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        海洋細(xì)菌A78的鑒定及褐藻膠裂解酶特性的研究*

        2021-11-01 03:12:32劉曉明尼秀媚劉永光馬晉芳林亞君
        生物學(xué)通報(bào) 2021年1期

        劉曉明 尼秀媚 劉永光 馬晉芳 林亞君

        (濰坊科技學(xué)院 山東壽光 262700)

        Kaiser等[1]1968年首次報(bào)道分離自梭菌(Clostridium alginolyticum)的胞外褐藻膠裂解酶,目前,科研工作者在褐藻膠裂解酶的研究領(lǐng)域取得大量成果,例如,藻酸雙脂鈉(PPS)、海立特等海洋藥物的問(wèn)世極大地鼓舞了科學(xué)工作者向海洋要寶的信心。褐藻膠作為源自褐藻植物細(xì)胞壁的水溶性酸性多糖,在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[2]。

        海藻肥料作為新一代天然海洋生物肥料,具有多種高活性成分和營(yíng)養(yǎng)元素,有明顯的增產(chǎn)效果和極強(qiáng)的抗逆作用,在環(huán)境保護(hù)、經(jīng)濟(jì)效益方面的表現(xiàn)突出[3]。目前,比較常見(jiàn)的褐藻膠降解糖化方法包括稀酸加熱法、堿降解法、氧化降解法、直接加熱法、輻射法和生物方法[4]。生物方法具有高效、預(yù)處理簡(jiǎn)單和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),是褐藻膠糖化的必 要手段[5-7]。

        微生物發(fā)酵除了能產(chǎn)生高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海藻肥外,其產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶酶解產(chǎn)物褐藻寡糖還能抗凝血、降血糖血脂[8-9]、抗腫瘤[10–11]、清除自由基[12]、促進(jìn)腸道雙歧桿菌生長(zhǎng)[13],具有較高的食用和藥用價(jià)值。因此,篩選和發(fā)現(xiàn)高效的褐藻膠降解菌,對(duì)其褐藻膠裂解酶進(jìn)行研究已逐漸成為微生物應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]。

        褐藻膠裂解酶來(lái)源廣泛,例如,海藻類(lèi)、海洋軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、海洋細(xì)菌、陸生真菌及土壤細(xì)菌等[14],微生物來(lái)源主要有假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)[15]等。

        菌株A78 篩選自腐爛的海帶,能在48 h 內(nèi)高效降解海帶塊,具有較強(qiáng)的褐藻膠降解功能和應(yīng)用潛能。對(duì)菌株A78 的鑒定及其所產(chǎn)褐藻膠裂解酶的特性進(jìn)行研究,為該類(lèi)微生物資源降解褐藻膠及褐藻生物能源轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

        菌株:從海帶中分離純化出的海洋細(xì)菌A78。

        試劑:DNS 試劑、褐藻酸鈉(化學(xué)純,國(guó)藥)、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、磷酸高鐵(分析純,國(guó)藥)、2×PCR MasterMix(杭州寶賽)。

        培養(yǎng)基:2216E 培養(yǎng)基(添加濃度為0.1 g/L磷酸高鐵)、LB 液體培養(yǎng)基(北京陸橋)。

        緩沖液:不同pH 值的緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH=4~8、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH=9~10。

        1.2 引物合成 菌株16S rDNA 序列擴(kuò)增引物選用27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ 和1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司(上海生工)合成。

        1.3 方法

        1.3.1 褐藻膠酶活性透明圈驗(yàn)證 在2216E 培養(yǎng)基中添加20 g/L 的褐藻酸鈉溶液和0.1 g/L的磷酸鐵溶液,高壓滅菌,冷卻至室溫后,將海洋細(xì)菌A78 接種至2216E 培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5~7 d。加入10%的氯化鈣,靜置30 min,觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

        1.3.2 PCR 反應(yīng)與測(cè)序 以27F 和1541R 為引物,以A78 菌株總DNA 為模板,通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到目的基因。PCR 反應(yīng)體系為40 μL,其中含1 μL 引物27F、1 μL 引物1541R、2 μL DNA 模板、20 μL 2×PCR Master Mix 及16 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃5 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃1.5 min,30 個(gè)循環(huán),72℃3 min。PCR 產(chǎn)物膠回收后送至測(cè)序公司(上海生工)進(jìn)行測(cè)序,序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

        1.3.3 褐藻膠裂解酶活性測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)采用DNS 法(比色法)測(cè)褐藻膠裂解酶的活性[12-13]。

        1.3.4 褐藻膠酶最適溫度與最適pH 值的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃共8 個(gè)溫度梯度,pH 值為4、5、6、7、8、9和10 共7 個(gè)梯度,分別使用了磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液進(jìn)行配制。

        1.3.5 不同濃度誘導(dǎo)物對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 50 mL LB 培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和等大的海帶塊,接入相同量的菌液,30℃培養(yǎng)48 h,觀察海帶降解情況并檢測(cè)褐藻膠酶活性判斷誘導(dǎo)物對(duì)菌株A78 產(chǎn)酶的影響。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 海洋細(xì)菌A78 種類(lèi)鑒定

        2.1.1 海洋細(xì)菌A78 產(chǎn)褐藻膠酶確認(rèn) 細(xì)菌A78 在2216E 培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后,菌落呈現(xiàn)圓形,乳白色,菌落較大,表面光滑,邊緣透明。添加10%的氯化鈣,菌落周?chē)墚a(chǎn)生明顯的透明圈,說(shuō)明菌株A78 菌能產(chǎn)生褐藻膠裂解酶。

        2.1.2 海洋細(xì)菌A78 的生理生化特征 對(duì)海洋細(xì)菌A78 進(jìn)行23 項(xiàng)理化指標(biāo)測(cè)定,結(jié)果如表1所示。由細(xì)菌A78 生理生化特性可知,海洋細(xì)菌A78 可將蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等作為唯一碳源,卻不能將麥芽糖、山梨醇、某些氨基酸等作為碳源,這與已報(bào)道的交替假單胞菌屬細(xì)菌的生理生化結(jié)果比較相似。

        表1 海洋細(xì)菌A78 生理生化特性

        2.1.3 海洋細(xì)菌A78 的16S rDNA 序列鑒定 利用引物27F 與1541R 擴(kuò)增菌株A78 部分16S rDNA 序列,得到1 500 bp 左右的PCR 產(chǎn)物,測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.govBlast/)對(duì)比,獲取與其相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列,比對(duì)結(jié)果顯示A78 菌株與假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的相似度達(dá)到99%以上,親緣關(guān)系最近,因此菌株A78 初步鑒定為假交替單胞菌。

        2.2 海洋細(xì)菌A78 的褐藻膠裂解酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)將海洋細(xì)菌A78 置于50 mL LB 肉湯培養(yǎng)基中,在LB 肉湯培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和海帶。從圖1可觀察到,加入1%褐藻酸鈉的LB 培養(yǎng)基中的2 塊海帶有一塊已經(jīng)完全降解,另一塊也接近降解。在添加0.5%及1.5%褐藻酸鈉的培養(yǎng)基中,海帶只進(jìn)行了初步降解,說(shuō)明1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下該菌株產(chǎn)生的褐藻膠酶數(shù)量較大,太高或太低濃度的褐藻酸鈉都不利于誘導(dǎo)菌株A78 產(chǎn)酶。

        圖1 加入不同濃度褐藻酸鈉誘導(dǎo)海帶塊降解情況

        分別在上清液與菌體分離、未分離的情況下檢測(cè)褐藻膠酶活性,結(jié)果1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下,上清液加菌體褐藻膠酶活最高。單獨(dú)上清液或菌體酶活都比較低,說(shuō)明該菌所產(chǎn)褐藻膠裂解酶在上清液中與菌體上都存在;1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)下酶活最高,說(shuō)明濃度適中的誘導(dǎo)物能明顯提高菌株A78 褐藻膠酶產(chǎn)量。未加誘導(dǎo)物與加入0.5%褐藻酸鈉、1.5%褐藻酸鈉及海帶塊的褐藻膠裂解酶酶活沒(méi)有明顯差距,說(shuō)明誘導(dǎo)物對(duì)菌株A78 產(chǎn)酶有重要影響,且濃度是關(guān)鍵因素;具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2。

        圖2 A78 菌株在不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)作用下的褐藻膠裂解酶活性

        2.3 不同溫度與pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響

        2.3.1 不同溫度對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響 溫度是影響酶活性的重要因素。本研究設(shè)置了20℃~55℃之間8 個(gè)溫度梯度,研究了菌株A78 所產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活與溫度之間的關(guān)系。通過(guò)圖3可推斷,褐藻膠裂解酶的活性在20℃~25℃之間活性接近零,但是在溫度升高至30℃的過(guò)程中,酶活快速增長(zhǎng),30℃時(shí)已達(dá)到酶活的最大值82.6 U/mL;當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40℃,酶活又逐漸降低;當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí),酶活有所回升,但依舊較低;當(dāng)溫度升高到55℃時(shí),酶活接近零。

        圖3 不同溫度對(duì)菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

        2.3.2 不同pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶活性的影響不同的pH 值對(duì)褐藻膠裂解酶的活性有著很大的影響,過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu),從而影響酶的活性[16]。設(shè)置pH 值為4~10 之間的7 個(gè)梯度,在30℃培養(yǎng)菌株A78。根據(jù)圖4可得出,當(dāng)pH 值從4 變至5 時(shí),褐藻膠裂解酶的活性明顯上升,在pH 值為5~5.5 之間活性最高,可達(dá)到70 U/mL左右。當(dāng)pH 值由5 達(dá)到7 時(shí),褐藻膠裂解酶的活性接近零。說(shuō)明菌株A78 所產(chǎn)的褐藻膠裂解酶適合偏酸的條件下發(fā)揮酶活。

        圖4 不同pH 值對(duì)菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

        2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌A78 褐藻膠裂解酶活性的影響 在1%褐藻酸鈉誘導(dǎo)的LB 液體培養(yǎng)基中,每隔4 h 檢測(cè)一次褐藻膠酶活性,通過(guò)圖5可得出,在培養(yǎng)4 h 之后,發(fā)酵液中褐藻膠裂解酶的活性大約為75 U/mL;12 h 以?xún)?nèi)酶活基本不變;但是在培養(yǎng)12 h 之后,褐藻膠酶活性急劇下降,至32 h 達(dá)到最低點(diǎn),褐藻膠裂解酶的活性接近零。32 h 后,酶活又有所升高,在培養(yǎng)52 h 之后,酶活再次降低。

        圖5 不同細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響

        出現(xiàn)該發(fā)酵過(guò)程可能的原因是,菌株A78 在發(fā)酵前期迅速合成褐藻膠裂解酶,酶的初步產(chǎn)量較高。在12 h 以后,大量分泌到上清液中的褐藻膠酶與底物充分作用,消耗巨大,因此,褐藻膠酶活力逐漸降低。在32 h 后,培養(yǎng)基中的褐藻酸鈉被逐漸消耗殆盡,褐藻膠裂解酶的消耗量降低,因此褐藻膠酶活力又有所上升。菌株A78 所產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶是誘導(dǎo)酶,在發(fā)酵過(guò)程中邊產(chǎn)生邊消耗,因此,發(fā)酵過(guò)程中酶活波動(dòng)較大。

        3 結(jié)論

        菌株A78 分離自日本海域的腐爛海帶,褐藻膠酶篩選平板結(jié)果表明菌株A78 具有褐藻膠酶活性。通過(guò)生理生化特征及16S rDNA 序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定[15,17],初步鑒定結(jié)果為假交替單胞菌。

        適當(dāng)濃度的誘導(dǎo)物能提高菌株A78 的褐藻膠酶產(chǎn)量,但褐藻膠酶活力與已報(bào)道的菌株相比沒(méi)有顯著優(yōu)勢(shì)[16],而在海帶塊降解實(shí)驗(yàn)中,本菌株能在48 h 內(nèi)將海帶塊降解,優(yōu)勢(shì)明顯。在酶活檢測(cè)過(guò)程中,上清液或菌體中均能檢測(cè)到酶活,而上清液+菌體酶活最高,該結(jié)果表明,菌株A78 所產(chǎn)的褐藻膠裂解酶在上清液和菌體表面均有分布,上清液與菌體表面的褐藻膠裂解酶可能是1 種或多種褐藻膠裂解酶,通過(guò)協(xié)同作用達(dá)到高效降解褐藻膠的效果。

        溫度實(shí)驗(yàn)中,菌株A78 褐藻膠酶活力峰有2個(gè),其中一個(gè)主峰在30℃左右,另一個(gè)酶活峰出現(xiàn)在45℃左右;pH 值實(shí)驗(yàn)中,酶活力峰有2 個(gè),其中一個(gè)主峰是在pH=5 左右,另一個(gè)小的酶活峰在pH=9 左右。出現(xiàn)這種結(jié)果可能是該菌含有1個(gè)以上褐藻膠裂解酶基因,而2 個(gè)基因表達(dá)的酶的量與特性有較大區(qū)別,但要清楚的確證,還需要進(jìn)行后續(xù)的菌株A78 褐藻膠裂解酶的分離純化,并進(jìn)行純化酶的特性研究。

        本研究初步探究出由海洋細(xì)菌A78 產(chǎn)的褐藻膠裂解酶與底物反應(yīng)的最適pH 值、溫度及細(xì)菌培養(yǎng)的最適時(shí)間,發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為30℃、pH 值為5~5.5、培養(yǎng)時(shí)間為4~12 h 時(shí)褐藻膠裂解酶的活性最高。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)A78 細(xì)菌在1%褐藻酸鈉的誘導(dǎo)下才能產(chǎn)出大量的褐藻膠裂解酶,過(guò)高或過(guò)低的誘導(dǎo)物濃度都不利于該菌產(chǎn)酶。研究結(jié)果對(duì)假交替單胞菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

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