肖 揚(yáng)，魏桂枝，蔣金泉，王倩梅，尹 文，李俊杰

2型糖尿病(type 2 diabetes， T2DM)是失明、腎臟衰竭、心臟病、中風(fēng)和下肢截肢的重要原因，臨床上以高血糖、胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞代償失調(diào)為特征，其發(fā)病由遺傳和環(huán)境因素共同引起，并且與飲食和生活方式等密切相關(guān)[1]。以往的流行病學(xué)研究表明適度的攝入咖啡(咖啡因的主要飲食來源)可以降低心血管疾病和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)，甚至降低心血管疾病的全因死亡率[2]，但這一結(jié)論存在一些爭(zhēng)議，有研究報(bào)道了與之相反的結(jié)果[3]。因此糖尿病和冠心病患者的飲食指南中通常不推薦咖啡，但鑒于咖啡的神經(jīng)保護(hù)作用[4]，研究其對(duì)糖尿病的影響具有重要的價(jià)值。有研究表明腸道菌群的失調(diào)與代謝綜合征的發(fā)展存在復(fù)雜的聯(lián)系，腸道微生物組分的改變會(huì)導(dǎo)致腸道生化環(huán)境的不均衡、異常代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)、炎癥狀態(tài)、葡萄糖代謝的改變，甚至產(chǎn)生胰島素抵抗[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)小鼠存在腸道菌群失調(diào)，腸道中總細(xì)菌和某些菌株的比例有所降低，而利用藥物或飲食恢復(fù)DM鼠腸道中乳桿菌和雙歧桿菌的比例可以部分改善氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)，從而發(fā)揮一定的降糖作用[6]。Ruiz-Medina等[7]研究指出，給予高劑量咖啡因(30 mg/kg)的小鼠存在一定的生理和行為改變，而長期10 mg/(kg·d)的咖啡因可完全阻止3，4-亞甲基二氧甲基安非他明誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，而不引起任何生理或行為改變。因此本研究探討長期保守劑量咖啡因的攝入是否會(huì)改變STZ誘導(dǎo)的DM小鼠血糖及腸道菌群，旨在為飲食習(xí)慣對(duì)糖尿病和腸道微生物的影響提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 咖啡因(BioVision，美國)，葡萄糖測(cè)定試劑盒-氧化酶法(上海超研生物)，STZ(北京索萊寶)，檸檬酸緩沖液(北京索萊寶)，土壤DNA抽提試劑盒(廣州美基)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(廣州美基)，ND-2000微量分光光度計(jì)(Thermo，美國)，CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，引物合成(上海生工科技)。

1.2DM小鼠模型的建立 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠25只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購自北京華阜康，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前測(cè)定每只小鼠的血糖均在正常范圍(3.9～6.0 mmol/L)。將每只小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)并編號(hào)(1～25)，自由進(jìn)食無菌飼料和水。在(24±2)℃的恒溫環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行誘導(dǎo)造模，具體操作：小鼠禁食12 h，將STZ溶于10 mg/ml檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.5)后腹腔注射，連續(xù)注射3 d，第7天取尾靜脈血測(cè)定空腹血糖，連續(xù)2 d血糖穩(wěn)定并>11.1 mmol/L視為造模成功。

1.3DM小鼠模型血糖測(cè)定和腸道菌群測(cè)序分析

1.3.1血糖測(cè)定：造模成功小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取20只分為非咖啡因組和咖啡因組，每組10只。咖啡因組每天上午8點(diǎn)給予10 mg/kg咖啡因灌胃，非咖啡因組給予等量生理鹽水灌胃。4周后用氧化酶法測(cè)定并記錄2組小鼠空腹血糖。

1.3.2腸道菌群測(cè)序分析：按照“1.3.1”中的方法分組并喂養(yǎng)4周后取新鮮糞便樣本，具體操作方法為：?jiǎn)问肿ト〔⒐潭ㄐ∈蠹捌湮膊?，另一只手輕輕按揉小鼠下腹部，當(dāng)小鼠應(yīng)激性排便時(shí)，助手迅速用無菌鑷子夾取糞便樣本置入對(duì)應(yīng)編號(hào)的無菌凍存管中，并立即保存于-80 ℃冰箱，取小鼠糞便2～3粒，并將糞便樣本編組命名為咖啡因組和非咖啡因組。根據(jù)土壤DNA抽提試劑盒的說明方法，從小鼠糞便中提取總DNA，使用微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度和純度，利用PCR對(duì)16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)置總反應(yīng)體系為50 μl，加入1 μl的模板DNA(100 ng)，1 μl的KOD聚合酶， 5 μl的KOD Buffer和5 μl的dNTPs，加入341正向引物(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806反向引物(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)各1.5 μl，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5 ℃反應(yīng)2 min，98 ℃持續(xù)10 s，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)后62 ℃反應(yīng)30 s，68 ℃反應(yīng)30 s，最后在68 ℃下延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，定量采用QuantiFluorTM熒光計(jì)。等量混合純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物并將測(cè)序拼頭進(jìn)行連接，將構(gòu)建起來的文庫通過Hiseq2500 PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。得到原始測(cè)序結(jié)果后過濾掉低質(zhì)量的reads并去除一些不合格的reads從而獲得clean reads，通過FLASH軟件(version 1.2.11)把成對(duì)clean reads組裝為原始tags，利用QIIME軟件(version 1.9.1)將原始tags進(jìn)行過濾后得到clean tags， clean tags與參考數(shù)據(jù)庫(http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)比對(duì)分析的結(jié)果用UCHIME算法進(jìn)行嵌合體的去除，從而獲得effective tags。使用UPARSE軟件對(duì)effective tags進(jìn)行序列聚類分析，將97%以上的相似性作為一個(gè)操作分類單元(OTU)。

2 結(jié)果

2.1小鼠血糖和腸道菌群的α多樣性比較 對(duì)于α多樣性，Chao 1、ACE指數(shù)越大，提示菌群的豐度越高；Shannon指數(shù)越大，提示菌群多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，提示菌群多樣性越低。2組DM小鼠血糖、Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 2組DM小鼠血糖和腸道菌群α多樣性指數(shù)比較DM為糖尿?。籄為非咖啡因組，B為咖啡因組

2.2攝入咖啡因后DM小鼠腸道菌群β多樣性比較 基于Jaccard距離算法分別進(jìn)行了PCoA和Adnois檢驗(yàn)。在PCoA圖中各個(gè)樣本的距離越近則代表各樣本的物種組成越相似。本研究結(jié)果顯示，2組樣本出現(xiàn)了相互重疊，表明沒有明顯的聚類。見圖2。此外，根據(jù)Adnois檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果提示，2組DM小鼠腸道菌群β多樣性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 2組DM小鼠腸道菌群基于Jaccard距離算法的PCoA圖DM為糖尿??；A為非咖啡因組，B為咖啡因組

2.3不同分類學(xué)水平腸道菌群組成差異分析 本課題組分析了2組菌群在綱、目、科、屬水平上腸道菌群的群落組成差異；并選取了在每個(gè)分類水平上排前10的物種進(jìn)行表示，通過物種分布堆疊圖的形式表示了不同分類水平2組樣本的物種組成情況。見圖3。在科、屬水平上，咖啡因組乳桿菌的豐度明顯高于非咖啡因組(P<0.05)。見表1～4。

表1 2組DM小鼠腸道菌群豐度最高的前10個(gè)綱比較

表2 2組DM小鼠腸道菌群豐度最高的前10個(gè)目比較

表3 2組小鼠腸道菌群豐度最高的前10個(gè)科比較

表4 2組小鼠腸道菌群豐度最高的前10個(gè)屬比較

圖3 2組DM小鼠腸道菌群在綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度DM為糖尿?。籄為非咖啡因組，B為咖啡因組

3 討論

以往研究報(bào)道，適量飲用咖啡對(duì)慢性疾病如T2DM、Alzheimers病具有保護(hù)效應(yīng)[8-9]，一項(xiàng)包含18個(gè)隊(duì)列研究的薈萃分析表明每天一杯咖啡能降低約7%患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)[10]，但是這些研究缺乏對(duì)具體機(jī)制的探索，因此本研究擬解決兩個(gè)問題,一是咖啡因的攝入對(duì)DM小鼠的血糖發(fā)揮了怎樣的作用，是否具有保護(hù)效應(yīng)；二是探討咖啡因的連續(xù)攝入對(duì)DM小鼠腸道菌群豐度的影響。

本研究結(jié)果顯示，連續(xù)給予咖啡因28 d后咖啡因組小鼠的血糖值有輕度下降，但與非咖啡因組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示咖啡因的連續(xù)攝入對(duì)DM小鼠的血糖無明顯不利影響，甚至可以輕微的降低血糖水平；因此攝入咖啡因?qū)2DM患者安全可行，但這與流行病學(xué)研究結(jié)果存在差異，可能的原因?yàn)檠芯坎牧虾蛯?duì)象不同。咖啡中還含有其他的活性物質(zhì)如綠原酸、多酚、類黑色素和胡洛巴堿。Hang等[9]發(fā)現(xiàn)長期飲用咖啡的女性體內(nèi)有較高濃度胡洛巴堿，而這與較低的糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。

腸道微生物組在飲食攝入、藥物代謝、維持腸道屏障和胃腸道的結(jié)構(gòu)和功能及預(yù)防腸道病原體易位等方面扮演著重要角色[11]。大量證據(jù)表明，糖尿病患者的腸道環(huán)境發(fā)生了變化，其中包括緊密連接結(jié)構(gòu)受損、腸道屏障破壞、腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受損等[12]。

本課題組高通量測(cè)序結(jié)果表明，在攝入咖啡因前后，2組DM小鼠腸道菌群的α多樣性、β多樣性、Shannon和Simpson指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；攝入咖啡因前非咖啡因組的Chao1和ACE指數(shù)低于咖啡因組，這提示咖啡因并未影響DM小鼠的菌群豐度和多樣性。早期研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者腸道中的擬桿菌門和厚壁菌門比例增高，并與血糖水平呈正相關(guān)[13]，而本課題組測(cè)序結(jié)果顯示，咖啡因組DM小鼠腸道中擬桿菌的豐度水平較非咖啡因組下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于擬桿菌比例的增加會(huì)增強(qiáng)宿主腸道對(duì)單糖的攝取，促進(jìn)肝臟三酰甘油的合成，導(dǎo)致胰島素抵抗[14]，此外擬桿菌還可增強(qiáng)乳酸中琥珀酸、丙酸酯和乙酸鹽的產(chǎn)生，繼而破壞上皮細(xì)胞屏障，使病原體進(jìn)入細(xì)胞[15]，因此擬桿菌豐度的下降可能有利于減輕DM小鼠腸道的炎癥和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，但這有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，咖啡因組DM小鼠腸道中乳桿菌科、屬的豐度明顯高于非咖啡因組。一項(xiàng)橫斷面研究表明，在飲食中添加益生菌可以預(yù)防高齡和DM前期肥胖人群T2DM的發(fā)展[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出給DM小鼠喂食雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可以降低小鼠空腹和餐后血糖水平，提高葡萄糖耐量水平，這種保護(hù)效應(yīng)的原因是益生菌可以促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生和減輕胰腺炎癥[17]。乳桿菌的這種腸道菌群調(diào)節(jié)和抗炎能力同樣在DM大鼠中被證實(shí)，Cabello-Olmo等[17]指出，含有乳酸菌的發(fā)酵食品可以誘導(dǎo)DM大鼠腸道菌群的變化，改善葡萄糖代謝，避免了T2DM的有害影響。因此，咖啡因的攝入有助于DM小鼠腸道乳桿菌屬微生物的增多，這可能有助于降低DM小鼠的血糖水平。

綜上所述，咖啡因的攝入可以輕微降低DM小鼠血糖，而腸道菌群物種豐度和多樣性未發(fā)生改變，受咖啡因的影響，DM小鼠腸道中乳桿菌科、屬豐度增加，有利于改善葡萄糖腸道代謝，減輕糖尿病癥狀。本研究結(jié)果對(duì)DM患者的飲食具有指導(dǎo)作用，在未來的研究中可改變糞便的取材部位，以及通過宏基因組測(cè)序等方法，進(jìn)一步明確咖啡因發(fā)揮作用的菌種，并從其產(chǎn)物影響脂肪、糖代謝的角度繼續(xù)探究咖啡因?qū)M的作用機(jī)制。