崔勇和，沈先敏

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院，襄陽 441021）

結(jié)腸癌是全球第3位常見的惡性腫瘤，病死率較高[1]。針對每位患者腫瘤類型、分期及身體健康情況，其治療方法的選擇也有較大差異。目前，結(jié)腸癌最常見的治療方法包括手術(shù)、放療和化療[2]。然而，每種治療方式都存在潛在的風(fēng)險、益處和不良反應(yīng)，從而迫切需要開發(fā)治療該疾病的新策略。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是極其常見治療結(jié)腸癌的化療藥物之一[3]。5-FU作為一種常見抗腫瘤藥物，也存在耐藥現(xiàn)象[4]。因此，5-FU與其他藥物聯(lián)合使用，可以提供一種更有效的方法，增強腫瘤細胞化療敏感性，同時降低對正常細胞的毒性。

白藜蘆醇（RES）是一種植物抗毒素，存在于多種植物中（如葡萄、花生和漿果）；已有證據(jù)表明，RES可以防治多種疾病，包括結(jié)腸炎和結(jié)腸癌[5-6]。已有研究指出RES可通過抑制磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路降低肝癌細胞的增殖和遷移[7]。本實驗嘗試在體外研究5-FU聯(lián)合RES對人結(jié)腸癌SW620細胞的抗腫瘤活性，并觀察其作用的分子機制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑 RES購自Sigma公司，批號：492-37-10；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自英國Gibco公司；CCK8試劑盒購買于北京智杰方遠科技有限公司，批號：WST-8；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購買于武漢巴菲爾生物有限公司，批號：C1062S；p-p85、p-110β、p-PDK1、p-Akt、Akt、Cle-caspase 9、Cle-caspase 7 和 Cle-PARP 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 結(jié)腸癌SW620細胞來源于武漢巴菲爾生物有限公司，采用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%FBS、1%的100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素）孵育細胞，培養(yǎng)溫度37℃、CO2濃度為5%。待細胞生長至瓶底的90%左右，便可進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗，RES處理細胞濃度為 5、10、20、40 μmol/L，5-FU 處理細胞濃度為25、50、100、150 μmol/L，RES 和 5-FU 聯(lián)合處理濃度分別為40、50 μmol/L，干預(yù)細胞時間為24 h。

1.3 細胞活性實驗 收集各組細胞，PBS清洗細胞一遍，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值，并計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=藥物組OD值/對照組A值×100%。

1.4 細胞克隆實驗 收集各組細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并拍照。并隨機選擇10個視野，計數(shù)細胞，計算平均值作為細胞的克隆數(shù)。

1.5 細胞凋亡檢測 收集各組細胞，PBS清洗2次，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 收集各組細胞，PBS清洗細胞3次，裂解、超聲破碎、12 000 r/min離心12 min后收集上清（離心半徑=20 cm），BCA試劑盒測定上清蛋白濃度。每個樣本上樣50 μg進行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進行轉(zhuǎn)膜實驗。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入對應(yīng)一抗抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應(yīng)過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進行蛋白條帶灰度值分析。

1.7 PI3K抑制劑LY294002對SW620細胞生長的影響 取對數(shù)期細胞，接種于6孔板，將細胞分為對照組、LY294002 （2 μmol/L）、RES+5-FU 組和LY294002+RES+5-FU組。首先采用LY294002預(yù)處理SW620細胞8 h，然后采用40 μmol/L的RES和50 μmol/L的5-FU處理細胞24 h，最后檢測細胞活力、克隆數(shù)及凋亡率。

1.8 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響 取對數(shù)期細胞，接種于6孔板，將細胞分為對照組、PI3K mimics組、RES+5-FU組和PI3K mimics+RES+5-FU組。將PI3K mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW620細胞16 h，然后采用 40 μmol/L的RES和 50 μmol/L的 5-FU 處理細胞24 h，最后檢測細胞活力、克隆數(shù)及凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES增強5-FU對SW620細胞增殖的抑制作用 不同濃度 RES（5～40 μmol/L）處理 SW620 細胞24h，各濃度藥物均能夠明顯抑制細胞活力（P<0.05），見圖1A。然后采用不同 5-FU（25～150 μmol/L）與40 μmol/L的RES共同處理SW620細胞24 h，發(fā)現(xiàn)與單獨5-FU處理組比較，不同濃度5-FU+RES組中SW620細胞活力均明顯降低（P<0.05），見圖1B。另外，SW620細胞克隆檢測表明，單獨RES（40μmol/L）、單獨 5-FU（50 μmol/L）和 RES+5-FU 聯(lián)合處理均能明顯減少SW620細胞克隆數(shù)（P<0.05），并且RES+5-FU組相比于RES組和5-FU組細胞克隆數(shù)也顯著降低（P<0.05），見圖1C、1D。

圖1 RES和5-FU聯(lián)合處理對SW620細胞活力和克隆的影響Fig.1 Effects of RES and 5-FU combination on the ability and colonies of SW620 cells

2.2 RES增強5-FU對SW620細胞凋亡的誘導(dǎo)作用 與對照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達水平顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和5-FU組SW620細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達水平則明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 RES和5-FU聯(lián)合處理對SW620細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of RES and 5-FU combination on the apoptosisof SW620 cells

2.3 RES和5-FU聯(lián)合處理對SW620細胞中PI3K/Akt信號通路的影響 與對照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細胞中PI3K亞基p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和 5-FU組SW620細胞中p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平則明顯升高（P<0.05），見圖3。

圖3 RES和5-FU聯(lián)合處理對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.3 Effects of RES and 5-FU combination on the transduction of PI3K/Akt pathway

2.4 PI3K抑制劑LY294002對SW620細胞生長的影響 與對照組比較，LY294002組、RES+5-FU組和RES+5-FU+LY294002組SW620細胞活力和克隆數(shù)明顯降低，而細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+LY294002組SW620細胞活力和克隆數(shù)明顯降低，而細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），見圖4。

圖4 LY294002處理SW620細胞生長的影響Fig.4 Effects of LY294002 on the growth of SW620 cells

2.5 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響 與對照組比較，PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數(shù)顯著升高（P<0.05），RES+5-FU組和RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數(shù)顯著降低，而細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細胞活力和克隆數(shù)明顯升高，而細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見圖5。

圖5 PI3K過表達對SW620細胞生長的影響Fig.5 Effect of PI3K overexpression on the growth of SW620 cells

3 討論

5-FU作為結(jié)腸癌臨床化療的一線藥物，有效的提高了總體生存率。然而，5-FU治療也存在嚴重的局限性，如廣泛的腫瘤耐藥和毒性，導(dǎo)致治療效果受到限制，迫切需要提高其化療的效果。

已有研究指出，RES具有抗結(jié)腸癌細胞增殖和促凋亡的作用，還可以通過靶向多條信號通路治療胃腸道腫瘤[6]。本項研究主要探討結(jié)腸癌SW620細胞對RES和5-FU聯(lián)合治療的反應(yīng)。研究已證實5-FU和RES分別能抑制腫瘤細胞生長[8]，但是聯(lián)合作用抗結(jié)腸癌的活性尚不清楚。本實驗結(jié)果提示，RES和5-FU增強對結(jié)腸癌細胞生長的抑制作用是通過同時調(diào)節(jié)Caspase/PARP和PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。該研究證實RES增強了人結(jié)腸癌細胞對5-FU化療的敏感性，并考察了其聯(lián)合作用潛在的分子機制。實驗結(jié)果可作為天然化合物輔助治療提高腫瘤化療藥物療效的依據(jù)，并支撐RES和5-FU的協(xié)同作用。

流式細胞術(shù)分析表明，RES和5-FU對SW620細胞毒性的增強作用于誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)。細胞凋亡或細胞程序性死亡是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生物學(xué)過程[9]。caspase信號途徑的激活是細胞凋亡的基礎(chǔ)，其中細胞色素c從線粒體膜間隙釋放至細胞質(zhì)中是caspase依賴性凋亡通路的前提。釋放的細胞色素c可與ATP結(jié)合，并與pro-caspase 9結(jié)合形成凋亡小體，從而切斷caspase 9前體，激活效應(yīng)因子caspase 3[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，RES顯著增強5-FU介導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP的激活作用。因此，結(jié)果提示5-FU和RES聯(lián)合抑制結(jié)腸癌細胞增殖與caspase依賴性凋亡通路的激活有關(guān)。

PI3K/Akt信號通路與多種腫瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，抑制其激活已被證實能阻斷生存信號通路，加速腫瘤細胞的死亡[11-12]。針對PI3K/Akt信號通路及其相關(guān)關(guān)鍵信號分子的有效靶向作用，有望成為腫瘤治療的重要方式。本實驗發(fā)現(xiàn)，RES和5-FU聯(lián)合處理可抑制結(jié)腸癌細胞中PI3K/Akt信號通路。另外，PI3K抑制劑干預(yù)可部分促進RES和5-FU介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞凋亡，而PI3K過表達則部分降低對細胞增殖的抑制作用。然而，早期已有相關(guān)報道指出RES可通過激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低髓核細胞凋亡[13-14]。該結(jié)論與本研究結(jié)果不一致的主要原因是，PI3K/Akt在不同細胞類型中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)不同，并且RES可通過不同途徑去調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號活化，進而調(diào)節(jié)相關(guān)的生物學(xué)行為。

綜上所述，RES通過增強化療藥物抗腫瘤細胞增殖及促其凋亡活性，協(xié)同5-FU抑制結(jié)腸癌細胞的生長。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，RES協(xié)同5-FU對結(jié)腸癌SW620細胞的抑制作用，可以通過同時靶向caspase/PARP和PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為RES協(xié)同5-FU治療結(jié)腸癌的分子機制提供了新見解，并表明這種組合干預(yù)可能成為結(jié)腸癌治療的一種更有效方法。