孫溥臨

摘 要：針對(duì)現(xiàn)有量子點(diǎn)影像探針存在熒光性質(zhì)不可控、生物毒性強(qiáng)的問(wèn)題，本研究結(jié)合現(xiàn)有的CuInS量子點(diǎn)探針，研究制備出一種摻雜Zn離子可簡(jiǎn)易合成的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)納米探針，并通過(guò)改進(jìn)其水溶性，得到一種可直接應(yīng)用于醫(yī)學(xué)腫瘤影像的改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)納米探針。為提高該量子點(diǎn)納米探針的靶向性，研究根據(jù)EDC偶聯(lián)的原理，通過(guò)將改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)納米探針與cRGD多肽進(jìn)行偶聯(lián)，得到ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針，并從結(jié)構(gòu)形態(tài)、細(xì)胞毒性和離體熒光3個(gè)方面重點(diǎn)評(píng)估了該量子點(diǎn)納米探針，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)論證了其有效性和實(shí)用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究制備的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針是一種有效的腫瘤靶向探針，可用于實(shí)際腫瘤靶向檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：CuInS;量子點(diǎn);納米材料;熒光成像

中圖分類號(hào)：R329.2+6;Q26? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? 文章編號(hào)：1001-5922（2021）10-0058-04

Quantum Dot Nanomaterial Probe and Its Application in Tumor Imaging

Sun Pulin

（School of Mechanical Engineering，Shandong University of Technology， Zibo 255000， China ）

Abstract：In view of uncontrollable fluorescence properties and strong biological toxicity of existing quantum dot image probes，this study combines the existing CuInS quantum dot probes to prepare a ZCIS/ZnS doped with Zn ions that can be easily synthesized Quantum dot nanoprobe， and by improving its water solubility， an improved zcis/ZnS quantum dot nano probe can be directly applied to medical tumor imaging. In order to improve the targeting property of the QD nanoprobe， according to the principle of EDC coupling， the ZCIS/ZnS cRGD QD nanoprobe was obtained by coupling the modified ZCIS/ZnS QD nanoprobe with CGD peptide. The QD nanoprobe was evaluated from three aspects of structure morphology， cytotoxicity and fluorescence in vivo imaging， and its effectiveness and practicability were demonstrated by experiments. The experimental results show that the ZCIS/ZnS-cRGD quantum dot nanoprobe is an effective tumor targeting probe， which can be used for tumor targeted imaging in vivo.

Key words：CuInS; quantum dots; nanomaterials; fluorescence imaging

量子點(diǎn)作為一種新型納米材料，由于其優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記。如劉蓓蓓、曹林（2019）建立了基于量子點(diǎn)的鉛鎘快速串聯(lián)檢測(cè)方法，用于檢測(cè)肉中的Pb和Cd含量是否超標(biāo)等[1]。但由于鉛鎘本身屬于重金屬，因此基于這兩種元素的量子點(diǎn)具有潛在的生物毒性，故限制了它們?cè)跓晒饣铙w成像方面的應(yīng)用。近幾年，隨著量子點(diǎn)材料的發(fā)展，具有較低生物毒性的CuInS量子點(diǎn)材料在熒光活體成像方面得到快速發(fā)展，如馮彩萍、單路瑤等（2020）基于Fe3O4&CuInS2核殼結(jié)構(gòu)構(gòu)建了雙模式成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了可視化治療[2]。但這些研究中量子點(diǎn)仍然存在熒光性質(zhì)不可控的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題，本研究結(jié)合現(xiàn)有的CuInS量子點(diǎn)探針與EDC偶聯(lián)的原理，制備出一種熒光性質(zhì)穩(wěn)定，且生物毒性較低的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究實(shí)驗(yàn)主要使用到的儀器及其型號(hào)和生產(chǎn)廠家如表1所示，實(shí)驗(yàn)中使用到的試劑和生產(chǎn)廠家如表2所示，試劑規(guī)格均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 量子點(diǎn)探針制備

（1）ZCIS量子點(diǎn)制備。步驟1：稱取76.8mg碘化亞銅、117.2mg醋酸銦、126.4mg硬脂酸鋅依次加入含冷凝管的100ml四口燒瓶中，并加入16ml十八烯、0.2ml油酸、2ml巰基十二烷混合。在氬氣環(huán)境中使用磁力攪拌將反應(yīng)體系加熱到100℃。同時(shí)，利用真空泵持續(xù)對(duì)反應(yīng)體系抽真空30min，每間隔8min回充和置換一次氬氣。步驟2：持續(xù)加熱反應(yīng)體系至240℃，并維持該溫度到一定時(shí)間，可以觀察到反應(yīng)溶液隨時(shí)間延長(zhǎng)，顏色逐漸由淡黃色變成黃色、橙色、紅色、棕紅色直到黑色。為后續(xù)測(cè)試反應(yīng)溶液的表征，在反應(yīng)體系加熱過(guò)程中，每間隔5min需借助注射器從反應(yīng)液中抽取少量溶液，并快速稀釋冷卻置于環(huán)己烷中。步驟3：維持加熱溫度240℃持續(xù)加熱70min后，將反應(yīng)溶液置于自然條件下冷卻至室溫，并向溶液中加入3倍體積的過(guò)量乙醇/環(huán)己烷混合溶劑。采用8000g離心處理混合溶液20min，去除多余的副產(chǎn)物和反應(yīng)前體，可得到純化的ZCIS量子點(diǎn)。

（2）改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)制備。步驟1：稱取32mg硫粉，在超聲波的條件下，將硫粉溶解于8ml十八烯與2ml油胺的混合溶液中，得到棕紅色硫前體液。稱取380mg硬脂酸鋅，在超聲波的條件下使其溶解于6ml的十八烯溶液中，得到白色渾濁狀態(tài)的鋅前體液;步驟2：將不進(jìn)行任何處理的ZCIS量子點(diǎn)的反應(yīng)溶液溫度降低到150℃。依次向溶液中加入4ml硫前體液和6ml鋅前體液，并將混合溶液加熱到220℃，并保持溫度使混合溶液持續(xù)反應(yīng)1h后，將反應(yīng)溶液置于自然條件下冷卻至室溫;步驟3：采用8000g離心處理混合溶液20min，去除多余的副產(chǎn)物和反應(yīng)前體，可得到純化的ZCI/ZnS量子點(diǎn)，將其保存在三氯甲烷中;步驟4：向上述制備得到的含有20nmol ZCIS/ZnS量子點(diǎn)的三氯甲烷溶液中加入8mg的PMAO，將混合溶液在室溫條件下使用磁力攪拌劇烈攪拌3h。加入40μl的乙醇胺并繼續(xù)攪拌30min，再加入4ml硼酸緩沖液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完全去除溶液中的三氯甲烷，得到含有量子點(diǎn)的澄清透明水溶液;步驟5：采用100000g離心對(duì)含有量子點(diǎn)水溶液進(jìn)行超速離心處理30min，重復(fù)3次，去除溶液中的多余反應(yīng)物以及三氯甲烷。將改進(jìn)后的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)溶解于400μl的PBS中，以便用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（3）ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針制備。ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針的制備方法主要是利用EDC偶聯(lián)的原理[5]，將改進(jìn)后的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)與cRGD多肽進(jìn)行偶聯(lián)，其具體操作如下：

步驟1：將10nmol改進(jìn)后ZCIS/ZnS量子點(diǎn)和10μmolEDC在400μl的PBS中進(jìn)行混合，將混合溶液在避光室溫條件下進(jìn)行震蕩，震蕩時(shí)長(zhǎng)為15min;步驟2：向混合溶液中加入一定量的粉末狀cRGD，并在避光的室溫條件下震蕩2h;并采用100000g超速離心處理溶液30min，重復(fù)2次，去除多余的反應(yīng)物，得到純化的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針。

1.2.2 ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針性能測(cè)試

（1）細(xì)胞毒性測(cè)試。借助MTT實(shí)驗(yàn)[6]對(duì)白鼠成纖維細(xì)胞系NTH-3T3進(jìn)行表征，以檢驗(yàn)ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針的細(xì)胞毒性測(cè)試。具體操作如下：

步驟1：取含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH-3T3細(xì)胞混合配置成細(xì)胞懸浮液。向48孔邊緣孔為無(wú)菌PBS填充的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入每孔200μl的細(xì)胞懸浮液，種植密度為每孔5000個(gè)細(xì)胞。在二氧化碳含量為5%，溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)12h;步驟2：向含有細(xì)胞懸浮液的孔板中加入不同濃度的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)DMEM溶液，并在二氧化碳含量為5%，溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)24h，其中，每個(gè)濃度的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)DMEM溶液需設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;步驟3：向每孔中加入40μl的MTT溶液，培養(yǎng)4h后倒出培養(yǎng)液。加入300μl的二甲基亞砜，在避光低速的搖床上震蕩10min，直到結(jié)晶物完全溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)每孔的吸光值。

（2）離體熒光信號(hào)測(cè)試。本研究的熒光活體成像實(shí)驗(yàn)是以白鼠腦膠質(zhì)瘤為例展開的實(shí)驗(yàn)[7]，具體操作如下：

步驟1：選擇兩組7周齡大小、體重為25g左右的雌性裸鼠20只，每組10只，在其右上肩部，采用皮下注射的方式，注射100μl含100萬(wàn)個(gè)腫瘤細(xì)胞的PBS細(xì)胞懸浮液。約3周后，裸鼠體內(nèi)腫瘤體積增長(zhǎng)到5mm×5mm時(shí)，即可用于熒光活體成像實(shí)驗(yàn);步驟2：實(shí)驗(yàn)前12h，停止喂食待用裸鼠，以盡量減少因食物的熒光造成的干擾。采用尾靜脈注射的方式，向第一組裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)PBS溶液，向第二組裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)探針PBS溶液;步驟3：設(shè)置Carestream MSFX PRO熒光活體成像系統(tǒng)CCD的曝光時(shí)間為20s，激發(fā)波長(zhǎng)510nm，發(fā)射波長(zhǎng)為700nm。在不同時(shí)間點(diǎn)，使用該系統(tǒng)對(duì)注射量子點(diǎn)探針的老鼠進(jìn)行熒光成像;步驟4：注射6h后殺死實(shí)驗(yàn)老鼠并取出其肝、胃等主要臟器用作熒光成像，并利用成像系統(tǒng)的圖像處理軟件完成數(shù)據(jù)采集及分析[8]。

1.3 性能測(cè)試

1.3.1 HRTEM結(jié)構(gòu)形貌分析

對(duì)稀釋在三氯甲烷中的純化ZCI/ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行超聲分散處理，取處理后的溶液10μl置于超薄碳膜的TEM測(cè)試銅網(wǎng)上，直到溶劑全部揮發(fā)。利用HRTEM對(duì)量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征。

1.3.2 XRD結(jié)構(gòu)分析

取0.1ml分散于三氯甲烷中的純化后量子點(diǎn)均勻涂抹與晶體硅片上，待溶劑完全揮發(fā)，再次涂抹同體積的溶液，重復(fù)3次。利用XRD進(jìn)行量子點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZCIS/ZnS量子點(diǎn)的XRD圖

使用XRD對(duì)ZCIS和ZCIS/ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，得到如圖1所示的結(jié)果。由圖1可知，ZCIS和ZCIS/ZnS量子點(diǎn)在XRD圖譜上均存在3個(gè)衍射主峰，ZCIS/ZnS的衍射主峰相較于ZCIS出現(xiàn)了一定紅移，說(shuō)明Zn離子成功引入量子點(diǎn)，本研究成功制備了ZCIS/ZnS量子點(diǎn)。

2.2 改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)光學(xué)性質(zhì)

利用HRTEM對(duì)改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，得到如圖2所示的結(jié)果。由圖2可知，改進(jìn)的ZCIS/ZnS量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)與ZCIS/ZnS量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)相比，幾乎沒有發(fā)生變化。

2.3 ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)細(xì)胞毒性評(píng)估

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估，將不同濃度的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)與NIH3T-3細(xì)胞共同孵育48h，得到如圖3所示的結(jié)果。由圖3可知，當(dāng)ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)濃度小于0.8μmol時(shí)，細(xì)胞的存活率維持在87%以上，說(shuō)明本研究制備的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)具有較低的毒性，可用于后續(xù)醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用。

2.4 離體熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量

為進(jìn)一步分析ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針的代謝能力，在注射該探針5h后，解剖第二組裸鼠取出其主要臟器，并對(duì)其進(jìn)行離體熒光成像和半定量分析，得到如圖4所示的結(jié)果。由圖4可知，肝臟、胃的熒光信號(hào)最強(qiáng)，其原因是RES能識(shí)別并捕獲ZCIS/ZnS-cRGD信號(hào)，因此肝臟的ZCIS/ZnS-cRGD信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng);胃部殘留的食物含有大量的熒光信號(hào)，因此胃部的熒光強(qiáng)度相對(duì)較高。而相比于其它臟器，腫瘤的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，說(shuō)明本研究制備的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針是一種有效的腫瘤靶向探針，可用于實(shí)際腫瘤靶向檢測(cè)。

3 結(jié)論

根據(jù)上文研究，可以得到以下4點(diǎn)結(jié)論：

（1）ZCIS/ZnS量子點(diǎn)在XRD圖譜上均存在3個(gè)衍射主峰，且相較于ZCIS量子點(diǎn)出現(xiàn)了一定紅移，說(shuō)明本研究成功引入了Zn離子，制備得到了ZCIS/ZnS量子點(diǎn)。

（2）改進(jìn)ZCIS/ZnS量子點(diǎn)納米材料具有良好的親水性和熒光性質(zhì)，可直接應(yīng)用于醫(yī)學(xué)影像。

（3）ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)濃度小于0.8μmol時(shí)，細(xì)胞的存活率維持在87%以上，即本研究制備的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)具有較低的毒性。

（4）ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針可明顯檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)裸鼠的腫瘤部位信號(hào)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤的輪廓更加清晰，即本研究制備的制備的ZCIS/ZnS-cRGD量子點(diǎn)納米探針具有良好的腫瘤特異性識(shí)別能力，是一種有效的腫瘤靶向量子探針，可用于實(shí)際腫瘤靶向的活體成像。

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