25、50、100 mg·L-1高濃度IAA處理組可以提高微生物對(duì)不同碳源的利用能力和代謝能力，其對(duì)酚酸、碳水化合物、胺類(lèi)的利用能力較對(duì)照組較高，而低濃度IAA作用后微生物對(duì)羧酸、碳水化合物的利用率與對(duì)照相比有所降低。不同處理對(duì)酚酸和胺類(lèi)的利用率之間均無(wú)顯著性差異。

2.3 不同濃度IAA對(duì)微生物碳代謝多樣性的影響

由表1可以看出，96 h時(shí)5 mg·L-1低濃度IAA處理組周叢生物微生物群落的Shannon指數(shù)(H)和McIntosh指數(shù)(U)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而高濃度處理組的Shannon指數(shù)(H)和Simpson指數(shù)(D)與對(duì)照組相比差異性并不明顯。3種代謝多樣性指數(shù)表明，不同處理下微生物群落之間存在差異，但其優(yōu)勢(shì)物種相似。

表1 96 h時(shí)周叢微生物碳代謝多樣性Table 1 Microbial carbon metabolism diversity of periphytic biofilms at 96 h

3 討論

平均每孔顏色變化率(AWCD)可用于表示周叢生物微生物群落對(duì)不同碳源的利用能力[19]，其值越高表示微生物對(duì)碳源的利用率越高，代謝活性也越強(qiáng)[2]。本研究結(jié)果表明，不同濃度IAA處理下，周叢生物的活性隨著時(shí)間的增加而升高。在試驗(yàn)的前24 h內(nèi)，各濃度IAA處理下微生物對(duì)單一碳源的利用程度較低。在培養(yǎng)的24～96 h之間，微生物群落對(duì)碳源的利用率顯著增加(P<0.05)，且以100 mg·L-1處理下碳源利用率最高，之后緩慢增加，逐漸趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)72 h后，高濃度處理組的AWCD高于對(duì)照組，對(duì)照組周叢生物AWCD顯著高于5、10 mg·L-1低濃度處理組(P<0.05)，表明高濃度IAA處理后周叢生物微生物對(duì)碳源的利用率明顯提高，微生物的豐度也相對(duì)更高。這與Wang等[20]的研究結(jié)果一致，隨著IAA濃度的升高，變形桿菌門(mén)和嗜鉻菌門(mén)繁殖速度加快，其相對(duì)豐度也明顯增加。Peng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(50 mg·L-1)IAA處理與對(duì)照組相比，微藻的生長(zhǎng)增加了30%。

本研究選取96 h的吸光值來(lái)評(píng)估周叢生物對(duì)不同碳源的利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理下周叢生物微生物群落對(duì)不同碳源的利用程度表現(xiàn)不同，但其中多聚物是周叢生物代謝利用率最高的碳源。總體來(lái)看，高濃度處理組周叢生物中微生物群落與對(duì)照組相比具有更強(qiáng)的碳源利用能力，而低濃度處理組中微生物的碳源利用能力與對(duì)照組相比較弱。這與AWCD變化趨勢(shì)相一致，表明施加IAA后能改變周叢生物的微生物群落結(jié)構(gòu)。不同濃度的IAA對(duì)微生物的作用因物種而異，而周叢生物作為一個(gè)復(fù)雜的微生物聚集體，IAA對(duì)其影響應(yīng)取決于所有微生物的綜合作用。

本研究采用96 h的Biology生態(tài)測(cè)試板測(cè)得的AWCD來(lái)計(jì)算Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)，真實(shí)地反映了周叢生物微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面。除了Simpson指數(shù)以外，剩余兩個(gè)指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明不同處理后微生物群落具有相似的優(yōu)勢(shì)物種。高濃度IAA處理后周叢生物的碳代謝多樣性大于等于對(duì)照組，而低濃度處理組周叢生物的碳代謝多樣性低于對(duì)照組，說(shuō)明施加吲哚乙酸后會(huì)引起周叢生物自身組成發(fā)生變化，導(dǎo)致其物種多樣性也發(fā)生變化。高濃度IAA處理能增加周叢生物微生物的多樣性，可能是因?yàn)橹軈采镏写嬖谝恍┊愷B(yǎng)微生物，如鮑曼不動(dòng)桿菌[22]、假單胞菌屬[23]等，可以有效利用IAA作為碳源和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，誘導(dǎo)其基因表達(dá)，當(dāng)施加高濃度IAA時(shí)，可提供較多的碳源，增加微生物的多樣性。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度IAA可刺激周叢生物的生長(zhǎng)，周叢生物可通過(guò)抗氧化酶激活、群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化和碳代謝模式變化來(lái)適應(yīng)不同濃度的IAA。

在本研究中，高濃度IAA處理可以提高周叢生物微生物的碳源代謝和利用能力，為周叢生物的富集與擴(kuò)大培養(yǎng)提供了思路和途徑，但本研究未評(píng)估周叢生物的群落結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步研究認(rèn)識(shí)這種變化機(jī)制。