馬雪蓮 陸月紅 嚴(yán)李萍 馬英英 陳昊 丁杰鋒 應(yīng)群華 王立昌

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是一種以雄激素過多和胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為特征，伴生殖功能障礙和糖代謝異常的一種分泌性紊亂綜合征[1]，育齡人群的患病率約為5%～10%[2]。該病以激素失衡和卵巢功能障礙為特點(diǎn)，是育齡期女性無排卵型不孕的主要原因。女性的陰道微生態(tài)系統(tǒng)是由陰道的解剖結(jié)構(gòu)、微生物菌群、局部免疫系統(tǒng)及機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能組成，而陰道是一個(gè)開放性的自然腔道，極易受外界環(huán)境和內(nèi)在因素侵?jǐn)_，當(dāng)機(jī)體免疫力下降、體內(nèi)激素波動(dòng)、陰道pH值變化時(shí)，陰道內(nèi)的菌群就會(huì)出現(xiàn)變化，構(gòu)成菌群紊亂[3]。本研究通過對(duì)比生殖科就診的育齡期PCOS患者和非內(nèi)分泌疾病患者的陰道微生態(tài)相關(guān)指標(biāo)的差異，分析PCOS患者菌群檢出情況，旨在探討PCOS患者激素紊亂對(duì)陰道微生態(tài)的影響，以期為臨床精細(xì)化治療提供幫助，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取紹興市婦幼保健院2019年1月至2021年1月收治的317例18～45歲育齡期PCOS患者作為研究組，PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[4]。選取同期生殖科就診的200例18～45歲育齡不孕女性作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象3個(gè)月內(nèi)未使用激素類藥物，并且排除PCOS外其他排卵障礙引起的內(nèi)分泌疾病以及資料不全或檢測(cè)項(xiàng)目不全的患者。分組：（1）將PCOS患者根據(jù)病情分成3組：普通PCOS組144例，IR組103例 [穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR；空腹胰島素×空腹血糖/22.5[5-6]）≥2.68為IR[7]]；高雄激素血癥（hyperandrogenemia,HA）組 70例[血清總睪酮（T）≥1.97 nmol/ml，結(jié)合游離雄激素指數(shù)（FAI；T×100/性激素結(jié)合蛋白）＞6.4[8-9]]；（2）為探討IR患者陰道微生態(tài)失調(diào)與激素的相關(guān)性，排除數(shù)據(jù)不全的患者后，分別選取IR組患者95例和普通PCOS組患者94例進(jìn)行雌二醇（E2）、孕酮（P）的分析。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 陰道分泌物采集 兩組患者入組后由專業(yè)護(hù)士進(jìn)行取樣（陰道分泌物）：PCOS組在卵泡期取樣，對(duì)照組于月經(jīng)結(jié)束3～7 d后取樣。明確取樣前3 d不性交，陰道不使用任何藥物，無陰道出血，否則更改取樣日期。標(biāo)本采集方法：取膀胱截石位，將陰道窺器以少量0.9%氯化鈉溶液潤(rùn)滑后放入陰道內(nèi)，暴露子宮頸，用2根干棉簽從陰道上1/3側(cè)壁刮取分泌物，置于試管內(nèi)。另取1根無菌棉簽于相同部位刮取分泌物留做細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3 陰道分泌物檢測(cè) （1）形態(tài)學(xué)檢測(cè)：用無菌滴管吸取浸潤(rùn)液1滴滴于載玻片上，于40倍高倍顯微鏡下觀察陰道分泌物的清潔度、假絲酵母菌、線索細(xì)胞及乳桿菌情況。將該玻片干燥、固定后行革蘭染色，于1 000倍油鏡下觀察菌群密集度、多樣性及優(yōu)勢(shì)菌情況。（2）功能學(xué)檢測(cè)：用留取陰道分泌物的另1根干棉簽，加適量稀釋液，用碩世bPR-2014A陰道炎自動(dòng)檢測(cè)儀檢測(cè)需氧菌、厭氧菌、真菌等代謝產(chǎn)物、酶的活性及pH值。（3）細(xì)菌培養(yǎng)：用取樣拭子接種相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)后用梅里埃VITEK儀鑒定確認(rèn)菌種。

1.4 性激素、FPG和胰島素檢測(cè) 抽取空腹靜脈血10 ml檢測(cè)性激素、FPG和胰島素，F(xiàn)PG采用貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；空腹胰島素采用深圳新產(chǎn)業(yè)生物科技MAGLUMI2000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)；T、E2、P采用雅培ARCHITECT全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo) 比較兩組患者陰道微生態(tài)指標(biāo)：菌群密集度、菌群多樣性、優(yōu)勢(shì)菌、pH值及炎癥情況。比較PCOS各亞組患者的陰道分泌物菌群檢出情況，分析陰道微生態(tài)是否失調(diào)。

1.5.1 正常陰道微生態(tài)標(biāo)準(zhǔn) （1）微生態(tài)正常：陰道菌群的密集度為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，多樣性為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌，陰道pH值為3.8～4.5，乳桿菌功能正常（過氧化氫酶分泌正常），白細(xì)胞＜10個(gè)/HP（高倍視野下的上皮細(xì)胞周圍），白細(xì)胞酯酶等陰性。（2）微生態(tài)失調(diào)：任何一項(xiàng)出現(xiàn)異常即診斷為陰道微生態(tài)失調(diào)。

1.5.2 陰道菌群密集度標(biāo)準(zhǔn) Ⅰ級(jí)（1+）：1～9個(gè)/油鏡；Ⅱ級(jí)（2+）：10～99個(gè)/油鏡；Ⅲ級(jí)（3+）：100 個(gè)及以上/油鏡；Ⅳ級(jí)（4+）：細(xì)菌聚集成團(tuán)或密集覆蓋黏膜上皮細(xì)胞/油鏡。

1.5.3 陰道菌群多樣性標(biāo)準(zhǔn) Ⅰ級(jí)（1+）：1～3種/油鏡；Ⅱ級(jí)（2+）：4～6 種/油鏡；Ⅲ級(jí)（3+）：7～9 種細(xì)菌/油鏡；Ⅳ級(jí)（4+）：10 種及以上/油鏡。

1.5.4 細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginitis,BV）的診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考Nugent評(píng)分[10]標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果確認(rèn)診斷，Nugent評(píng)分 0～3分為正常，4～6分為中間型 BV，≥7分為BV，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Nugent評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.5 外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis,VVC）的診斷標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡檢見到菌絲或孢子，結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果確認(rèn)診斷。

1.5.6 需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis,AV）的診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前尚無規(guī)范化、公認(rèn)的AV診斷標(biāo)準(zhǔn)。診斷主要根據(jù)臨床特征及Donders評(píng)分（陰道分泌物顯微鏡下Donders評(píng)分≥3分），結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果確認(rèn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組患者陰道微生態(tài)指標(biāo)的比較 兩組患者菌群密集度、多樣性、pH值、優(yōu)勢(shì)菌比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而研究組白細(xì)胞＞10個(gè)/HP占比、陰道微生態(tài)失調(diào)率均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），見表 2。

表2 研究組和對(duì)照組患者陰道微生態(tài)指標(biāo)的比較

2.2 PCOS各亞組與對(duì)照組患者陰道分泌物菌群檢出率的比較 普通PCOS組陰道分泌物菌群檢出率與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而在PCOS各亞組中，HA組的非特異性炎癥檢出率、IR組的BV檢出率以及這兩個(gè)亞組中混合感染檢出率、陰道微生態(tài)失調(diào)率與普通PCOS組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 PCOS各亞組與對(duì)照組患者陰道分泌物菌群檢出率的比較[例（%）]

2.3 PCOS各亞組與對(duì)照組Nugent評(píng)分比較 PCOS各亞組與對(duì)照組Nugent評(píng)分的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Nugent評(píng)分為0～3分和≥7分的IR組患者占比與普通PCOS組患者占比的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說明IR組患者陰道中擁有健康菌群（乳桿菌）的占比較普通PCOS組低，同時(shí)患BV的占比較普通PCOS組高；而HA組各分段患者占比與普通PCOS組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4。

表4 PCOS各亞組與對(duì)照組Nugent評(píng)分比較[例（%）]

2.4 IR組與普通PCOS組患者E2、P水平比較 IR組的E2水平顯著低于普通PCOS組（P＜0.05），而P水平與普通PCOS組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 IR組與普通PCOS組患者E2、P水平比較

2.5 PCOS患者各亞組陰道微生態(tài)特征 普通PCOS患者處于PCOS發(fā)病早期，激素紊亂程度較輕，菌群基本正常，陰道微生態(tài)與非內(nèi)分泌疾病患者差異不大。發(fā)生HA和IR的患者已進(jìn)入PCOS中期，HA患者常處于全身慢性炎癥狀態(tài)，非特異性炎癥患者陰道炎癥明顯，白細(xì)胞出現(xiàn)聚集，基底旁上皮細(xì)胞可見，提示炎癥導(dǎo)致陰道黏膜受損。IR患者?；糂V，患者陰道乳桿菌缺如，厭氧菌增多。PCOS中后期，IR患者Nugent評(píng)分高者多見，IR與HA患者常發(fā)生混合感染。HA混合感染患者陰道炎癥較IR患者明顯，具備HA慢性炎癥的特征。HA合并IR患者已進(jìn)展到PCOS晚期，此時(shí)激素紊亂加劇，陰道微生態(tài)可同時(shí)具備上述兩者特征，菌群失調(diào)嚴(yán)重，最終發(fā)展成難治性陰道炎。典型患者的陰道微生態(tài)見圖1-6（插頁(yè)）。

圖1 27歲普通多囊卵巢綜合征PCOS患者陰道微生態(tài)（菌群基本正常，以乳桿菌為主）

圖2 27歲高雄激素血癥（HA）患者陰道微生態(tài)（診斷為非特異性陰道炎，炎癥明顯，低倍鏡下白細(xì)胞滿視野，高倍鏡下白細(xì)胞＞10個(gè)/HP，并有部分聚集，出現(xiàn)基底旁上皮細(xì)胞，陰道內(nèi)乳桿菌減少，未發(fā)現(xiàn)明顯致病菌）

圖3 25歲胰島素抵抗（IR）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態(tài)（診斷為細(xì)菌性陰道炎，破碎的上皮細(xì)胞上聚集了大量厭氧菌，炎性白細(xì)胞較少）

圖4 28歲胰島素抵抗（IR）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態(tài) [診斷為混合感染：細(xì)菌性陰道?。˙V）+外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC），菌群失調(diào)程度較高，Nugent評(píng)分為9分]

圖5 27歲高雄激素血癥（HA）多囊卵巢綜合征患者陰道微生態(tài) [診斷為混合感染：細(xì)菌性陰道?。˙V）+外陰陰道假絲酵母菌病（VVC）+炎癥，白細(xì)胞部分聚集，陰道炎癥較IR混合感染者明顯，具備HA慢性炎癥特征]

圖6 31歲胰島素抵抗（IR）合并高雄激素血癥（HA）多囊卵巢綜合征患者的陰道微生態(tài)（診斷為細(xì)菌性陰道炎合并炎癥，陰道炎癥加重，并出現(xiàn)大量基底旁細(xì)胞）

3 討論

育齡期女性的陰道微生態(tài)環(huán)境與體內(nèi)激素平衡關(guān)系密切，而PCOS是一種生殖和代謝功能紊亂性疾病，其本質(zhì)是由激素失衡引起的，因此陰道微生態(tài)失調(diào)的情況較普通患者更易發(fā)生。本文通過對(duì)比兩組患者陰道微生態(tài)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的陰道炎癥情況明顯高于對(duì)照組，兩組患者的陰道微生態(tài)失調(diào)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過對(duì)PCOS患者各亞組菌群的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，普通PCOS組患者陰道菌群基本正常，陰道微生態(tài)失調(diào)率與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且失調(diào)的菌群與對(duì)照組比較也無差異，這可能與其尚處于PCOS早期，紊亂的激素尚未對(duì)菌群造成明顯影響有關(guān)。

發(fā)生于PCOS中期的IR組和HA組患者陰道微生態(tài)失調(diào)率明顯高于普通PCOS組，其中HA組的非特異性炎癥檢出率、IR組的BV檢出率，以及兩組的混合感染檢出率與普通PCOS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），由此筆者推斷HA和IR引起的激素紊亂可能是PCOS患者陰道慢性炎癥和BV頻發(fā)的主因。

進(jìn)入PCOS中期，性激素結(jié)合蛋白減少，游離睪酮增多，形成了HA，而HA被認(rèn)為是PCOS形成的初始原因和主要特征，由于患者體內(nèi)低黃體酮和高雄激素狀態(tài)均可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)異?；罨?，導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生多種炎性因子和自身抗體，使PCOS患者常處于全身的慢性炎癥狀態(tài)。研究顯示，與BMI匹配的正常婦女相比，大部分PCOS婦女外周血中CRP、IL-1β、IL-17、IL-18、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP1）、可溶性內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子（sE-selectin）和可溶性細(xì)胞間黏附分子（sICAM）等炎性因子水平顯著升高，致使PCOS患者機(jī)體處于慢性炎性狀態(tài)[11]。本研究結(jié)果顯示，HA組非特異性炎癥率明顯高于IR組和普通PCOS組，可能與此關(guān)系密切。

胰島素生物轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺陷發(fā)生IR，而IR是導(dǎo)致PCOS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]，據(jù)報(bào)道，60%的PCOS患者(包括肥胖和非肥胖人群)存在IR[13]。目前已知IR參與到了PCOS發(fā)生及進(jìn)展過程中，是PCOS的主要病理特征之一,也是導(dǎo)致PCOS患者代謝功能紊亂以及生殖內(nèi)分泌失調(diào)的重要原因[14-15]。因此，當(dāng)PCOS病理進(jìn)程導(dǎo)致機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)受到破壞時(shí)，陰道的局部免疫勢(shì)必會(huì)受到影響，而目前人們普遍認(rèn)為免疫因素可能在BV的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，IR組BV檢出率明顯高于普通PCOS組，可能與普通PCOS進(jìn)展到IR后，全身免疫失衡加劇，導(dǎo)致陰道免疫功能受損，進(jìn)而影響陰道微生態(tài)，引發(fā)以厭氧菌為主的菌群失調(diào)。同時(shí)，通過進(jìn)一步對(duì)比了PCOS各亞組在Nugent各評(píng)分段的占比后發(fā)現(xiàn)，IR組Nugent評(píng)分低分段（0～3分）的占比（61.17%）最少，與普通PCOS組（74.31%）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明其健康菌群偏少；而Nugent評(píng)分高分段（≥7分）的占比（27.18%）最多，與普通PCOS組（16.67%）有顯著差異，說明菌群失調(diào)程度高。這與表4中發(fā)現(xiàn)IR患者的E2明顯低于普通PCOS組的結(jié)論相吻合。研究表明，雌、孕激素在陰道微生態(tài)系統(tǒng)的變化中起著重要的作用，其中以雌激素最為主要，它對(duì)陰道菌群的構(gòu)成、陰道pH值均起決定性影響[16]。因此，IR患者雌激素的分泌可能也是受到了激素紊亂加劇的影響，導(dǎo)致其陰道正常菌群功能受損，數(shù)量下降，更易發(fā)生BV。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IR組和HA組的混合感染發(fā)生率明顯高于普通PCOS組，這可能是由于進(jìn)入PCOS中后期，患者長(zhǎng)期內(nèi)分泌紊亂難以糾正，陰道炎遷延不愈所致。

近年來大量研究顯示，PCOS患者體內(nèi)存在慢性低度炎癥，并且這種炎癥狀態(tài)與IR的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，炎性因子能夠參與胰島素信號(hào)通路干擾其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而誘導(dǎo)IR[17]。而持續(xù)的IR導(dǎo)致高胰島素水平可抑制肝臟性激素結(jié)合蛋白的產(chǎn)生，致使血清游離睪酮濃度升高，結(jié)果表現(xiàn)為明顯的HA臨床特征[18]。因此，PCOS患者HA可引起機(jī)體慢性炎癥，促進(jìn)IR，而慢性炎癥和IR又進(jìn)一步加劇PCOS的病理進(jìn)程，促進(jìn)雄激素的分泌。研究證實(shí)IR是HA發(fā)生和進(jìn)展的原因之一[19]。由此筆者推斷IR合并HA患者的激素紊亂會(huì)更劇烈，而陰道菌群受其影響失調(diào)程度或許也會(huì)更嚴(yán)重。然而由于臨床PCOS確診后治療的干預(yù)，導(dǎo)致進(jìn)展到此階段的初診患者較少，故本研究未能作進(jìn)一步分析。但從部分患者的陰道微生態(tài)圖中發(fā)現(xiàn)，IR合并HA患者生殖環(huán)境惡劣，其進(jìn)一步加劇的炎癥和菌群失調(diào)可能就是由其嚴(yán)重的激素紊亂所致，因此這類患者的陰道微生態(tài)更應(yīng)引起重視。

趙琦等[20]研究認(rèn)為PCOS是由于血中黃體生成素，雄激素等水平異常，導(dǎo)致無排卵，由于無排卵，體內(nèi)持續(xù)性低水平雌激素狀態(tài)，黏膜增厚，糖原分泌增加，酸度增加，有利于念珠菌生長(zhǎng)繁殖，或由于陰道不規(guī)則出血破壞陰道菌群平衡，導(dǎo)致VVC發(fā)病常見，這與本文分析結(jié)果不一致。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者的VVC的發(fā)病率并未顯著升高，這在對(duì)HA和IR分組患者菌群的進(jìn)一步分析中也得到了證實(shí)。研究結(jié)論不同可能是他們忽略了PCOS患者雄激素過多這一顯著的內(nèi)分泌特征。雄激素過多會(huì)拮抗雌激素，而PCOS患者的雌激素一直是維持在低水平狀態(tài)，無法像正常育齡期婦女那樣每月保持高水平周期性；同時(shí)PCOS患者低P的狀態(tài)使細(xì)菌清除率降低，增加了混合感染的概率。而PCOS患者全身炎癥情況對(duì)免疫功能的影響是造成陰道微生態(tài)失衡、菌群失調(diào)的直接原因。因此，如能進(jìn)一步增加研究例數(shù)，或許會(huì)得出更科學(xué)的結(jié)論。

綜上所述，PCOS患者因激素異常導(dǎo)致全身慢性炎癥，免疫功能紊亂，因此其陰道微生態(tài)受其影響更易發(fā)生失衡。尤其是IR和HA患者，由于激素紊亂加劇，所形成的不良生殖環(huán)境影響了該類患者受孕，更會(huì)導(dǎo)致輔助生殖技術(shù)難以順利開展。因此，不斷改善此類重點(diǎn)患者激素紊亂的狀況，并持續(xù)對(duì)其進(jìn)行陰道微生態(tài)監(jiān)測(cè)，才能實(shí)現(xiàn)精細(xì)化治療，為助孕創(chuàng)建良好的生殖環(huán)境，從而減少不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。