袁維，龔志強，王炳予，楊磊，袁星星

基于糞便和肝臟膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)分析芪參湯對肝纖維化小鼠的影響

袁維1，2，龔志強3，王炳予4，楊磊4，袁星星4

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222；4.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001

檢測肝纖維化小鼠糞便和肝組織各膽汁酸含量變化，分析芪參湯抗小鼠肝纖維化潛在機制和靶點。30只C57BL/6JNifdc小鼠隨機分為空白組、模型組和芪參湯組，每組10只。采用蛋氨酸-膽堿缺乏飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，造模期間芪參湯組灌胃芪參湯藥液（18.8 g/kg），給藥體積1 mL，空白組和模型組予等體積蒸餾水，連續(xù)8周。HE染色、油紅O染色和天狼猩紅染色觀察肝組織病理變化；全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平；ELISA檢測血清白細(xì)胞介素（IL）-10、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和CXC趨化因子配體12（CXCL12）含量；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測小鼠糞便和肝組織22種膽汁酸含量變化。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)顯著降低；肝細(xì)胞水腫、脂肪變性明顯，纖維結(jié)締組織增生；血清AST、ALT水平顯著升高，IL-10含量減少，TGF-β1、CXCL12和IL-6含量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；糞便膽酸（CA）、?；悄懰幔═CA）、鵝去氧膽酸（CDCA）、β-鼠膽酸（β-MCA）、?；铅?鼠膽酸（Tβ-MCA）、牛磺豬膽酸（THCA）含量顯著增加，豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、?；秦i去氧膽酸（THDCA）、ω-鼠膽酸（ω-MCA）和?；铅?鼠膽酸（Tω-MCA）含量明顯減少，肝組織TCA和β-MCA含量顯著增加，HDCA、石膽酸、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。與模型組比較，芪參湯組小鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)顯著升高，肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤和肝纖維化程度有所改善；血清AST、ALT水平降低，IL-10含量增加，TGF-β1、CXCL12和IL-6含量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；糞便TCA、CDCA、β-MCA、Tβ-MCA、α-鼠膽酸含量顯著減少，HDCA、THDCA、熊去氧膽酸、?；切苋パ跄懰幔═UDCA）、ω-MCA、Tω-MCA和去氫膽酸（DHCA）含量顯著增加，肝組織TCA、β-MCA和Tβ-MCA含量顯著減少，TUDCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。芪參湯可能通過調(diào)節(jié)糞便和肝組織膽汁酸代謝，改善小鼠肝纖維化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

芪參湯；肝纖維化；膽汁酸；代謝；小鼠

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化及肝癌等終末期肝病的共同病理階段，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的異常分布與彌漫性沉積[1]。相較于肝硬化，肝纖維化在組織學(xué)上具有可逆性，因此對于肝纖維化的早期干預(yù)極其重要。芪參湯是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院脾胃病科張雅麗教授治療肝纖維化的經(jīng)驗方。前期研究發(fā)現(xiàn)，芪參湯通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用[2]。同時，芪參湯能增加肝纖維化大鼠腸道菌群多樣性和益生菌豐度[3]。然而腸道菌群調(diào)節(jié)肝纖維化的具體作用機制仍需進(jìn)一步研究。近年來研究表明，膽汁酸代謝參與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[4-6]。腸道菌群作為膽汁酸在腸道內(nèi)代謝的重要媒介，能通過解偶聯(lián)和7α-脫羥作用調(diào)控膽汁酸代謝，進(jìn)而參與肝臟脂肪變性、小葉炎癥及肝纖維化水平[7-8]。因此，本研究通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測肝纖維化小鼠肝組織和糞便膽汁酸含量的變化，以明確芪參湯抗小鼠肝纖維化的機制和靶點。

1 材料與方法

1.1 動物和飼料

SPF級雄性C57BL/6JNifdc小鼠30只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗中心，動物使用許可證號SYXK（黑）2016-008，溫度22～25 ℃，相對濕度45%～60%，光照時間12 h，自由攝食飲水。蛋氨酸-膽堿缺乏飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司，普通飼料購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗操作遵循《實驗動物管理與使用指南》規(guī)定[9]。

1.2 藥物及制備

芪參湯（黃芪15 g，西洋參10 g，丹參10 g，山楂10 g，荷葉10 g，澤瀉10 g，女貞子8 g，三七5 g，墨旱蓮8 g，絞股藍(lán)5 g，甘草3 g），飲片由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供，經(jīng)煎煮、過濾、濃縮后，制成含原藥材1 g/mL藥液備用。

1.3 主要試劑與儀器

HE染液（貨號D006-1-1），南京建成生物工程研究所；天狼猩紅染液（貨號G1470），上海索寶生物科技有限公司；油紅O染色試劑盒（貨號WLA055），沈陽萬類生物科技公司；小鼠白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和CXC趨化因子配體12（CXCL12）ELISA試劑盒（貨號分別為MM-0163M1、MM-0176M1、MM-0135M2和MM-44730M2），江蘇酶免實業(yè)有限公司；膽酸（CA，貨號C1129）、牛磺膽酸（TCA，貨號T4009）、鵝去氧膽酸（CDCA，貨號C9377）、牛磺鵝去氧膽酸（TCDCA，貨號T6260）、β-鼠膽酸（β-MCA，貨號SML2372）、豬去氧膽酸（HDCA，貨號H3878）、?；秦i去氧膽酸（THDCA，貨號T0682）、脫氧膽酸（DCA，貨號D2510）、?；敲撗跄懰幔═DCA，貨號T0875）、熊去氧膽酸（UDCA，貨號U5127）、?；切苋パ跄懰幔═UDCA，貨號T0266）、石膽酸（LCA，貨號L6250）、?；鞘懰幔═LCA，貨號T7515）、去氫膽酸（DHCA，貨號30830）對照品和內(nèi)標(biāo)脫氧膽酸-2,2,4,4-d4（d4-DCA，貨號614130），美國Sigma-Aldrich公司；?；铅?鼠膽酸（Tβ-MCA，貨號700244P）、α-鼠膽酸（α-MCA，貨號700232P）、?；铅?鼠膽酸（Tα-MCA，貨號700243P）、牛磺ω-鼠膽酸（Tω-MCA，貨號700245P）和鼠脫氧膽酸（MDCA，貨號700270P）對照品，美國Avanti公司；豬膽酸（HCA，貨號GC40717）、ω-鼠膽酸（ω-MCA，貨號GC40720）和?；秦i膽酸（THCA，貨號GC45574）對照品，美國GlpBio公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，美國Fisher公司。CX33光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；Cobas8000全自動生化儀，德國Roche公司，4500QTRAP三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB SCIEX公司。

1.4 分組、造模和給藥

30只C57BL/6JNifdc小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組和芪參湯組，每組10只。參照文獻(xiàn)[10]方法，采用蛋氨酸-膽堿缺乏飼料喂養(yǎng)制備肝纖維化小鼠模型，空白組給予膽堿和蛋氨酸充足的普通飼料喂養(yǎng)。造模期間芪參湯組小鼠給予芪參湯藥液（18.8 g/kg，參照人與動物等效劑量換算）灌胃，給藥體積1 mL，空白組和模型組予1 mL蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。

1.5 標(biāo)本采集

于末次治療后，收集小鼠糞便樣品，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，各組小鼠禁食過夜，以2%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，用于相關(guān)指標(biāo)檢測。分離小鼠肝組織并稱重，計算肝指數(shù)（肝濕重÷體質(zhì)量×100%），部分肝組織置于10%中性甲醛中固定，用于組織病理觀察，其余肝組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 肝組織病理觀察

取部分肝組織置于10%中性甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE和天狼猩紅染色后中性樹膠封片。此外，取部分肝組織以O(shè)CT包埋后冰凍切片，10%中性甲醛固定，油紅O染色液染色15 min，蘇木素復(fù)染后甘油封片。將病理切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)改變，根據(jù)NAFLD活動度積分（NAFLD activity score，NAS）量表對肝組織病理程度進(jìn)行評分，并計算陽性染色面積。

1.7 肝功能檢測

腹主動脈取血，13 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用羅氏Cobas8000全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平。

1.8 細(xì)胞因子檢測

腹主動脈取血，13 000 r/min離心10 min，收集上清液，酶標(biāo)儀檢測小鼠血清IL-10、IL-6、TGF-β1和CXCL12含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.9 膽汁酸含量測定

1.9.1 混合對照品溶液制備

精密稱取各膽汁酸對照品，分別配制成濃度為5 mmol/L的母液；另取內(nèi)標(biāo)d4-DCA對照品，加甲醇溶解定容，配制成濃度為5 mmol/L的內(nèi)標(biāo)溶液貯備液。分別吸取50 μL各濃度膽汁酸對照品母液和50 μL內(nèi)標(biāo)貯備液，置于1 000 mL容量瓶，以甲醇稀釋并定容，制得各對照品濃度為250 nmol/L混合對照品＋內(nèi)標(biāo)溶液。

1.9.2 供試品溶液制備

分別稱取100 mg糞便和肝組織樣品，室溫解凍，置于離心管中，加入500 μL預(yù)冷的乙腈-甲醇混合溶液（1∶1）研磨、離心，取300 μL上清液，氮吹儀吹干，以100 μL流動相乙腈-甲醇（1∶1）復(fù)溶，渦旋振蕩、離心，取上清液待測。

1.9.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Agilent EclipsePlus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨水溶液（A）-0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，55%B；2～40 min，55%～90%B；40～45 min，90%B）；流速0.15 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式；離子源溫度300 ℃，錐孔氣流12 L/min，噴霧電壓3 500 V。以各膽汁酸和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以膽汁酸濃度為橫坐標(biāo)，擬合回歸方程。將糞便和肝組織樣品中待測膽汁酸和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入相應(yīng)回歸方程，計算樣品中待測膽汁酸濃度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芪參湯對模型小鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見圖1。

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

2.2 芪參湯對模型小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

HE染色顯示，空白組小鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤，無纖維化；模型組小鼠肝細(xì)胞水腫，并呈空泡狀脂肪變性，匯管區(qū)可見炎性改變，纖維結(jié)締組織增生，NAS評分明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；芪參湯組小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤和肝纖維化程度均明顯改善，NAS評分較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。油紅O染色顯示，空白組小鼠肝組織可見極少量油紅O陽性染色；模型組可見大量油紅O脂滴，陽性染色面積明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠肝組織脂滴減少，陽性染色面積顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。天狼猩紅染色顯示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織膠原染色面積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠肝組織膠原染色面積顯著減少。結(jié)果見圖2。

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

2.3 芪參湯對模型小鼠肝功能的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清AST、ALT水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠血清AST、ALT水平明顯降低（＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.4 芪參湯對模型小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清IL-10含量顯著減少，TGF-β1、CXCL12和IL-6含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠血清IL-10含量增加，TGF-β1、CXCL12和IL-6含量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表1 各組小鼠血清AST、ALT水平比較（±s，U/L）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

表2 各組小鼠血清IL-10、IL-6、TGF-β1、CXCL12含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

2.5 芪參湯對模型小鼠糞便和肝組織膽汁酸含量的影響

糞便和肝組織22種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)色譜圖見圖3。

與空白組比較，模型組小鼠糞便TCDCA、α-MCA、Tα-MCA、DCA、TDCA、UDCA、TUDCA、LCA、TLCA、MDCA和DHCA含量無明顯變化（＞0.05）；CA、TCA、CDCA、β-MCA、Tβ-MCA、THCA含量顯著增加，HCA、HDCA、THDCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠糞便CA、TCDCA、Tα-MCA、HCA、THCA、DCA、TDCA、LCA、TLCA和MDCA含量無明顯變化（＞0.05）；TCA、CDCA、β-MCA、Tβ-MCA、α-MCA含量顯著減少，HDCA、THDCA、UDCA、TUDCA、ω-MCA、Tω-MCA和DHCA含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見圖4。

與空白組比較，模型組小鼠肝組織CA、CDCA、TCDCA、Tβ-MCA、α-MCA、Tα-MCA、HCA、THCA、THDCA、DCA、TDCA、UDCA、TUDCA、TLCA、MDCA和DHCA含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；TCA和β-MCA含量顯著增加，HDCA、LCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組小鼠肝組織CA、CDCA、TCDCA、α-MCA、Tα-MCA、HCA、THCA、HDCA、THDCA、DCA、TDCA、UDCA、LCA、TLCA、MDCA和DHCA含量無明顯變化（＞0.05）；TCA、β-MCA和Tβ-MCA含量顯著減少，TUDCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖5。

注：A.空白基質(zhì)＋內(nèi)標(biāo)；B.空白基質(zhì)＋22種膽汁酸對照品＋內(nèi)標(biāo)；C～D.糞便中22種膽汁酸＋內(nèi)標(biāo)；E～F.肝組織中22種膽汁酸＋內(nèi)標(biāo)；1. MDCA；2. DHCA；3. Tβ-MCA；4. THCA；5. TUDCA；6. THDCA；7. TCDCA；8. TDCA；9. HDCA；10. d4-DCA；11. TCA；12. Tα-MCA；13. Tω-MCA；14. ω-MCA；15. α-MCA；16. β-MCA；17. CA；18. CDCA；19. UDCA；20. HCA；21. TLCA；22. DCA；23. LCA

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主新陳代謝和免疫過程中發(fā)揮著重要作用，膽汁酸是體內(nèi)常見的代謝產(chǎn)物，肝臟中的膽固醇在至少17種催化酶的作用下通過經(jīng)典途徑和替代途徑產(chǎn)生游離型膽汁酸（如CA、CDCA），然后通過與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸，最終排至十二指腸，腸道內(nèi)的膽汁酸在回腸末端被重吸收，并通過腸系膜上靜脈和門靜脈回到肝臟中，與新合成的膽汁酸再次經(jīng)歷排泄與重吸收的過程，此過程即肝腸循環(huán)在此過程中，腸道菌群通過一系列酶促反應(yīng)將初級膽汁酸（如CA、CDCA）代謝為次級膽汁酸（如DCA、LCA），進(jìn)而減少疏水性膽汁酸對肝臟的毒性作用。

膽汁酸主要通過腸道和肝臟中的法尼醇X受體調(diào)控機體的代謝。有研究表明，腸道微生物-膽汁酸途徑可通過調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子16的表達(dá)，進(jìn)而控制肝癌的發(fā)生與發(fā)展[11]。此外，膽汁酸還參與非酒精性脂肪性肝病及肝纖維化的發(fā)病過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芪參湯通過激活肝臟和回腸組織中法尼醇X受體的表達(dá)，進(jìn)而改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠糖脂代謝異常和肝損傷。因此，有必要進(jìn)一步明確芪參湯對膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用。非酒精性脂肪性肝炎患者膽汁酸代謝存在異常，主要表現(xiàn)為總初級膽汁酸增多和次級膽汁酸減少[12]。本研究通過蛋氨酸-膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，結(jié)果表明，模型組小鼠糞便CA、TCA、CDCA、β-MCA、Tβ-MCA、α-MCA、THCA含量顯著增加，HCA、HDCA、THDCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著降低；肝組織TCA和β-MCA含量顯著增加，HDCA、LCA、ω-MCA和Tω-MCA含量顯著降低。芪參湯能顯著減少糞便TCA、CDCA、β-MCA、Tβ-MCA、α-MCA及肝組織TCA、β-MCA和Tβ-MCA含量，增加糞便HDCA、THDCA、UDCA、TUDCA、ω-MCA、Tω-MCA、DHCA和肝組織TUDCA、ω-MCA和Tω-MCA含量。這些差異膽汁酸可能是芪參湯抗肝纖維化的潛在靶點。

蛋氨酸-膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)是目前常用的肝纖維化造模方法，與化學(xué)性肝纖維化模型相比更符合非酒精性脂肪性肝病代謝異常的特點。與單純高脂飼料誘導(dǎo)相比，此模型喂養(yǎng)時間短、炎癥及纖維化程度相對更重，并伴有氧化應(yīng)激特征[13]。本研究結(jié)果顯示，芪參湯能顯著提高肝纖維化小鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝指數(shù)，改善肝臟炎癥和纖維化水平。IL-10是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，其可通過下調(diào)TGF-β1和腫瘤壞死因子-α等炎癥因子表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞激活，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，達(dá)到拮抗肝纖維化的作用。此外，IL-10可以影響樹突狀細(xì)胞的成熟及間接抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，發(fā)揮免疫抑制作用，改善小鼠肝纖維化水平[14]。IL-6和TGF-β1是重要的炎性因子，其中TGF-β1是肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。課題組前期研究表明，芪參湯主要活性成分黃芪總苷可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路激活進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞激活，發(fā)揮抗肝纖維化作用[15]。CXCL12可由多種細(xì)胞分泌，屬于趨化因子CXC亞組的一員，又稱間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1。研究表明，肝纖維化發(fā)生時CXCL12水平顯著升高，CXCL12及其特異性受體CXCR4表達(dá)升高能促進(jìn)肝組織炎性細(xì)胞遷移，加重肝損傷和纖維化水平[16-17]。本研究結(jié)果顯示，芪參湯能顯著增加肝纖維化小鼠血清IL-10含量，減少IL-6、TGF-β1和CXCL12含量。

綜上，芪參湯能顯著改善蛋氨酸-膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，其作用機制可能與調(diào)節(jié)糞便和肝組織膽汁酸代謝有關(guān)。

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Effects ofDecoction on Mice with Liver Fibrosis Through Fecal andLiver Bile Acid Metabolic Network

YUAN Wei1,2, GONG Zhiqiang3, WANG Bingyu4, YANG Lei4, YUAN Xingxing4

To analyze the potential mechanism and targets ofDecoction for liver fibrosis by detecting the changes of bile acids in feces and liver tissues of mice.Totally thirty C57BL/6JNifdc mice were randomly divided into the control group, model group andDecoction group, with 10 mice in each group. Methionine choline deficient diet was used to establish liver fibrosis model in mice. During the modeling period,Decoction group was givenDecoction (18.8 g/kg) for gavage, 1 mL, and the remaining two groups were given equal volume of distilled water for gavage for 8 weeks. HE, oil red O and Sirius red staining were used to detect the pathological changes of liver tissue; automatic biochemical analyzer was used to detect serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels; ELISA was used to detect serum interleukin (IL)-10, IL-6, transforming growth factor-β1(TGF-β1) and CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) levels; HPLC-MS/MS was used to detect the changes of 22 bile acids in liver and feces.Compared with the control group, the body mass, wet liver weight and liver index of mice in model group were significantly reduced, liver cell edema, steatosis, fibrous connective tissue hyperplasia, serum AST and ALT levels significantly increased, IL-10 content decreased, contents of TGF-β1, CXCL12 and IL-6 increased, with statistical significance (<0.01). The contents of fecal cholic acid (CA), taurocholic acid (TCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), β-murocholic acid (β-MCA), tauro β-murocholic acid (Tβ-MCA), and taurohygrocholic acid (THCA) increased significantly; the contents of hyotcholic acid (HCA), hyodeoxycholic acid (HDCA), taurohyodeoxycholic acid (THDCA), ω-murocholic acid (ω-MCA) and tauro ω-murocholic acid (Tω-MCA) were significantly reduced; the contents of TCA and β-MCA in liver tissue significantly increased, and the contents of HDCA, lithocholic acid, ω-MCA and Tω-MCA were significantly reduced, with statistical significance (<0.05,<0.01). Compared with the model group, mice in theDecoction group increased significantly in body mass, liver wet weight, liver index; the liver tissue morphology, liver cell steatosis, inflammatory cell infiltration and liver fibrosis were improved; serum AST and ALT levels decreased, IL-10 content increased, contents of TGF-β1, CXCL12 and IL-6 decreased, with statistical significance (<0.01). The contents of fecal TCA, CDCA, β-MCA, Tβ-MCA, α-murocholic acid were significantly reduced, and the contents of HDCA, THDCA, ursodeoxycholic acid, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), ω-MCA, Tω-MCA and dehydrocholic acid (DHCA) increased significantly; the contents of TCA, β-MCA and Tβ-MCA in liver tissue were significantly reduced, and the contents of TUDCA, ω-MCA and Tω-MCA significantly increased, with statistical significance (<0.05,<0.01).Decoction may regulate the metabolism of bile acids in feces and liver tissues, improve the level of liver fibrosis in mice, regulate the expression of cytokines, and exert anti-liver fibrosis effects.

Decoction; liver fibrosis; bile acids; metabolism; mice

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0086-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202101114

國家自然科學(xué)基金青年基金（81904182）；湖南省衛(wèi)生計生委科研計劃項目（20200752）；湖南省自然科學(xué)基金（2020JJ5441）；黑龍江省中醫(yī)藥科研項目（ZHY18-029、ZHY19-061、ZHY19-062、ZHY2020-041）；黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項目（LH2019H095）

袁星星，E-mail：jackieaqi@163.com

（收稿日期：2021-01-23）

（修回日期：2021-02-08；編輯：鄭宏）