卓婭·買買提烏斯?jié)M 向紅 白雪 李楊靜 王紅梅

衰弱是一種臨床上可識(shí)別的狀態(tài)，隨著年齡增長(zhǎng)的同時(shí)，個(gè)體對(duì)應(yīng)激事件的易感性隨之增加，導(dǎo)致系統(tǒng)功能和生理儲(chǔ)備功能顯著下降[1]。目前，衰弱的生物學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚，但已有研究表明，衰弱與遺傳因素相關(guān)[2]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體DNA甲基化與年齡有關(guān)，它可以作為衰老以及個(gè)體衰弱的生物學(xué)標(biāo)志物[3]。雖然DNA甲基化的相關(guān)研究已在心血管系統(tǒng)疾病、PD、DM以及各系統(tǒng)腫瘤等多種疾病的發(fā)病機(jī)制研究中廣泛應(yīng)用，但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)DNA甲基化與衰弱的研究很少見，有關(guān)NF-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)基因甲基化與衰弱的研究則更為少見。本研究旨在通過(guò)病例對(duì)照研究來(lái)分析RANK基因甲基化與新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱的相關(guān)性,以期從表觀遺傳學(xué)角度探討我國(guó)老年人衰弱的可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究是以自然人群橫斷面流行病學(xué)調(diào)查為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究。采用多級(jí)隨機(jī)抽樣的方法對(duì)2018年4～5月新疆農(nóng)牧區(qū)65歲以上男性常住居民進(jìn)行現(xiàn)況調(diào)查：第一階段隨機(jī)選取南疆和北疆各1個(gè)縣(北疆木壘縣和南疆洛浦縣)；第二階段在每個(gè)縣隨機(jī)抽取6個(gè)鄉(xiāng)；第三階段在每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機(jī)抽取5個(gè)村；第四階段在每個(gè)村隨機(jī)抽取35人進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。調(diào)查前先行人口登記，確?；貜?fù)率以及研究對(duì)象之間相互無(wú)關(guān)聯(lián)。問(wèn)卷調(diào)查由我科住院醫(yī)師(研究生學(xué)歷)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)后填寫。最后，從中隨機(jī)抽樣90例，其中哈薩克族30例，維吾爾族28例，漢族32例。

1.2 研究方法

1.2.1 衰弱評(píng)估：采用Fried衰弱表型評(píng)估研究對(duì)象是否衰弱：(1)行走步速減慢；(2)握力減低；(3)不明原因體質(zhì)量減輕；(4)自感疲乏無(wú)力；(5)體力活動(dòng)減少。符合上述任意3項(xiàng)或以上者定義為衰弱；滿足任意1～2項(xiàng)者為衰弱前期；無(wú)上述表現(xiàn)者為無(wú)衰弱。本研究將衰弱者作為病例組，衰弱前期及無(wú)衰弱者作為對(duì)照組。

1.2.2 臨床資料收集：收集研究對(duì)象的基本資料，包括年齡、血壓、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓史、DM病史等。研究對(duì)象空腹6～8 h后，采集外周血5 mL，離心分離后的血清由我院檢驗(yàn)科完成ALT、AST、肌酐(Cr)等生化指標(biāo)檢測(cè)，余下的血液有形成分于-80 ℃條件下保存，用于提取DNA。

1.2.3 基因組DNA提取以及RANK基因甲基化檢測(cè)：外周血細(xì)胞基因組DNA提取完全按照德國(guó)PAXgene Blood DNA kit試劑盒所提供的操作步驟進(jìn)行。使用Methyl Primer Express v1.0系統(tǒng)設(shè)計(jì)引物：上游引物為5′-GGTGCCTTTCTAGAATTTGGTGG-3′，下游引物為5′-CCAACCCTAAATTACCCTTCAC-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為376 bp，CpG位點(diǎn)共20個(gè)[4]。采用EpiTect快速亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(德國(guó))對(duì)基因組甲基化進(jìn)行修飾。修飾后反復(fù)洗脫和純化并置于-20 ℃環(huán)境中保存。選用上述質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)的DNA再行PCR擴(kuò)增并回收產(chǎn)物，由上海生工生物工程有限公司對(duì)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。采用BiQ Analyzer軟件對(duì)比分析RANK基因組的標(biāo)準(zhǔn)序列以及測(cè)序序列。

2 結(jié)果

2.1 新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的臨床特征 哈薩克族、漢族、維吾爾族的病例組與對(duì)照組的各項(xiàng)臨床特征及生化指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的臨床特征比較

2.2 不同民族病例組與對(duì)照組RANK基因甲基化率比較 不同民族病例組與對(duì)照組組內(nèi)的RANK基因CpG島甲基化率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3個(gè)民族的對(duì)照組RANK基因CpG島甲基化率均明顯高于病例組(P<0.05)。見表2。

表2 不同民族病例組與對(duì)照組RANK基因甲基化率比較

2.3 新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱與校正后的RANK基因甲基化率的相關(guān)性分析 在校正年齡、吸煙、飲酒、BMI，及高血壓、糖尿病患病率后，協(xié)方差分析結(jié)果依然顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率顯著低于非衰弱者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱與校正后的RANK基因甲基化率的相關(guān)性分析

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳機(jī)制研究的重要內(nèi)容之一，同時(shí)它也是可逆的DNA自然化學(xué)修飾方式，參與相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[5-6]。有研究表明，在不同種族人群中，DNA甲基化水平也不一定相同：西班牙裔美國(guó)人以及白種人的OPRM1基因甲基化水平明顯低于非洲裔美國(guó)人[7]；非洲裔女性P16INK4基因甲基化率明顯低于白人女性[8]。因此，本研究先對(duì)不同民族間的RANK基因甲基化率的差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性的RANK基因CpG島甲基化率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DNA甲基化水平易受到年齡、飲食、葉酸水平、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位等多種因素的影響，而居住地、飲食習(xí)慣、毒品和藥物濫用以及不同生活方式等都可以極大地影響遺傳同質(zhì)群體的甲基化水平[9]。本研究所選的研究對(duì)象均為新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性自然人群，他們的居住環(huán)境、飲食習(xí)慣頗為相似，因此，不同民族對(duì)RANK基因甲基化率的影響較小。

有報(bào)道顯示，衰弱人群的DNA甲基化水平較非衰弱人群低[10]，且衰弱進(jìn)展程度與顯著降低的甲基化水平有關(guān)[11]。也有研究提示，衰弱者的低甲基化可能與增齡情況下DNA復(fù)制后再甲基化受阻有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，新疆農(nóng)牧區(qū)不同民族老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率均顯著低于非衰弱者，且校正BMI、飲酒、吸煙、年齡、高血壓、糖尿病等協(xié)變量后，依然得出新疆農(nóng)牧區(qū)老年男性衰弱者的RANK基因CpG島甲基化率顯著低于非衰弱者，提示RANK基因甲基化率降低與衰弱可能相關(guān)。

本研究仍存在不足之處：首先本研究為橫斷面研究，只能研究其相關(guān)性；其次，本研究樣本量較少，未來(lái)需要進(jìn)一步的大樣本驗(yàn)證以確保重復(fù)性。