李秀萍，王 玲，王 馨，祁興春，董 力

紫草素是從紫草根中提取的主要生物活性成分。有研究表明，紫草素具有治療癌癥、炎癥和傷口愈合相關(guān)的多種功能[1]，但紫草素的藥理作用機制有待探究。Rho激酶(Rho kinsase， ROCK)包括ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種類型[2-3]。ROCKⅠ參與癌癥、炎癥損傷等多種疾病的致病過程[4]，該基因是否受紫草素的調(diào)控尚不清楚。本研究通過構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性損傷模型，觀察紫草素對細(xì)胞炎性因子分泌的影響，并分析其與ROCKⅠ/NF-κB信號通路之間的關(guān)系，為紫草素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 紫草素由中國食品藥品檢定研究院提供；結(jié)核分枝桿菌由中國疫病控制中心結(jié)核病實驗室提供； THP-1購自中國上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞庫；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自北京康為世紀(jì)；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購自北京索萊寶公司；兔抗ROCKⅠ抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自上海艾博抗公司。

1.2方法

1.2.1THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)液為15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，混有1%雙抗(青鏈霉素)；培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；隔天傳代1次。

1.2.2細(xì)胞處理與分組：將培養(yǎng)48 h的THP-1細(xì)胞標(biāo)記為空白組；將空白組細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌(病毒載量10)處理24 h作為模型組；將紫草素用DMSO稀釋成0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml，取等劑量藥物與模型組細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h，分別標(biāo)記為0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml組，篩選最適濃度標(biāo)記為實驗組；用等劑量的DMSO與模型組細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h標(biāo)記為對照組；si-NC、si-ROCKⅠ、pcDNA、pcDNA-ROCKⅠ分別轉(zhuǎn)染模型組細(xì)胞，標(biāo)記為si-NC組、si-ROCKⅠ組、pcDNA組、pcDNA-ROCKⅠ組；將pcDNA、pcDNA-ROCKⅠ轉(zhuǎn)染實驗組細(xì)胞，標(biāo)記為實驗+pcDNA組、實驗+pcDNA-ROCKⅠ組。

1.2.3CCK-8實驗：取待檢測的空白組、模型組、對照組、紫草素組(0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml)，用培養(yǎng)液調(diào)至每毫升1×105個細(xì)胞。取100 μl加入酶標(biāo)板，再加入CCK-8溶液，混勻，避光孵育15 min，置于酶標(biāo)儀讀數(shù)。細(xì)胞抑制率(%)=(1-A490各個處理組/A490 空白組)×100%。

1.2.4RT-qPCR實驗：將各組待檢測的細(xì)胞用Trizol液提取總RNA，用核酸檢測儀檢測RNA的完整性和質(zhì)量?？焖賹⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用RT-qPCR試劑盒檢測各個cDNA中ROCKⅠ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)的mRNA表達(dá)水平。條件為：94 ℃，30 min；58 ℃， 30 s；72 ℃， 30 s 進行循環(huán)擴增, 后延伸溫度72 ℃，12 min。共41個循環(huán)。

1.2.5蛋白免疫印跡實驗：將需要檢測的細(xì)胞用裂解液冰上裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，煮沸變性，然后用于上樣。行SDS-PAGE蛋白電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉。兔抗ROCKⅠ抗體稀釋1000倍，用于孵育封閉后的膜(4 ℃，12 h)。輕輕取出膜，用1500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃孵育2 h。顯影、曝光，以目的蛋白的表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH的比值表示蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1紫草素調(diào)控結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性因子的表達(dá) 與空白組比較，模型組細(xì)胞抑制率和TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，紫草素0.50、2.50、12.50、62.50 μg/ml組細(xì)胞抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但炎性因子TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表達(dá)量隨紫草素濃度的升高而明顯降低(P<0.01)。故選用對炎性因子變化最顯著的濃度(2.50 μg/ml)用于后續(xù)實驗。見表1。

表1 紫草素對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的抑制率和炎性因子表達(dá)的影響

2.2紫草素調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中ROCKⅠ的表達(dá) 與對照組比較，實驗組結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中ROCKⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)。見圖1和表2。

表2 紫草素對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中ROCKⅠmRNA和蛋白表達(dá)情況比較

圖1 紫草素對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中ROCKⅠ表達(dá)蛋白免疫印跡圖實驗組為用紫草素2.50 μg/ml處理的THP-1細(xì)胞，對照組為DMSO與模型組細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h,模型組為結(jié)核分枝桿菌處理的THP-1細(xì)胞；ROCKⅠ為Rho激酶Ⅰ

2.3敲減ROCKⅠ調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性因子表達(dá) 與si-NC組比較，si-ROCKⅠ組結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中ROCKⅠ、TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 敲減ROCKⅠ調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平比較

2.4過表達(dá)ROCKⅠ對紫草素調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性因子分泌的調(diào)控 與實驗+pcDNA組比較，實驗+pcDNA-ROCKⅠ組結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中ROCKⅠ、TNF-α、IL-1β、MIP-3α mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)。見表4。

表4 過表達(dá)ROCKⅠ對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎性因子分泌的調(diào)控

2.5NF-κB信號通路調(diào)節(jié)在紫草素抗炎功能中與ROCKⅠ的關(guān)系 與對照組、si-NC組比較，實驗組、si-ROCKⅠ組結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中P65、IκBα、ROCKⅠmRNA和ROCKⅠ蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。與實驗+pcDNA組比較，實驗+pcDNA-ROCKⅠ組結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞P65、IκBα、ROCKⅠmRNA和ROCKⅠ蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。見圖2和表5。

表5 NF-κB信號通路與ROCKⅠ在不同處理方式結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖2 ROCKⅠ蛋白在不同處理方式的THP-1細(xì)胞中的表達(dá)蛋白免疫印跡圖A.對照組；B.實驗組；C.si-NC組；D.si-ROCKⅠ組；E.實驗+pcDNA組；F.實驗+pcDNA-ROCKⅠ組；ROCKⅠ為Rho激酶Ⅰ；對照組為DMSO與模型組細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h，模型組為結(jié)核分枝桿菌處理的THP-1細(xì)胞

3 討論

大量研究報道，紫草素有益于人類多種疾病的治療，如心肌損傷、腦損傷、神經(jīng)損傷及癌癥等[5-6]，但是紫草素治療作用的機制尚未十分清楚。Guo等[7]研究報道，紫草素能夠在體內(nèi)外抑制乙酰氨基酚對肝臟的毒性作用，表現(xiàn)為下調(diào)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，包括蛋氨酸亞砜還原酶、血紅素加氧酶-1、超氧化物酶2和細(xì)胞色素，紫草素還可顯著抑制乙酰氨基酚誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，并抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)，紫草素可緩解心臟損傷模型小鼠的心力衰竭，其中包括抑制炎癥反應(yīng)、減少心肌纖維化、減少細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。近期有報道稱，紫草素對紫癜性腎炎大鼠血清中炎性因子的分泌具有抑制作用，并可減輕大鼠腎臟損傷程度，這與紫草素提高腎組織中裂孔隔膜蛋白的表達(dá)有關(guān)[9]。本實驗結(jié)果顯示，紫草素呈濃度依賴性降低結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、MIP-3α的分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)，紫草素還可下調(diào)ROCKⅠ表達(dá)，猜測這可能與紫草素的抗炎功能具有一定聯(lián)系。

ROCKⅠ促進炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，在多種疾病中發(fā)揮促炎作用[10]。Alokam等[11]研究報道，抑制ROCKⅠ后，甲基汞誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均下降，說明ROCKⅠ抑制劑有望治療神經(jīng)障礙疾病。Galv?o等[12]報道，ROCKⅠ抑制劑能夠抑制痛風(fēng)小鼠模型中中性粒細(xì)胞的積累，揭示了抑制ROCKⅠ具有成為治療中性粒細(xì)胞炎癥疾病的潛在靶點。但是，ROCKⅠ參與炎癥反應(yīng)的機制尚未十分清楚。本研究結(jié)果顯示，敲減ROCKⅠ明顯抑制了結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的炎性因子分泌，且過表達(dá)ROCKⅠ能夠逆轉(zhuǎn)紫草素對THP-1細(xì)胞的抗炎功能。深入研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路關(guān)鍵基因P65、IκBα 的表達(dá)能夠被紫草素、敲減ROCKⅠ下調(diào)，并且過表達(dá)ROCKⅠ還可減弱紫草素下調(diào)P65、IκBα 的作用。這些實驗結(jié)果說明，敲減ROCKⅠ具有與紫草素相類似的抑制炎性因子分泌和NF-κB信號通路活性的功能，揭示紫草素對THP-1細(xì)胞抗炎作用與抑制ROCKⅠ/NF-κB信號通路的活性有關(guān)。

綜上所述，紫草素具有抑制結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，其機制與ROCKⅠ/NF-κB信號通路的活性緊密相關(guān)，為紫草素用于臨床炎癥疾病治療提供支持?？梢?，過表達(dá)ROCKⅠ可逆轉(zhuǎn)紫草素對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞致炎因子分泌的抑制作用。