聶玉婷，溫璐璐，司童，劉瑤，高利，曲淼

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有分泌、代謝等生理功能，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和血流動(dòng)力學(xué)等生理功能[1]。血管內(nèi)皮損傷是心腦血管病變的重要病理基礎(chǔ)之一，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)直接參與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成等病理過程[2-3]。消栓腸溶膠囊的藥物組成源于補(bǔ)陽(yáng)還五湯，補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有益氣活血的功效，是卒中恢復(fù)期常用的中醫(yī)方劑。已有研究證明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以增加腦缺血后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和整合素αvβ3的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，改善神經(jīng)功能[4]。還有研究顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促血管生成[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信號(hào)通路上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2的磷酸化，促進(jìn)腦出血小鼠的血管生成[6]。目前，消栓腸溶膠囊改善血管內(nèi)皮功能的機(jī)制還不明確。本研究使用分子對(duì)接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討消栓腸溶膠囊改善血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制，為基礎(chǔ)和臨床研究提供參考。

1 研究方法

1.1 藥物化合物的篩選 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以消栓腸溶膠囊的中藥組成“赤芍”“黃芪”“桃仁”“當(dāng)歸”“紅花”“川芎”為關(guān)鍵詞搜索，設(shè)定條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18，分別篩選出符合條件的化合物及相應(yīng)靶點(diǎn)。消栓腸溶膠囊的一個(gè)中藥成分“地龍”在TCMSP中沒有信息，在TCMid數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATman）數(shù)據(jù)庫(kù)、中醫(yī)百科全書（encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM）數(shù)據(jù)庫(kù)中收集地龍化合物信息，配合文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充化合物信息，再將化合物放入TCMSP平臺(tái)搜索，刪除OB、DL不合格的化合物，刪除在TCMSP、天然產(chǎn)物活性和物種來源數(shù)據(jù)庫(kù)（natural product activity and species source database，NPASS）和Symap數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到靶點(diǎn)的化合物，刪除重復(fù)化合物。通過通用蛋白資源（universal protein resource，UniProt）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“endothelial dysfunction”“vascular endothelial disorder”“vascular endothelial function”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳（online Mendelian inheritance in man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org）進(jìn)行檢索，相關(guān)性得分設(shè)置為≥6，去除重復(fù)靶點(diǎn)，篩選血管內(nèi)皮功能障礙的靶點(diǎn)。將赤芍、黃芪、桃仁、當(dāng)歸、紅花、川芎、地龍與血管內(nèi)皮功能障礙靶點(diǎn)基因取交集，得到藥物與血管內(nèi)皮功能障礙的共同靶點(diǎn)基因。

1.3 藥物-血管內(nèi)皮功能障礙靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)藥物和血管內(nèi)皮功能障礙靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-血管內(nèi)皮功能障礙-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。將藥物與血管內(nèi)皮功能障礙共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定物種為人類，取中度交互值為0.9，獲取藥物對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙的潛在治療靶點(diǎn)的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將PPI結(jié)果通過Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，獲取度值、介度中心性值和緊密中心性值，構(gòu)建藥物對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙潛在治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 富集分析 利用R語(yǔ)言分析軟件對(duì)篩選得到的藥物-血管內(nèi)皮功能障礙共有的靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，然后通過繪圖軟件Origin作圖。

1.5 核心活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 通過分子對(duì)接探究天然產(chǎn)物與各靶點(diǎn)的結(jié)合方式，這些靶標(biāo)受體全部從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）（https：//www.rcsb.org/；PDB ID：4XZY、5LCY、1JNM）中下載獲得。用于分子對(duì)接的小分子從pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得。本研究采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接工作，在對(duì)接開始之前，使用PyMol 2.5對(duì)所有受體蛋白進(jìn)行處理，包括去除水分子、鹽離子以及小分子。并使用PyMol插件center_of_mass.py定義對(duì)接盒子的中心，對(duì)接盒子的邊長(zhǎng)統(tǒng)一定義為22.5。此外，使用ADFRsuite 1.0將所有處理好后的小分子以及受體蛋白轉(zhuǎn)換為AutoDock Vina 1.1.2對(duì)接必須的PDBQT格式。對(duì)接時(shí)，使用默認(rèn)對(duì)接參數(shù)進(jìn)行對(duì)接。輸出的得分最高的對(duì)接構(gòu)象為結(jié)合構(gòu)象，最后使用PyMol 2.5對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物關(guān)鍵化學(xué)成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索藥物的化學(xué)成分，共得到66個(gè)化合物和218個(gè)靶點(diǎn)，其中川芎關(guān)鍵化合物4個(gè)，當(dāng)歸關(guān)鍵化合物2個(gè)，赤芍關(guān)鍵化合物7個(gè)，紅花關(guān)鍵化合物15個(gè)，地龍關(guān)鍵化合物1個(gè)，黃芪關(guān)鍵化合物12個(gè)，桃仁關(guān)鍵化合物17個(gè)，共有化合物8個(gè)。

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn) 去除重復(fù)靶點(diǎn)后，篩選得到血管內(nèi)皮功能障礙的3120個(gè)蛋白靶點(diǎn)基因，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到藥物與血管內(nèi)皮功能障礙共同靶點(diǎn)基因159個(gè)（圖1）。主要共同靶點(diǎn)基因有PGR、NR3C2、PTGS1、PTGS2、NOS2、ESR1、AR、SCN5A、PPARG、F7、KDR、RXRA、ADRB2、ESR2、DPP4、MAPK14、GSK3B、CDK2、CCNA2、NR3C1、DRD1、CHRM3、CHRM1、ADRA1A、ADRA1B、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、ADH1C、ADRA2A、SLC6A2等。

圖1 藥物作用靶點(diǎn)與血管內(nèi)皮功能障礙靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 “藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-血管內(nèi)皮功能障礙-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-血管內(nèi)皮功能障礙-靶蛋白”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。在該網(wǎng)絡(luò)中，共包含221個(gè)節(jié)點(diǎn)，585條邊，56個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，6個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，159個(gè)藥物治療血管內(nèi)皮功能障礙的潛在靶點(diǎn)（圖2）。根據(jù)度值篩選，確定槲皮苷、木樨草素、山柰酚、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、β-谷甾醇、黃芩素、芒柄花黃素、異鼠李素、豆甾醇、β-胡蘿卜素等為消栓腸溶膠囊治療血管內(nèi)皮功能障礙的主要有效成分（表1）。

表1 藥物化合物度值與來源

圖2 化合物-血管內(nèi)皮功能障礙靶點(diǎn)相互網(wǎng)絡(luò)作用圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析 將藥物-血管內(nèi)皮功能障礙共同的159個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，研究物種選擇人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，篩選評(píng)分＞0.9的蛋白關(guān)系，將蛋白互作結(jié)果通過Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，形成藥物潛在作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。該網(wǎng)絡(luò)包括42個(gè)節(jié)點(diǎn)，243條邊。平均度值是11.57，超過平均度值的靶點(diǎn)蛋白有17個(gè)（表2），度值排名前5的靶點(diǎn)分別為TP53、MAPK1、JUN、Akt1和MAPK8。這5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可能在藥物治療血管內(nèi)皮功能障礙過程中發(fā)揮重要作用，涉及的信號(hào)途徑包括血管生成、炎癥、細(xì)胞凋亡等。

表2 藥物潛在作用靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩员?/p>

圖3 藥物潛在作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 富集分析

2.5.1 GO富集分析 GO富集分析共獲得 2700條GO生物學(xué)過程，從生物過程（biological processes，BP）、分子功能（cellular components，CC）、細(xì)胞成分（molecular functions，MF）3個(gè)水平對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析，取P＜0.05，以該生物功能富集到的基因數(shù)排序，前5條富集結(jié)果見圖4。獲得BP相關(guān)的條目主要涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)等；CC相關(guān)的條目主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等；MF相關(guān)的條目主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性等。

圖4 藥物潛在作用靶點(diǎn)Go富集分析結(jié)果

2.5.2 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，消栓腸溶膠囊改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路有168條，其中與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的信號(hào)通路有PI3K/Akt、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product，AGE）與其受體（receptor for AGE，RAGE）信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF-α信號(hào)通路、凋亡、Th17細(xì)胞分化、TP53信號(hào)通路等（圖5）。

圖5 藥物潛在作用靶點(diǎn)京都基因和基因組百科全書通路富集分析結(jié)果

2.6 消栓腸溶膠囊改善血管內(nèi)皮功能活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接預(yù)測(cè) 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為TP53、JUN、MAPK1，使用AutoDock Vina軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化合物進(jìn)行對(duì)接。一般認(rèn)為配體與受體分子構(gòu)象越穩(wěn)定，能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。以結(jié)合能≤-20.9 kJ/mol為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分子對(duì)接結(jié)果顯示MAPK1與山柰酚、木樨草素、槲皮苷具有最好結(jié)合力（表3），使用PyMoL作圖，結(jié)果見圖6。

圖6 分子對(duì)接圖

表3 有效化合物與作用靶蛋白的結(jié)合分?jǐn)?shù)表

3 討論

綜合分析本研究中關(guān)鍵靶點(diǎn)、KEGG和GO富集結(jié)果，消栓腸溶膠囊可能通過作用于TP53、JUN、MAPK1、AKT1、MAPK8等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE/RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF-α信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、TP53信號(hào)通路等，通過調(diào)節(jié)血流動(dòng)力、抗凋亡、抗炎、保護(hù)血管及促進(jìn)血管新生等機(jī)制，發(fā)揮改善血管內(nèi)皮功能的作用。

凋亡是血管內(nèi)皮細(xì)胞的死亡形式之一，TP53參與缺血再灌注后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制的調(diào)節(jié)[7]。張建初等[8]發(fā)現(xiàn)在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，TP53基因的表達(dá)明顯增多，認(rèn)為TP53基因參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。JUN參與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的合成，是血管內(nèi)皮細(xì)胞生成反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用[9-10]。Akt是一種多功能的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，Akt1能影響細(xì)胞遷移和一氧化氮合成，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成中起到關(guān)鍵作用[11]。另外，Akt1能調(diào)節(jié)血管通透性、血管生成反應(yīng)和血管成熟的過程[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能增加缺血腦內(nèi)Akt1 mRNA的表達(dá)水平，減輕腦缺血后的腦組織損傷[13]。

流體剪切力在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中有重要作用，研究表明，流體剪切力可上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生[14]。高剪切力能降低內(nèi)皮細(xì)胞的動(dòng)脈粥樣硬化程度，促進(jìn)血管生成[15]；低切應(yīng)力可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重血管內(nèi)皮功能損傷[16]。

AGE可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，有研究證明AGE可通過AGE/RAGE信號(hào)通路、p38-MAPK受體信號(hào)通路等誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化[17]。何林全等[18]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明加味補(bǔ)陽(yáng)還五顆?？赏ㄟ^調(diào)控高遷移率族蛋白B1/RAGE信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)，研究表明PI3K/Akt通路對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞有保護(hù)作用[19]。PI3K/Akt通路還可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移[20]。另外，Kawasaki等[21]的研究也證明PI3K/Akt信號(hào)通路有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及產(chǎn)生新生血管的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過PI3K/Akt通路激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2在腦出血誘導(dǎo)的血管生成中起到關(guān)鍵作用[6]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與全身的炎癥反應(yīng)。Th17是CD4+T細(xì)胞亞群之一，分泌IL-17，在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊侵蝕或破裂過程中起著重要作用[22-23]。TNF-α等細(xì)胞因子的異?？墒箼C(jī)體產(chǎn)生慢性低度炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[24]。吳旋等[25]等的研究證明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可下調(diào)腦缺血大鼠TNF-α等炎癥因子的水平，減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，消栓腸溶膠囊具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，從單一的通路或靶點(diǎn)難以闡明其改善血管內(nèi)皮功能的作用機(jī)制。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)地闡述了消栓腸溶改善血管內(nèi)皮功能的活性成分及其可能作用機(jī)制，希望為消栓腸溶膠囊的臨床運(yùn)用提供理論支撐。

【點(diǎn)睛】本研究通過TCMSP等中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，GeneCards、OMIM等生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，基于分子對(duì)接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了消栓腸溶膠囊改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的可能靶點(diǎn)及可能機(jī)制，有助于后續(xù)針對(duì)消栓腸溶膠囊的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。