王靜，卓思思，喬楠

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，張家口 075000）

腦缺血已成為嚴(yán)重公共衛(wèi)生威脅，中藥通過消除炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等作用在腦缺血的防治方面發(fā)揮越來越重要的作用[1-2]。研究中藥防治腦缺血的分子機(jī)制，對(duì)其靶向治療具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，澤蘭乙醇提取物對(duì)大鼠離體缺氧損傷心肌具有保護(hù)作用[3]，且發(fā)現(xiàn)澤蘭對(duì)大鼠局灶性腦組織缺血損傷及小鼠急性缺氧有不同程度的保護(hù)作用[4]，但澤蘭對(duì)神經(jīng)細(xì)胞腦缺血損傷的影響及具體機(jī)制還不清楚。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，NDRG2 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著增多[5]。電針預(yù)處理可通過抑制NDRG2表達(dá)來誘導(dǎo)腦缺血耐受[6]，七氟烷預(yù)處理可通過抑制腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2的表達(dá)和活性，減輕細(xì)胞凋亡、改善細(xì)胞功能，減輕腦缺血再灌注損傷[7]。本研究假設(shè)澤蘭提取物可能通過調(diào)控NDRG2發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞腦缺血保護(hù)作用。

本研究通過對(duì)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞進(jìn)行缺糖缺氧處理方式建立神經(jīng)細(xì)胞腦缺血損傷細(xì)胞模型，以上調(diào)和下調(diào)NDRG2表達(dá)的方法來檢測(cè)澤蘭提取物影響模型細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制，探尋澤蘭提取物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞腦缺血損傷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞購(gòu)自ATCC；澤蘭購(gòu)自中藥材市場(chǎng)，經(jīng)本院黃尚峰教授鑒定；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin、噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞礬（DMSO）、多聚甲醛購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠 NDRG2抗體（貨號(hào)：sc-376202）、Cyclin D1抗體（貨號(hào)：sc-8396）、p21抗體（貨號(hào)：sc-6246）、Bcl-2 抗體（貨號(hào)：sc-166943）、Bax抗體（貨號(hào)：sc-7480）和 GAPDH 抗體（貨號(hào)：sc-47724）購(gòu)自美國(guó) Santa公司；si-NDRG2、pcDNA3.1-NDRG2、si-NC和pcDNA3.1購(gòu)自蘇州吉瑪基因；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，顯微鏡購(gòu)自日本Olympus，全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素+1%鏈霉素），于飽和濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代，傳至10～20代時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)照組：PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)；模型組：根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法，將過夜培養(yǎng)貼壁的PC12細(xì)胞用無糖Earles平衡鹽溶液洗滌2次，換為無糖氧-糖剝奪（OGD）液，置于密閉OGD罐內(nèi)通入95%N2-5%CO2氣體30 min，然后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄OGD液更換為RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。檢測(cè)葡萄糖含量和O2含量，以證明符合缺氧缺糖的缺血模型。轉(zhuǎn)染組：模型組進(jìn)行處理完成后培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。模型組+藥物處理組：根據(jù)文獻(xiàn)[3]的方法制備澤蘭提取物，具體方法：稱取500 g澤蘭，切碎，置于95%乙醇中浸泡24 h，依次采用6倍與4倍藥物體積的乙醇回流提取，應(yīng)用回旋式減壓濃縮機(jī)濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀藥物，獲得澤蘭提取物4.75 g，將其置于DMSO（0.1%）溶液中配置母液，調(diào)整溶液濃度為10 g/L，用0.1、1、10 mg/mL的提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將PC12細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋為2×105個(gè)/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞基本融合為一層時(shí)按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：NDRG2抑制組（轉(zhuǎn)染si-NDRG2，以轉(zhuǎn)染si-NC組為對(duì)照）和NDRG2過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NDRG2，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1為對(duì)照）。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 收集澤蘭提取物處理或轉(zhuǎn)染48h的PC12細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)至24、48和96 h的時(shí)候進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，加入 20 μL（5 g/L）MTT，培養(yǎng) 4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm處的吸光度（A）值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集各組PC12細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至融合度達(dá)到約80%，棄去培養(yǎng)液，洗滌消化，收集細(xì)胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，先加200 μL binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和 5μL 碘化丙啶（PI），室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組PC12細(xì)胞，超聲破碎并離心收集蛋白，測(cè)定總蛋白濃度。取蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗NDRG2（1∶1 000）、Cyclin D1 抗體（1∶3 000）、p21 抗體（1∶2 000）、Bcl-2 抗體（1∶2 000）、Bax 抗體（1∶2 000）和 GAPDH 開頭（1∶4 000），4℃孵育過夜，TBST 洗膜2次，加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，顯影拍照，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型增殖的影響 與對(duì)照組相比，模型組PC12細(xì)胞OD值顯著降低，CyclinD1表達(dá)降低，p21表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10 mg/mL組PC12細(xì)胞OD值升高，CyclinD1表達(dá)升高，p21表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），澤蘭提取物可促進(jìn)腦缺血損傷模型PC12細(xì)胞增殖，見圖1。

圖1 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型增殖的影響Fig.1 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on proliferation of cerebral ischemicinjury model PC12 cells

2.2 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型凋亡的影響 與對(duì)照組相比，模型組PC12細(xì)胞凋亡率均升高，Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10 mg/mL組PC12細(xì)胞凋亡率均降低，Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。澤蘭提取物可抑制腦缺血損傷模型PC12細(xì)胞凋亡。

圖2 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型凋亡的影響Fig.2 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.3 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型中NDRG2表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組PC12細(xì)胞中NDRG2表達(dá)升高（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10mg/mL組PC12細(xì)胞中NDRG2表達(dá)降低（P<0.05），見圖3。澤蘭提取物可抑制腦缺血損傷模型PC12細(xì)胞中NDRG2表達(dá)。

圖3 澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型中NDRG2表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on expression of NDRG2 in cerebral ischemic injury model PC12 cells

根據(jù)以上結(jié)果，澤蘭提取物10 mg/mL組效果最佳，選擇10 mg/mL澤蘭提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 抑制NDRG2對(duì)腦缺血損傷模型增殖、凋亡的影響 與模型組+si-NC組相比，模型組+si-NDRG2組P12細(xì)胞OD值升高，凋亡率下降，NDRG2、p21和Bax表達(dá)降低，Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。說明抑制NDRG2表達(dá)可促進(jìn)模型組PC12細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 抑制NDRG2對(duì)腦缺血損傷模型增殖、凋亡的影響Fig.4 Effects of NDRG2 inhibition on proliferation and apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.5 過表達(dá)NDRG2能逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型增殖的促進(jìn)作用 與模型組相比，模型組+澤蘭10mg/mL組PC12細(xì)胞OD值升高，NDRG2和p21表達(dá)降低，Cyclin D1表達(dá)增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組+澤蘭 10 mg/mL+pcDNA3.1組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL+pcDNA3.1-NDRG2組PC12細(xì)胞OD值降低，NDRG2和p21表達(dá)增多，CyclinD1表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。過表達(dá)NDRG2可逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)模型組PC12細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。

圖5 過表達(dá)NDRG2能逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型增殖的促進(jìn)作用Fig.5 Over-expression of NDRG2 reversed the effect of Lycopus lucidus Turcz extract on proliferation of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.6 過表達(dá)NDRG2能逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型凋亡的抑制作用 與模型組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL組PC12細(xì)胞OD值升高，NDRG2和p21表達(dá)降低，Cyclin D1表達(dá)增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組+澤蘭10mg/mL+pcDNA3.1組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL+pcDNA3.1-NDRG2組PC12細(xì)胞OD值降低，NDRG2和p21表達(dá)增多，Cyclin D1表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。過表達(dá)NDRG2可逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)模型組PC12細(xì)胞凋亡抑制作用。

3 討論

澤蘭提取物具有抗癌、抗氧化和抗菌活性[9]。澤蘭水提取物可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)HIF-1a及其下游蛋白表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞H9C2免受H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[10]。澤蘭對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變具有保護(hù)作用，可減輕氧化應(yīng)激、炎癥和血管生成因子的水平[11]。本研究通過對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行缺糖缺氧處理方式建立神經(jīng)細(xì)胞腦缺血損傷細(xì)胞模型，然后用0.1、1、10 mg/mL的澤蘭提取物對(duì)模型組細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)1 mg/mL和10 mg/mL澤蘭提取物均可使模型組PC12細(xì)胞OD值升高，CyclinD1和Bcl-2表達(dá)升高，p21和Bax表達(dá)降低，促細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了澤蘭提取物對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。

圖6 過表達(dá)NDRG2能逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)腦缺血損傷模型凋亡的抑制作用Fig.6 Over-expression of NDRG2 reversed the effect of Lycopus lucidus Turcz extract on apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

NDRG2是一種與腫瘤抑制和細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的基因，參與癌癥能量代謝和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[12-13]。NDRG2在短暫的局灶性腦缺血耐受反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，C6來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD暴露后p53相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)因子，沉默NDRG2表達(dá)具有促增殖作用，可降低OGD暴露后Bax/Bcl-2比值[14]。2-花生四烯基甘油（2-AG）通過阻斷NDRG2信號(hào)和STAT3磷酸化來保護(hù)缺氧-葡萄糖環(huán)境中的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞[15]。在實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注（I/R）大鼠模型中，抑制miR-301a可靶向NDRG2改善細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，對(duì)大鼠腦I/R損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組PC12細(xì)胞中NDRG2蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)，與上述結(jié)論[14]一致；1 mg/mL和10 mg/mL澤蘭提取物均可抑制模型組細(xì)胞中NDRG2表達(dá)，抑制NDRG2表達(dá)可促進(jìn)模型組PC12細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡；過表達(dá)NDRG2可逆轉(zhuǎn)澤蘭提取物對(duì)模型組PC12細(xì)胞增殖和凋亡的作用，證實(shí)了澤蘭提取物通過調(diào)控NDRG2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞腦缺血起保護(hù)作用。

綜上，本研究闡述了在腦缺血細(xì)胞模型中，澤蘭提取物可通過抑制NDRG2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。說明澤蘭提取物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞腦缺血具有潛在的治療作用，NDRG2可能是腦缺血的潛在分子靶點(diǎn)。