李丹陽,孫玲偉,吳彩鳳,張樹山,張德福*,戴建軍*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106)

長江三角洲白山羊，又稱海門山羊，是長江三角洲地區(qū)主要山羊品種之一，是我國珍貴的少有的皮、肉、毛兼優(yōu)的山羊品種[1]。其羊毛潔白、彎曲少、具光澤，常用于制筆，有“筆料毛山羊”之稱；肉質(zhì)細(xì)嫩、膻味小、脂肪分布均勻、味道鮮美；皮質(zhì)致密、柔韌，為革皮原料。崇明白山羊?qū)儆陂L江三角洲白山羊的一個(gè)分支，在上海崇明島特定水土條件下孕育而成?，F(xiàn)如今，長江三角洲地區(qū)白山羊絕大部分為雜交群體，純種海門山羊和崇明白山羊的飼養(yǎng)僅限于個(gè)別保種場內(nèi)，因此對該品種的種質(zhì)資源保護(hù)和利用提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

物種或居群的遺傳多樣性大小是長期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提[2]。目前評估遺傳多樣性的分子標(biāo)記遺傳方法有多種，包括微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)[3]、MHC區(qū)域突變[4]、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)[5]、線粒體DNA[6]等。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量多、基因組內(nèi)分布廣、多態(tài)性豐富、呈孟德爾共顯性遺傳、檢測快速方便等特點(diǎn)，廣泛用于分析生物遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)。

本研究選取30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析長江三角洲地區(qū)兩個(gè)純種白山羊保種群體(海門山羊和崇明白山羊)和一個(gè)雜交群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，為長江三角洲白山羊群體的種質(zhì)資源保存、雜交利用和品種選育作數(shù)據(jù)支撐，為保護(hù)其特定良好基因提供理論依據(jù)。保護(hù)白山羊遺傳多樣性還可以保證育種生產(chǎn)能對環(huán)境、疾病和市場需求的變化做出及時(shí)和有效的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)樣品 供試海門山羊(Haimen goat，HM)和崇明白山羊(Chongming goat，CM)分別來源于江蘇金盛山羊繁育技術(shù)發(fā)展有限公司和上海崇明園都畜牧養(yǎng)殖有限公司，崇明本地雜交白山羊(hybrid white goat，ZY)的血液樣品來源于上海崇明島山羊養(yǎng)殖戶。因選擇群體的純種白山羊飼養(yǎng)規(guī)模較小，根據(jù)公羊采樣規(guī)模不低于10%的要求(NY/T1673—2008)[7]并結(jié)合相關(guān)研究進(jìn)展[8-10]，每個(gè)群體選取樣本30只，其中公羊10只，母羊20只，抽取EDTA-K2抗凝血樣3 mL用于后續(xù)微衛(wèi)星檢測。

1.1.2主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，ROX500內(nèi)標(biāo)購自克勞寧(北京)生物科技有限公司，引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì) 使用聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)及國際遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)的推薦和中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[7]所規(guī)定的30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，合成熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物(表1)。

續(xù)表 Continued序號Number位點(diǎn)名稱Locus染色體位置Chromosome position引物序列Primer sequence(5′-3′)退火溫度Annealing temperature/℃等位基因大小Allele size/bp P26INRABERN185CHI18CAATCTTGCTCCCACTATGCCTCCTAAAACACTCCCACACTA55261～289P27BM6444BTA2CTCTGGGTACAACACTGAGTCCTAGAGAGTTTCCCTGTCCATCC65118～200P28P19(DYA)AACACCATCAAACAGTAAGAGCATAGTAACAGATCTTCCTACA55160～196P29TCRVB6BTA10GAGTCCTCAGCAAGCAGGTCCCAGGAATTGGATCACACCT55217～255P30DRBP1BTA23ATGGTGCAGCAGCAAGGTGAGCAGGGACTCAGTCTCTCTATCTCTTTG58195～229

1.2.2PCR 擴(kuò)增 利用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：DNA 5 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.4 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 10.7 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

1.2.3毛細(xì)管電泳 將產(chǎn)物稀釋10倍，與ROX500內(nèi)標(biāo)0.25 μL和超純?nèi)ルx子甲酰胺12.5 μL，混勻，95 ℃ 5 min，冰浴3 min，利用ABI3730測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Popgene 3.4進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、等位基因數(shù)目(number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、Shannon指數(shù)(I)、Hard-Weinberg平衡(HWE)等指標(biāo)，通過PIC-Cale軟件分析多態(tài)信息含量(polymorphism information contents，PIC)。

使用FSTAT 2.9.3.2評估F-統(tǒng)計(jì)量(Fit和Fst)、基因流(Nm)。利用R 3.2.1(https://cran.r-project.org/bin/windows/base)對群體間遺傳分化的主成分進(jìn)行分析，通過Dispan軟件分析各群體間Nei’s遺傳距離和相似系數(shù)，同時(shí)利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建群體間UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)山羊群體等位基因頻率分析

從三個(gè)山羊群體的30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率(圖1)可以看出，三個(gè)群體在所檢測到的等位基因中基因頻率低的所占比例高，高頻率所占比例低，符合L形態(tài)分布。其中CM最低基因頻率為0.016 7，占17%，而最高頻率為0.983 3；HM最低頻率為0.020 0，占17%，最高頻率為0.92；ZY最低頻率為0.006 8，占9%，最高頻率為0.924 7。

圖1 三個(gè)群體的等位基因頻率分布Fig.1 Allele frequency distribution of the three populations

2.2 三個(gè)山羊群體在30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性分析

由表2可知，30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在CM群體上的等位基因數(shù)(Na)為2(INRABERN185)～12(BM6444)個(gè)，累計(jì)等位基因數(shù)191個(gè)；HM群體的等位基因數(shù)為3(MAF209等)～13(BM6444)個(gè)，累計(jì)205個(gè)；ZY群體的等位基因數(shù)范圍為2(ETH10、MAF209)～9(BM6444)個(gè)，累計(jì)147個(gè)。部分位點(diǎn)出現(xiàn)期望雜合度小于觀測雜合度(Ho

表2 三個(gè)群體在30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性分析Table 2 Genetic diversity indices at 30 microsatellite locus in the three goat populations

2.3 三個(gè)山羊群體遺傳變異結(jié)果

由表3可知，有效等位基因數(shù)(Ne)HM>CM>ZY，分別為4.012、3.812、3.092。觀察雜合度(Ho)均值CM為0.726、HM為0.691、ZY為0.633，期望雜合度(He)CM為0.668、HM為0.683、ZY為0.617，Ho均大于He。I值均大于1(CM>ZY>HM)。CM群體的PIC均值為0.630、HM為0.647、ZY為0.567，都大于0.5，為高度多態(tài)?？傮w上處于H-W平衡，均高于0.05，可以保持其大小和相對應(yīng)的等位基因頻率穩(wěn)定。兩個(gè)純種白山羊群體和雜交繁育群體均表現(xiàn)出較高的雜合度，高度多態(tài)性和較高的遺傳變異程度。

表3 三個(gè)群體遺傳變異結(jié)果Table 3 Genetic variation results of three populations

2.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化

表4統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，三個(gè)山羊群體的總?cè)后w近交系數(shù)(Fit)為0.011 0，近交繁殖率低。平均基因流(Nm)為4.680 6。平均群體間基因分化系數(shù)(Fst)為0.050 7，處于0.05～0.15之間，5.07%的遺傳變異由于群體間引起的，而94.93%遺傳變異分布于群體內(nèi)，遺傳分化程度中等，存在基因交流。

表4 30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)F-統(tǒng)計(jì)量分析Table 4 Results of F-statistics for each of 30 markers

2.5 三個(gè)山羊群體遺傳距離及聚類分析

由表5可知，三個(gè)地方山羊群體中崇明白山羊和崇明雜交山羊相似系數(shù)最大(0.909 2)、遺傳距離最近(0.095 2)；海門山羊和崇明雜交山羊相似系數(shù)較小(0.811 8)，遺傳距離較遠(yuǎn)(0.208 5)。基于等位基因頻率對三個(gè)山羊群體進(jìn)行主成分分析(圖2)，崇明白山羊與崇明雜交山羊空間坐標(biāo)距離較近，具有相似的主要成分。依據(jù)遺傳相似系數(shù)對這三個(gè)群體進(jìn)行聚類分析(圖3)，結(jié)果亦與表5結(jié)果一致，與主成分分析相似。

表5 三個(gè)地方山羊群體的Nei’s遺傳距離和相似系數(shù)Table 5 Nei’s genetic distance and genetic similar index among three local goat populations

圖3 三個(gè)山羊群體UPGMA聚類分析Fig.3 Dendrogram of three goad population relationship using DA-UPGMA

3 討論

利用30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，崇明白山羊、海門山羊和崇明雜交白山羊群體得到等位基因數(shù)分別為191、205和147個(gè)，有效等位基因數(shù)分別為3.812、4.012和3.092個(gè)，說明群體遺傳變異較大，遺傳多樣性豐富。王蘭萍等[11]對長江三角洲白山羊的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果平均雜合度達(dá)到0.887，高度雜合。本研究中CM、HM和ZY三個(gè)群體的平均雜合度分別為0.668、0.683和 0.617，比上述研究結(jié)果有所降低，可能原因是群體較小且長期封閉管理導(dǎo)致。雜合度Ho和期望雜合度He均大于0.5，且Ho均大于He，說明群體中近交程度較輕，但在部分位點(diǎn)出現(xiàn)Ho0.7最優(yōu)遺傳標(biāo)記；PIC>0.5高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25～0.5為中度多態(tài)位點(diǎn)；PIC<0.25為低度多態(tài)位點(diǎn))，30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中只有2個(gè)位點(diǎn)低于0.25，海門山羊PIC均值最高,接近0.7，其余兩個(gè)群體也都大于0.5，呈現(xiàn)高度多態(tài)。呂曉陽等[14]曾用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析海門山羊及徐淮山羊的遺傳多樣性，海門山羊平均PIC為0.311，多態(tài)信息含量不夠豐富，與本研究略有差異，可能與微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇有關(guān)。三個(gè)群體的H-W平衡的平均概率差異不顯著，說明這些群體能夠保持其大小和相對等位基因頻率穩(wěn)定。然而，三個(gè)群體中的部分基因座明顯偏離了H-W平衡?？赡茈S著等位基因數(shù)和雜合度的降低，群體在微衛(wèi)星基因座上也失去了相對的等位基因頻率，導(dǎo)致基因座偏離了H-W平衡[15]。顯著的近交估計(jì)導(dǎo)致同質(zhì)性和嚴(yán)重的Wahlund效應(yīng)(Ho

有研究發(fā)現(xiàn)，雜交山羊的生長性狀得到明顯提高，但對遺傳多樣性方面研究較少[18]。從上述結(jié)果可以看出，雜交山羊30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增得到的總等位基因數(shù)明顯低于其他兩個(gè)群體，Na、PIC、I值及雜合度的均值與其他兩個(gè)群體相較也略低，說明雜交白山羊的多樣性是不如其他兩個(gè)群體豐富。雜交育種雖可以培育新的品種得到優(yōu)良性狀，但需要對雜交后代進(jìn)行長期的觀察培育。

Wright[19]提出，F(xiàn)-統(tǒng)計(jì)量(Fit、Fst、Nm)與遺傳分化程度、近親繁殖率、Hardy-Weinberg平衡偏離指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，其值在0.05～0.15間，屬中等分化水平。Nm主要分析群體間的基因交流程度，Nm越大基因交流越頻繁[20]。本研究三個(gè)山羊群體的基因分化系數(shù)(Fst)為0.050 7，和河北7個(gè)山羊群體[8]和云南山羊群體[9]分化程度相差不大。三個(gè)群體的Nm值為4.680 6。說明雖然經(jīng)過長期自然選擇、人工選擇、遺傳漂變及地理隔離等因素，三個(gè)山羊群體并未產(chǎn)生較大的遺傳分化，同屬于長江三角洲白山羊，崇明白山羊?yàn)橐粋€(gè)分支。遺傳距離和主成分分析也顯示，崇明白山羊和崇明雜交山羊親緣關(guān)系較近，崇明雜交群體和崇明群體聚類為一支，該結(jié)果與崇明山羊群體絕大部分為崇明白山羊經(jīng)雜交繁育而來的事實(shí)情況相符。