梁靜，趙紅丹，高福蓮，李晉雪

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院1皮膚科，2腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453000

3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

皮膚基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC） 好發(fā)于人體頭面部，是最常見的惡性腫瘤之一。中國BCC發(fā)病率較低，每年約1.1/10萬，受人們生活習(xí)慣的影響，近年來BCC的發(fā)病率逐漸上升。早期BCC可表現(xiàn)為隆起、丘疹、結(jié)節(jié)或斑塊，影響美觀，雖然遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較低，但會(huì)對(duì)患者造成一定困擾，部分晚期BCC患者易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，但目前BCC的發(fā)病機(jī)制尚不明確。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的自主死亡方式，逃避凋亡是腫瘤形成的重要原因之一。caspase 8可對(duì)機(jī)體細(xì)胞多個(gè)生物學(xué)活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中最主要的功能就是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。既往研究表明，caspase 8不僅可對(duì)細(xì)胞程序性凋亡及壞死性凋亡過程進(jìn)行調(diào)控，還可以通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移等過程，在抑制腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。DOC-2/DAB2結(jié)合蛋白（DOC-2/DAB2 interacting protein，DAB2IP）是大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）-鳥苷三磷酸酶激活蛋白家族成員之一。DAB2IP最顯著的特征在于其特有的RASGAP同源結(jié)構(gòu)域可以特異性調(diào)節(jié)RAS介導(dǎo)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；同時(shí)，DAB2IP的C2結(jié)構(gòu)域也可以通過與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）結(jié)合，從而發(fā)揮促凋亡作用，因此，DAB2IP又被稱為ASK1結(jié)合蛋白（ASK1-interacting protein 1，AIP1）。有研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤組織中，表觀遺傳學(xué)調(diào)控抑制了DAB2IP的表達(dá)，膀胱癌中啟動(dòng)子甲基化和組蛋白修飾會(huì)抑制DAB2IP的表達(dá)，表明

DAB2IP

可能作為抑癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。本研究探討DAB2IP、caspase 8在BCC中的表達(dá)情況及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2019年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院收治的BCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為BCC；②無其他任何皮膚疾??；③無其他系統(tǒng)性疾病或惡性腫瘤；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受系統(tǒng)治療；②皮膚科和病理科醫(yī)師在復(fù)核診斷過程中未達(dá)成一致意見的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例BCC患者，其中男36例，女44例；年齡26～79歲，平均（59.3±11.5）歲。同期選取30例接受整形外科手術(shù)的健康者，其中男13例，女17例；年齡31～69歲，平均（55.2±12.1）歲。取80例BCC患者手術(shù)切除的BCC組織，取30例健康者的正常皮膚組織，皮膚組織均取自頭面部。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人BCC細(xì)胞系TE-354.T購自北京中源合聚生物科技有限公司。

DAB2IP

抑制物（si-DAB2IP）、陰性對(duì)照（si-NC）均購自上海吉瑪生物有限公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自購自美國Thermo Fisher Scientific公司，組織RNA提取Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熒光定量試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司，兔抗人DAB2IP、caspase 8抗體均購自美國Abcam公司。所有目的基因引物均由廣州銳博生物科技有限公司合成。1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）檢 測(cè)

DAB 2IP

mRNA的相對(duì)表達(dá)量 取BCC組織和正常皮膚組織充分研磨后，按照Trizol試劑盒說明書提取組織中的總RNA，轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。按照RT-PCR試劑盒說明書將所需試劑依次加入實(shí)時(shí)熒光定量PCR中進(jìn)行擴(kuò)增。

DAB2IP

mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算。

DAB2IP

上游引物：5'-CTGAGCGGGATAAGTGGATGG-3'，下游引物：5'-AAACATTGTCCGTCTTGAGCTT-3'；

GAPDH

上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物 ：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000操作說明，分別將si-DAB2IP、si-NC通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至BCC細(xì)胞系TE-354.T，分別作為si-DAB2IP組和si-NC組，置于37℃條件下培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）法檢測(cè)DAB 2IP、caspase8蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取適量BCC組織、正常皮膚組織、si-DAB2IP組細(xì)胞、si-NC組細(xì)胞，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）組織裂解液，充分研磨后，離心提取上清液中的蛋白。取適量提取的蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDSPAGE）進(jìn)行分離，用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，加入 DAB2IP、caspase 8一抗（稀釋濃度為1∶1000）孵育2 h，5%的牛奶固定，4℃環(huán)境下孵育過夜，次日37℃搖床復(fù)溫1 h，加入二抗繼續(xù)孵育1 h。洗膜后電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算DAB2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

BCC組織中

DAB2IP

mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.56±0.24），明顯低于正常皮膚組織中的（2.31±1.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=13.278，

P

＜0.01）。

2.2 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP、caspase8蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

BCC組織中DAB2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常皮膚組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 BCC組織和正常皮膚組織中DAB 2IP、caspase 8蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（x-± s）

2.3 抑制DAB 2IP基因的表達(dá)對(duì)BCC細(xì)胞DAB 2IP、caspase8蛋白表達(dá)的影響

抑制

DAB2IP

基因的表達(dá)后，si-DAB2IP組細(xì)胞中DAB2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 si-DAB 2IP組和si-NC組BCC細(xì)胞DAB 2IP、caspase 8蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.4 不同臨床特征BCC患者BCC組織中caspase8、DAB 2IP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

不同性別、年齡BCC患者BCC組織中caspase 8、DAB2IP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中DAB2IP蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=5.856、2.150，

P

＜0.05）；腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中caspase 8蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=3.121、2.250，

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征BCC患者BCC組織中DAB 2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量（ n=80）

2.5 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，BCC組織中caspase 8的表達(dá)與DAB2IP的表達(dá)呈正相關(guān)（

r

=0.72，

P

＜0.05）。

3 討論

基底細(xì)胞癌對(duì)人體頭面部組織破壞性較強(qiáng)，過度的日光照射是BCC發(fā)生的最主要原因。歐美白色人種是BCC的高風(fēng)險(xiǎn)人群，有研究表明，歐美白色人種患BCC的風(fēng)險(xiǎn)超過30%。目前，BCC的治療方案仍以手術(shù)和放療為主，尚無特異性的治療方案。

DAB2IP

位于人類染色體9q33.1～q33.3，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼967個(gè)氨基酸，長度96 kb左右，分子量110 kD。2002年，DAB2IP首次在膀胱癌細(xì)胞中被確定為一種DOC-2/DAB2結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤干細(xì)胞形態(tài)、放化療耐受性的作用，還能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。隨后，DAB2IP在腫瘤中的功能被廣泛研究。Calvisi等的研究發(fā)現(xiàn)，抑制肝癌細(xì)胞中DAB2IP的表達(dá)可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。Yang等的研究發(fā)現(xiàn)，

DAB2IP

基因突變會(huì)顯著增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。2017年，Sears和Gray的研究發(fā)現(xiàn)，抑制DAB2IP的活性會(huì)明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Sun等的研究表明，DAB2IP可以通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/ERK2信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。但目前很少有學(xué)者探討DAB2IP在BCC中的作用，袁紹萍等在研究BCC組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，DAB2IP在BCC患者BCC組織中表達(dá)下調(diào)，提示

DAB2IP

可能在BCC中發(fā)揮抑癌基因的作用。但目前關(guān)于DAB2IP抑制BCC進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)BCC組織和正常組織中

DAB2IP

mRNA的相對(duì)表達(dá)量，Western blot法檢測(cè)DAB2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCC組織中

DAB2IP

mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常皮膚組織，DAB2IP、caspase 8蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常皮膚組織，提示DAB2IP、caspase 8可能具有抑制BCC的作用。caspase 8是一種經(jīng)典的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。caspase 8作為細(xì)胞內(nèi)特殊的環(huán)境感受器，在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可通過激活細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡。Yan等的研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)caspase 8蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長。Yang等的研究證實(shí)，miRNA-376a可以通過靶向caspase 8促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲。由此可見，caspase 8可能具有廣泛的抗腫瘤作用。Kong等的研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP可以通過促進(jìn)caspase 8的表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。本研究通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制BCC細(xì)胞中

DAB2IP

基因的表達(dá)，通過Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中caspase 8的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，caspase 8的表達(dá)同樣被抑制，表明DAB2IP可能通過調(diào)控caspase 8的表達(dá)抑制BCC細(xì)胞的生長。

此外，本研究還分析了DAB2IP、caspase 8表達(dá)與BCC患者臨床特征間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑≥1 cm、病理類型為淺表型BCC患者BCC組織中DAB2IP、caspase 8蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于腫瘤直徑＜1 cm、病理類型為浸潤型患者，提示DAB2IP、caspase 8可能參與調(diào)控了BCC細(xì)胞的生長和侵襲過程。

綜上所述，DAB2IP、caspase 8在BCC組織中低表達(dá)，DAB2IP可能通過促進(jìn)caspase 8的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用，靶向DAB2IP有望成為BCC新的治療方案。