王曉麗 ，李春霞 ，陳倩 ，王佳 ，王濤 ，陳曉鵬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300385）

腸道菌群被認(rèn)為是人體內(nèi)不可或缺的“器官”，其代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸（SCFAs）也被證實(shí)生物學(xué)作用顯著。SCFAs主要包括碳原子數(shù)小于6的、有揮發(fā)性且溶于水的游離脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸、異戊酸。現(xiàn)有研究表明SCFAs在協(xié)調(diào)腸道穩(wěn)態(tài)、葡萄糖功能、食欲、能量代謝的調(diào)節(jié)、炎癥和免疫能力以及腫瘤和結(jié)腸癌等方面有積極的作用[1]。有研究表明SCFAs可以促進(jìn)下游因子的分泌[2]，如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和肽YY（PYY），其會(huì)促進(jìn)腸道的糖異生作用并且能夠降低血糖水平。另有研究顯示SCFAs可以刺激瘦素的表達(dá)，還可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體抑制脂肪細(xì)胞的脂解作用，并激活A(yù)MP蛋白激酶（AMPK）是主要的細(xì)胞燃料指標(biāo)和代謝穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者[3-4]。丙酸鹽和丁酸鹽激活腸道糖異生過(guò)程主要通過(guò)腸-腦神經(jīng)回路的作用，以此來(lái)降低體質(zhì)量并控制葡萄糖的代謝[5]。因?yàn)镾CFAS是免疫應(yīng)答的介質(zhì)，所以能夠增加外周血單核細(xì)胞（PBMCs）抗炎細(xì)胞因子的生成，而且通過(guò)促進(jìn)外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分化過(guò)程，丁酸和丙酸還可以維持免疫穩(wěn)態(tài)[6]。

在中國(guó)，中藥治療糖尿病及其并發(fā)癥有著悠久的歷史。愈來(lái)愈多的研究表明，中藥可以通過(guò)多成分、多途徑、多靶點(diǎn)治療糖尿病并發(fā)癥，其中，中藥復(fù)方腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病腎病的治療作用日漸受到關(guān)注。腎炎康復(fù)片是源于《金匱要略》中的腎氣丸的演變方[7]，方中包含人參、西洋參、地黃、山藥、杜仲（炒）、白花蛇舌草、黑豆、益母草、丹參、土茯苓、澤瀉、白茅根、桔梗，其主要功效是養(yǎng)陰益氣，健脾補(bǔ)腎，清解余毒。主治屬于氣陰兩虛，脾腎不足，毒熱未清的慢性腎小球腎炎，主要病理表現(xiàn)為神疲乏力、腰酸腿軟、面浮肢腫、頭暈耳鳴、蛋白尿、血尿等。臨床證據(jù)表明[8-9]腎炎康復(fù)片與西藥聯(lián)用對(duì)糖尿病腎病的病理表現(xiàn)有較好的改善作用。并且課題組前期實(shí)驗(yàn)生理指標(biāo)檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)[10]，db/db小鼠相比于正常小鼠，會(huì)出現(xiàn)糖尿病腎病的相關(guān)癥狀，且經(jīng)腎炎康復(fù)片和二甲雙胍干預(yù)后可明顯減輕上述癥狀。

本研究從腸道菌群的代謝產(chǎn)物SCFAs的含量測(cè)定出發(fā)，尋找腎炎康復(fù)片干預(yù)糖尿病腎病的微生態(tài)治療靶點(diǎn)，以期闡明基于腸道微生態(tài)的腎炎康復(fù)片治療糖尿病腎病作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 7890B-7000D氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（GC-MS/MS，Agilent，美國(guó)），5424R 離心機(jī)（30×1.5/2.0 mL，Eppendorf，德國(guó)），MM400 球磨儀（Retsch），AS60/220.R2電子天平，MIX-200多管渦旋振蕩器（上海凈信，中國(guó)），KQ5200E超聲清洗儀（昆山舒美，中國(guó)）。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸、2-甲基戊酸、甲基叔丁基醚（色譜純，CNW），異戊酸（aladdin，中國(guó)），磷酸（上海滬試，中國(guó)）。

1.2 樣品的采集和制備

1.2.1 樣品的采集 由南京大學(xué)動(dòng)物模型研究中心提供的7周齡2型糖尿病BKS-Leprem2Cd479/Gpt小鼠[db/db 小鼠，體質(zhì)量（40±2）g，無(wú)特定病原體]32只和正常小鼠[m/m 小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，無(wú)特定病原體]8只，許可證編號(hào)：SCXK2018-0008，將所有小鼠飼養(yǎng)在溫度和濕度可控的實(shí)驗(yàn)室（室溫：22℃，濕度：60%），光照/黑暗周期為12 h，可自由進(jìn)食和飲水，所有實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格遵守中國(guó)科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理指南》（2006）以及天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用和護(hù)理委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用護(hù)理指導(dǎo)意見(jiàn)》（IRM-DWLL-2019033）。課題組檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的生理指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)[10]，在體質(zhì)量方面，db/db小鼠明顯高于正常小鼠；其次在腎臟質(zhì)量指數(shù)方面，與正常小鼠相比，db/db小鼠表現(xiàn)出更低的腎臟質(zhì)量指數(shù)；在攝食和飲水方面，db/db小鼠的攝食和飲水量明顯高于正常小鼠；并且db/db小鼠的空腹血糖狀態(tài)和HbA1c的水平明顯高于正常小鼠；同時(shí)db/db小鼠的尿量、微量白蛋白（MALB）、尿白蛋白肌酐比值（UACR）也明顯增加。說(shuō)明db/db具有糖尿病腎病的相關(guān)癥狀，db/db小鼠后期可自發(fā)形成糖尿病腎病的模型。

在對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從db/db小鼠的眼底靜脈叢中抽取0.2 mL血液以檢測(cè)血糖水平。將它們隨機(jī)分為4組，每組8只：模型組，腎炎康復(fù)片高、低劑量組和二甲雙胍組，并將年齡匹配的m/m小鼠指定為正常組。腎炎康復(fù)片高劑量組的劑量為2 g/kg，低劑量組的劑量為1 g/kg，腎炎康復(fù)片低劑量組的劑量是根據(jù)2020年《中國(guó)藥典》提供的人類臨床劑量確定的。二甲雙胍組的劑量為200 mg/kg。給藥后3個(gè)月，將每只小鼠置于代謝籠中，收集24 h糞便，記錄質(zhì)量，并將其置于-80℃的冰箱中用于后期實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.2 樣品的制備 1）稱取樣本20 mg于2 mL的EP管中，加入1 mL磷酸（0.5%v/v）溶液，加入1顆小鋼珠，20 Hz下球磨儀10 s，重復(fù)2次，渦旋10 min混勻（所有渦旋操作都將渦旋儀頻率調(diào)到最大），再冰浴下超聲5 min。2）12 000 r/min、4℃條件下離心10 min（離心半徑=6 cm，下同），取上清液 100 μL 加入到對(duì)應(yīng)的已編號(hào)的1.5 mL離心管中，加入500 μL含內(nèi)標(biāo)（2-甲基戊酸）的甲基叔丁基醚溶劑，渦旋3 min。冰浴下超聲5 min；之后在12 000 r/min、4℃條件下離心10 min。3）離心完后吸取上層清液200 μL到編號(hào)有玻璃內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，-20℃冰箱保存，待GC-MS/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、5、8、10 和20 μg/mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比（Concentration Ratio）為橫坐標(biāo)，外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Area Ratio）為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件為色譜柱：DBFFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；流速為1.2 mL/min；采用分流模式，進(jìn)樣口溫度為200℃，分流比為1∶1；升溫程序：起始溫度90℃保持1 min；以25℃/min升至100℃；以20℃/min升至150℃；以25℃/min升至200℃，保持0.5 min，后運(yùn)行 3 min；進(jìn)樣量為 2 μL。

質(zhì)譜條件為離子源：EI電子源；掃描模式：MRM采集參數(shù)見(jiàn)表1；電子能量70 eV；傳輸線溫度230℃；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃。

表1 MRM采集參數(shù)表Tab.1 MRM acquisition parameter table

1.5 方法學(xué)考察 精密度：精密吸取混合對(duì)照品溶液，在“氣相色譜-質(zhì)譜條件”項(xiàng)條件下，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每日6次，記錄各成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）；加樣回收率：精密稱取樣品，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120%加入7種SCFAs對(duì)照品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，在“1.4”項(xiàng)條件下分析，記錄各成分的峰面積，計(jì)算加樣回收率平均值。

1.6 樣本質(zhì)控分析 以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為質(zhì)控樣本（QC），在儀器分析過(guò)程中，每隔10個(gè)檢測(cè)分析樣本插入1個(gè)QC樣本，通過(guò)對(duì)同一質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流色譜圖（TIC）進(jìn)行重疊展示分析，可以判斷數(shù)據(jù)檢測(cè)期間儀器的穩(wěn)定性。

1.7 SCFAs的含量測(cè)定 將檢測(cè)到的所有樣本的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步帶入計(jì)算公式計(jì)算后，最終得到實(shí)際樣本中該物質(zhì)的絕對(duì)含量數(shù)據(jù)。

V1：磷酸體積（μL）；c：樣本中積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值（μg/mL）；V2：上清液體積（μL）；V：樣品提取過(guò)程中加入提取液的體積（μL）；m：稱取的樣本質(zhì)量（g）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Pearson線性相關(guān)與回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣本的質(zhì)控分析 混合標(biāo)準(zhǔn)品的TIC圖分析顯示該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的總離子流圖重疊性高，見(jiàn)圖1，即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明此項(xiàng)目檢測(cè)期間儀器穩(wěn)定，為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要的保障。并且從圖中可見(jiàn)SCFAs的色譜峰分離較好，峰形尖銳對(duì)稱，能夠?qū)Ω鞔x物進(jìn)行質(zhì)譜定量。

圖1 混標(biāo)溶液的TIC重合圖Fig.1 TIC coincidence diagram of mixed standard solution

2.2 線性關(guān)系的考察 以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)，外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程。各待測(cè)物含量在線性范圍內(nèi)的線性良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.998 1，滿足檢測(cè)需要。方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見(jiàn)表2。

表2 7種短鏈脂肪酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of 7 kinds of short-chain fatty acids

2.3 方法學(xué)考察 利用混標(biāo)溶液對(duì)檢測(cè)過(guò)程的儀器的精密度進(jìn)行考察。顯示其精密度RSD<6.17%；選取1組樣本按樣本含量的80%、100%、120%加標(biāo)量進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果顯示其平均回收率在90%～101%之間，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

表3 精密度和加樣回收率Tab.3 Precision and sample recovery rate

2.4 含量的測(cè)定 將檢測(cè)到的所有樣本的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步帶入計(jì)算公式計(jì)算后，最終得到實(shí)際樣本中該物質(zhì)的絕對(duì)含量數(shù)據(jù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將獲得的各SCFAs的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明經(jīng)腎炎康復(fù)片和二甲雙胍的干預(yù)可不同程度地降低SCFAs的含量，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示與模型組相比，給藥組的丙酸含量顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 糞便樣品TIC圖譜Fig.2 TIC spectrum of fecal sample

圖3 腎炎康復(fù)片干預(yù)對(duì)丙酸含量的影響Fig.3 Effect of Shenyan Kangfu Tablets intervention on the content of propionic acid

3 討論

前期課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病腎病小鼠的腸道微生態(tài)發(fā)生了嚴(yán)重的紊亂[10]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與給藥組相比所測(cè)的7種SCFAs的含量相較于模型組都有降低的趨勢(shì)，其中丙酸的降低趨勢(shì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這一結(jié)果與腸道菌群豐度的研究中腎炎康復(fù)片可以降低擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度密切相關(guān)。

丙酸主要是由腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群擬桿菌門(mén)參與代謝生成的，經(jīng)結(jié)腸吸收以后由肝臟代謝參與糖異生并用作能量來(lái)源[11-12]，因此在能量代謝中發(fā)揮著重要作用，且對(duì)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)具有不可替代的作用。Bartolomaeus等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ干預(yù)的小鼠高血壓模型中，丙酸鹽可以減弱多種T細(xì)胞對(duì)血管緊張素Ⅱ的應(yīng)答，如輔助性T細(xì)胞17的減少，且丙酸鹽發(fā)揮依賴于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡輔助性T細(xì)胞17對(duì)血管緊張素Ⅱ引起的效應(yīng)因子的反應(yīng)，從而發(fā)揮降低血壓等作用。SCFAs可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路抑制炎癥細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子[14-15]。所以依此來(lái)推斷，丙酸可能在糖尿病腎病機(jī)體中通過(guò)調(diào)節(jié)異常的能量代謝過(guò)程和減緩腎臟的炎癥反應(yīng)來(lái)減輕糖尿病腎病的病理表現(xiàn)。

糖尿病腎病患者體內(nèi)存在嚴(yán)重的腸道菌群紊亂可導(dǎo)致擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，導(dǎo)致丙酸的生成量減少，從而對(duì)宿主多種生理過(guò)程產(chǎn)生重要的影響。腸道菌群主要由4大類菌門(mén)組成，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)占主導(dǎo)，還包括變形菌門(mén)及放線菌門(mén)[11，16]。常見(jiàn)產(chǎn)生SCFAs的菌群主要為厭氧菌，包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬等。本課題組的前期研究[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)腎炎康復(fù)片干預(yù)的db/db小鼠在16S rDNA檢測(cè)中，二甲雙胍和腎炎康復(fù)片處理可顯著降低擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，而變形桿菌門(mén)的相對(duì)豐度并沒(méi)有明顯變化。擬桿菌和變形桿菌的相對(duì)豐度與小鼠的HbA1c水平、MALB和UACR呈顯著的正相關(guān)。HbA1c是通過(guò)緩慢、持續(xù)及不可逆的糖化反應(yīng)形成，其含量的多少取決于血糖濃度以及血糖與血紅蛋白接觸時(shí)間，被用作糖尿病控制的監(jiān)測(cè)指標(biāo)；MALB可作為全身性或局部炎癥反應(yīng)的腎功能指標(biāo)；UACR是用于監(jiān)測(cè)尿蛋白排出情況的一種新的可靠方法。并且將擬桿菌門(mén)的變化趨勢(shì)與小鼠血液中的炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β作相關(guān)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)這兩者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。短鏈脂肪酸的含量測(cè)定結(jié)果顯示腎炎康復(fù)片可降低丙酸的含量，與腎炎康復(fù)片可使擬桿菌門(mén)的豐度降低結(jié)果是一致的，由此推出，各生理指標(biāo)的變化與丙酸含量的降低有密不可分的關(guān)系的。

由上述結(jié)果可以得出，腎炎康復(fù)片改善糖尿病腎病的作用機(jī)制之一可能是改善腸道菌的代謝紊亂，降低擬桿菌的相對(duì)豐度，不僅會(huì)導(dǎo)致丙酸的生成減少，還可以抑制炎性因子的表達(dá)，回調(diào)機(jī)體的病理狀態(tài)。