雷燕妮，張小斌，陳書存，劉長霞，李多偉

(1.商洛學院 陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000；2.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000；3.西安宇沐生物技術(shù)研究院有限公司，陜西 西安 710001；4.西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Fr)Link]屬子囊菌亞門(Ascomyxotina)麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬[1,2]，與冬蟲夏草同屬，是一種具有滋補作用的營養(yǎng)品和中藥。隨著蛹蟲草種植面積的不斷擴大，采收蛹蟲草子實體后的大量菌渣被廢棄，或僅作為飼料、肥料使用，并沒有得到充分利用。有資料表明，采收蛹蟲草后的菌渣中尚含有大量蟲草素、多糖及蛋白質(zhì)等[3,4]，蟲草素具有抗病毒、抑菌、明顯抑制腫瘤生長，與環(huán)磷酰胺有明顯的協(xié)同作用，并有降血糖的作用。蟲草多糖具有提高機體免疫功能，抑制腫瘤作用[5～7]。

如何合理充分利用蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖這些功效成分，以及將所含有的大量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有功效作用的多肽是很多學者關注的問題[8,9]，這些多肽不僅有比蛋白質(zhì)和氨基酸更好的消化吸收性能，還有促進蟲草素、多糖等功效成分的吸收與轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)人體生理機能、預防疾病、增強機體抵抗力、清除自由基、改善氮素吸收關系、促進礦物質(zhì)運輸吸收，以及調(diào)節(jié)食品風味與質(zhì)地等作用。

筆者研究采用熱回流和超聲波提取技術(shù)，利用專項酶切技術(shù)把蛹蟲草菌渣中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為的多肽[10,11]、蟲草素及多糖等分別提取出來，獲得蟲草素、多糖、多肽健康食品原料，旨在為進一步開發(fā)蛹蟲草健康食品、保健品等人類健康服務提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

蛹蟲草菌渣由西安宇沐生物技術(shù)研究院有限公司蛹蟲草種植實驗基地提供，樣品于65℃干燥后粉碎過40目篩備用。蛹蟲草由李智選研究員(西北大學生命科學學院植物教研室)鑒定為麥角菌科蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Fr)Link]。

蟲草素對照品：為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純；葡萄糖、乙醇、三氯乙酸、乙酸、硼酸、磺基水楊酸、鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器

美國 Waters公司1525型高效液相色譜、上海鈮歐儀器有限公司2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、林茂科技(北京)有限公司SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵、上海博訊HH.S21-4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋、日本島津公司UV-265型紫外分光光度計、梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司AB-204N精密電子天平、廣州吉迪儀器有限公司JIDI-6D臺式低速大容量離心機、寧波新芝儀器設備有限公司SB-4200DT超聲提取器、安徽科博瑞環(huán)境科技有限公司KBR-TU-1812多功能膜設備、上海和晟儀器科技有限公司實驗室小型真空干燥箱、武漢理科光電技術(shù)有限公司FW-100型高速萬能粉碎機等。

2 實驗及結(jié)果分析

2.1 含量分析測試方法

蟲草素含量采用HPLC法測定，蟲草多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[12]，蟲草多肽含量采用HPLC法測定和UV法測定[13,14]。

2.2 蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖、多肽綜合提取分離工藝流程

取蛹蟲草菌渣粉末10.00g用水或醇經(jīng)熱回流提取或超聲波提取，過濾，濾液用5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子蟲草素的濾出液和含有大分子多糖、蛋白質(zhì)的濾余液，濾出液濃縮干燥得蟲草素提取物產(chǎn)品，濾余液用蛋白酶酶解，再經(jīng)5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子多肽的濾出液和含有大分子多糖的濾余液，濾出液、濾余液分別濃縮干燥得多肽提取物產(chǎn)品和多糖提取物產(chǎn)品。

2.3 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取的單因素實驗

2.3.1 選擇綜合提取蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖、蛋白質(zhì)的方法和溶劑 取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取4份，每份5 g，按液料比10∶1的比例分別加入水、濃度35%乙醇溶液、濃度55%乙醇溶液和濃度75%乙醇溶液各100 mL于250 mL燒瓶中，95℃熱回流提取2.5 h，離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量，見表1。

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取4份，每份5 g，按液料比10∶1的比例分別加入水、濃度35%乙醇溶液、濃度55%乙醇溶液和濃度75%乙醇溶液各100 mL于250 mL燒瓶中，超聲提取1.0 h，離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量，見表1。

表1 不同提取方法和不同提取溶劑對蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的提取效果(n=3)

從表1可以看出，對蟲草素而言，乙醇提取與水提取相差不大；水超聲提取(0.0188%)略高于水熱回流提取(0.0172%)；醇超聲提取(0.0205%)略高于醇熱回流提取(0.0184%)。

對蟲草多糖而言，水提取遠大于乙醇提取；水熱回流提取(4.02%)遠大于水超聲提取(0.89%)。

對蟲草蛋白質(zhì)而言，水提取遠大于乙醇提取；水超聲提取(16.68%)略高于水熱回流提取(15.42%)。從提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合考慮應采用水熱回流提取為最佳。水熱回流提取既可以提取出蟲草素，又可以提取出蟲草多糖和蛋白質(zhì)，可以充分利用原料，減少生產(chǎn)成本。

2.3.2 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取的單因素實驗 在多次預試驗的基礎上，取5 g過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉加入80 mL水，95℃熱回流提取2.5 h，提取1次，提取液離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量為基礎條件，分別考察提取溫度(35℃、55℃、75℃、95℃)，液料比(8∶1、12∶1、16∶1、20∶1)，提取時間(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h )和提取次數(shù)(1次、2次、3次、4次)4個因素對蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取率的影響，選定各因素對蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取率影響較大的水平，結(jié)果見表2、表3、表4、表5。

表2 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取蟲草素的影響(n=3)

表3 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取多糖的影響(n=3)

表4 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取蛋白質(zhì)的影響(n=3)

表5 蛹蟲草菌渣綜合提取正交表L9(34)及結(jié)果

從表2、3、4可以看出：在相同條件下，熱回流提取隨提取次數(shù)的增加蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率提高，但在熱回流提取3次后蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率增加緩慢，分析其原因可能是提取3次后溶質(zhì)濃度差大大降低，物質(zhì)基本被浸出，提取率增加緩慢。由于熱回流提取次數(shù)的延長會大大增加生產(chǎn)成本，故熱回流提取的次數(shù)確定為3次為宜。

在相同條件下，熱回流提取隨時間的延長蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率在增加，但在熱回流2h后蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率增加緩慢，分析其原因可能是提取2h后溶質(zhì)濃度差大大降低，物質(zhì)基本被浸出，提取率增加緩慢。由于熱回流提取時間的延長會大大增加生產(chǎn)成本，故熱回流提取的時間控制在2 h以內(nèi)。

在相同條件下，熱回流提取隨液料比的提高蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率在增加，但在液料比16∶1后蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率增加緩慢，分析其原因可能是溶劑量的加大提高了溶液濃度差，利于物質(zhì)的傳質(zhì)，液料比16∶1后的溶出度基本上達到平衡，所以蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量不在隨液料比的增加而明顯增加，故熱回流提取的液料比確定為16∶1。

在相同條件下，熱回流提取隨溫度的增加蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率在增加，但是蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)對提取溫度要求不一樣，在熱回流溫度達75℃后蟲草素提取率開始增加緩慢，在熱回流溫度達95℃多糖提取率才達到最高，在熱回流溫度達55℃后蛋白質(zhì)提取率開始增加緩慢，分析其原因可能是蟲草素、蛋白質(zhì)易溶于溫水及熱水，多糖易溶于熱水，所以出現(xiàn)對溫度要求不一樣的現(xiàn)象，但是并沒有發(fā)生對溫度敏感的現(xiàn)象出現(xiàn)。綜合分析蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的單因素實驗，確定最佳的提取條件是：在液料比16∶1的條件下，95℃熱回流提取3次，每次提取2.0 h。

2.4 正交試驗確定蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取最佳條件

以2.3蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的單因素實驗不同的提取次數(shù)、不同的提取時間、不同的液料比和不同的提取溫度實驗結(jié)果為參考，為探討各工藝參數(shù)之間相互交叉的相互影響，用正交實驗來研究確定蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取的最佳工藝參數(shù)。從單因素實驗結(jié)果可看出熱回流提取各單因素對蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取的影響成正相關，且多糖比蟲草素、蛋白質(zhì)要求溫度要高，故以測定多糖含量來作為正交實驗的數(shù)據(jù)進行分析。

蛹蟲草菌渣綜合提取正交表L9(34)及結(jié)果見表5，蛹蟲草菌渣綜合提取直觀分析見表6，蛹蟲草菌渣綜合提取方差分析見表7。

表6 蛹蟲草菌渣綜合提取率直觀分析結(jié)果

表7 蛹蟲草菌渣提取綜合提取得率方差分析結(jié)果

按正交表L9(34)設計安排，取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取9份，每份5 g，在提取次數(shù)1、2、3，提取時間2.5 h、2.0 h、1.5 h，液料比8∶1、12∶1、16∶1，提取溫度55℃、75℃、95℃的條件下熱回流提取，提取液離心過濾，濾液定容至250 mL，測定濾液中多糖的含量。

通過正交試驗表6直觀分析、表7方差分析，影響實驗效果的因素分別是熱回流提取的提取溫度、熱回流提取液料比、熱回流提取時間和熱回流提取次數(shù)。按效益生產(chǎn)原則可確定最佳的提取條件為A3、B3、C2、D2,即用水作為提取溶劑，按液料比16∶1在95℃下熱回流提取2次，每次2.0 h。

2.5 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取驗證實驗

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取3份，每份200 g，液料比16∶1，提取溫度95℃的條件下熱回流提取2次，每次提取時間2.0 h，提取液離心過濾，濾液減壓濃縮至膏狀，在真空干燥，粉碎。分別測定樣品中蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量，見表8。

表8 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取實驗結(jié)果(n=3)

蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取驗證實驗結(jié)果表明，用水熱回流提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取率高，操作簡單，工藝穩(wěn)定。

2.6 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取分離實驗

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取3份，每份200 g，液料比16∶1，提取溫度95℃的條件下熱回流提取2次，每次提取時間2.0 h，提取液離心過濾，濾液用5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子蟲草素的濾出液和含有大分子多糖、蛋白質(zhì)的濾余液，濾出液濃縮干燥得蟲草素提取物產(chǎn)品，濾余液用蛋白酶酶解，再經(jīng)5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子多肽的濾出液和含有大分子多糖的濾余液，濾出液、濾余液分別濃縮干燥得多肽提取物產(chǎn)品和多糖提取物產(chǎn)品。分別測定提取物樣品中蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的含量，見表9。

表9 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取分離實驗結(jié)果(n=3)

蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取分離驗證實驗結(jié)果表明，用水熱回流提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)，在經(jīng)膜分離，酶解，膜分離可以獲得蟲草素提取物、多糖提取物和多肽提取物產(chǎn)品，方法提取分離率高，操作簡單，工藝穩(wěn)定。

3 討論

(1)筆者研究利用蛹蟲草菌渣，采用熱回流綜合提取方法和超聲綜合提取方法，選用水和乙醇作為提取溶劑，由于濃度35%～55%的乙醇已不利于多糖的提取，故綜合提取工藝采用水提取法；雖然超聲波提取具有加速植物中有效成分進入溶劑，增加提取率等諸多有利因素，但由于多糖提取溫度是主要影響因子，而超聲波提取由于設備限制溫度控制在65℃以下，此溫度也不利于多糖的溶出，故選用水熱回流提取法進行蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)的綜合提取分離。

(2)在單因素分析的基礎上，通過正交實驗優(yōu)化確定最佳提取工藝。實驗結(jié)果表明，影響蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)提取的因素主次順序為提取溫度>液料比>提取時間>提取次數(shù)，最佳提取條件為：提取溫度95℃，液料比16∶1，提取時間2.0 h，提取次數(shù)2。在該工藝條件下，蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率分別為91.98%、93.65%、93.35%。

(3)利用蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質(zhì)綜合提取驗證實驗獲得的最佳提取工藝進行提取，并通過膜分離技術(shù)、酶解技術(shù)有效的將蟲草素、多糖和多肽進行分離，使一次投料可以獲得蟲草素、多糖和多肽三種提取物產(chǎn)品，提取率和含量分別為1.84%、5.05%，5.74%、65.53%，4.46%、80.12%。