溫水秀　邱秦天　宋月鵬　黃柯菁　金珊　解家松　趙青松　徐永健

摘要 2019年6月，浙江某養(yǎng)殖場發(fā)生大海馬（Hippocampus kuda）批量死亡現(xiàn)象，為探明大海馬的發(fā)病原因，對患病大海馬進行了細菌分離，并獲得了2株細菌，編號為HM190601和HM190606。經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化特性測定及分子鑒定，確定菌株HM190601為創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），菌株HM190606為副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）。毒力基因檢測顯示，菌株HM190601具有vvhA、vvpE、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA等毒力因子，菌株HM190606具有pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、hlyA等毒力因子。溶血性和人工感染試驗表明，菌株HM190601和HM190606均呈β溶血，LD50分別為1.41×105 CFU/g和9.82×102 CFU/g，對大海馬具有強致病性。帶菌糠蝦投喂試驗顯示，2菌株都可通過大海馬腸道感染進入體內(nèi)，并引起大海馬肝腎等組織病變和皮膚潰爛，但要出現(xiàn)典型癥狀病程，至少需要7 d以上的時間。

關(guān)鍵詞 大海馬;爛皮病;病原菌鑒定;致病性

中圖分類號：S94 文獻標識碼：B 文章編號：2095–3305（2021）06–0136–06

海馬（Hippocampus spp.）又稱水馬、馬頭魚，隸屬硬骨魚綱、海龍目、海龍科、海馬屬（Hippocampus）。海馬具有很高的藥用和觀賞價值，市場價格較高，但由于過度捕撈和海洋環(huán)境的惡化，其野生資源量急劇減少。目前，全世界所有海馬種類都已被列為保護物種，野生資源禁止捕撈和進行國際貿(mào)易[1]。因此，海馬的人工養(yǎng)殖能夠在保護海馬資源和滿足消費者的需求中發(fā)揮重要作用。大海馬（Hippocampus kuda）是我國土著種，主要分布于東海和南海，體型碩大，具有較高的經(jīng)濟價值，市場需求大，是我國人工養(yǎng)殖研究開展較早的品種之一，也是目前國內(nèi)養(yǎng)殖的主要品種，但由于受病害的影響，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量至今仍未取得實質(zhì)性的突破。據(jù)報道，大海馬的病害主要有寄生蟲病、細菌病和真菌病等，特別是由細菌引起的體表潰爛病和腸炎病，發(fā)病率高、傳染性強，是目前大海馬養(yǎng)殖中最為嚴重的兩種疾病[2-6]。

2019年6月，浙江臺州某大海馬養(yǎng)殖場發(fā)生了大海馬批量死亡現(xiàn)象，主要病癥為海馬軀干皮膚潰爛、肝腎組織病變。為了明確大海馬的發(fā)病原因，對患病大海馬進行了細菌分離鑒定及其致病性研究，以期為規(guī)模化大海馬養(yǎng)殖過程中的疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康和患病的大海馬均來自浙江臺州某海馬養(yǎng)殖場，患病大海馬平均體質(zhì)量為4.4±0.2 g/尾，健康大海馬平均體質(zhì)量為2.5±0.1 g/尾。斑馬魚（Danio rerio）購自寧波北侖花鳥市場，平均體長為3.5±0.2 cm。

1.2 主要藥品和試劑

TCBS和TSA培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，API 20E細菌鑒定試劑盒購自生物梅里埃有限公司，2K Plus DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Taq Master Mix購自康維世紀生物科技有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 細菌的分離純化

取患典型病癥瀕死的大海馬，體表經(jīng)無菌生理鹽水沖洗后用酒精棉消毒，無菌操作取肝、腎、皮膚潰爛等部位組織劃線接種于TSA和TCBS平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，挑選優(yōu)勢菌落在相同培養(yǎng)基上劃線純化，并觀察菌落形態(tài)。本實驗獲得2株純培養(yǎng)菌株，編號分別為HM190601和HM190606，所獲菌株純培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水加總濃度20%的甘油，并放置于-80℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細菌形態(tài)觀察和生理生化特性測定

把獲得的2菌株分別接種于TSA斜面，28℃培養(yǎng)24 h后進行革蘭氏染色和透射電鏡觀察。電鏡樣品制作：先用PBS（pH7.4）制成濃度約107 cells/mL的菌懸液，吸取一滴菌液放在封口膜上，銅網(wǎng)懸吸5 min后，醋酸雙氧鈾染色20 s，晾干后用日立H-7650透射電鏡觀察并拍照。細菌生理生化特性測定采用API 20E試劑盒并參考房海[7]、趙乃昕[8]等文獻進行。

1.5 菌株的分子鑒定

煮沸法提取2菌株DNA，以提取的DNA為模板，分別對2菌株的16S rRNA和HSP60、topA、gyrB、merB 4個看家基因片段序列進行擴增，得到各目的基因的特異性引物（表1）。具體反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃變形30 s，54℃～61℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃終延伸2 min，進行30個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系都為25 μL：2×TaqMasterMix12.5 μL，上下游引物1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測后，送上海華大基因科技有限公司測序，并把測序所獲得的16S rRNA基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫比對Blast序列，下載相似性≥99%的菌株16S rRNA基因序列，采用Prime5.0整理獲得的序列，并利用MEGA6.06軟件，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)16S rRNA鑒定結(jié)果，選取10株模式菌株及1株外群菌株，從Genbank下載HSP60、topA、gyrB、merB看家基因序列，使用上述軟件串聯(lián)4個看家基因，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 人工感染試驗

用健康海馬在實驗室水簇箱中暫養(yǎng)2周以上，經(jīng)檢查確認無病進行試驗。海馬養(yǎng)殖水溫為25±1℃，鹽度25%，pH 7.6～7.8，試驗期間正常投餌，連續(xù)充氣，日換水量約為60%。

1.6.1 腹腔注射感染試驗 分別設(shè)HM190601菌組、HM190606菌組、1：1混合菌組及對照組，每組12尾海馬。把2菌株分別接種于TSA斜面培養(yǎng)20 h，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液濃度約為109 CFU/mL，每尾注射10 ?L，對照組注射等量無菌生理鹽水。

1.6.2 口服感染試驗 分別設(shè)HM190601菌組、HM190606菌組、1：1混合菌組及對照組，每組40尾海馬。感染組先用餌料糠蝦分別在菌濃度約105 CFU/mL的海水中暫養(yǎng)2 d后進行投喂，每天投喂2次，早上8：00，下午4：00，連續(xù)投喂3 d，對照組正常投喂，試驗為期28 d。

1.6.3 LD50測定 采用斑馬魚進行，試驗設(shè)3大組，分別為HM190601組、HM190606組和1：1混合菌組，每大組各設(shè)5個不同感染濃度組和1個對照組，每小組15尾魚。先用0.85%的生理鹽水把試驗菌制成濃度約為107 CFU/mL的菌懸液，再10倍稀釋成5個系列濃度，以此為各小組的感染菌液，每尾魚注射菌液40 ?L，對照組注射等量無菌生理鹽水。試驗時水溫為28±1℃，試驗期間不投餌，連續(xù)充氣，日換水量約為60%，利用寇氏法計算LD50。

1.7 溶血性試驗

把HM190601和HM190606菌株劃線接種于TSA平板上培養(yǎng)20 h，取單菌落點種于哥倫比亞血瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24 h后觀測溶血圈的大小。

1.8 毒力基因檢測

根據(jù)菌株鑒定結(jié)果，參考文獻篩選出12個毒力基因（vvhA、viuB、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA、hlyA、tdh、trh）進行檢測（表1）。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.5，所有引物合成及基因測序都由上海華大基因科技有限公司完成。

2 實驗結(jié)果

2.1 大海馬發(fā)病癥狀

發(fā)病大海馬為1齡親體海馬，平均體質(zhì)量（4.4±0.2） g，發(fā)病率為60%以上，死亡率約30%?；疾〕跗?，大海馬進食量明顯減少，活力下降，有的不附著在電纜線上，游動沒有方向感。隨著病情加重，大海馬不進食，嚴重的側(cè)躺在池底，不斷蜷縮、掙扎，背腹皮膚出現(xiàn)淡黃色斑點并逐漸擴大轉(zhuǎn)為白色，潰爛脫落，有的露出白骨（圖1a）。解剖可見肝變色、有腹水（圖1b），有的腎腫大（圖1c）。一旦出現(xiàn)明顯病癥，一般3～5 d就會死亡。

2.2 分離菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

從患典型病癥大海馬的肝中分離獲得2株疑似病原菌HM190601和HM190606，2株菌均為G-短桿菌，兩端鈍圓，具極生單鞭毛菌株HM190601大小為（0.6～1.1）×（2.0～2.5）? ?m，菌株HM190606大小為（0.8～1.1）×（1.5～2.3） ?m。2株菌在28℃的TSA平板上培養(yǎng)24 h后均呈白色菌落，直徑約2～3 mm;在28℃的TCBS平板上培養(yǎng)24 h后均呈藍綠色菌落，直徑約2 mm。

從2菌株的生理生化特性測定結(jié)果可知，2株菌均耐鹽，氧化酶、賴氨酸脫羧酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性，可利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對O/129敏感，以上這些特征與房海、趙乃昕等資料中所描述的弧菌屬細菌主要特征完全一致（表2）。

2.3 菌株的分子鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株的16S rRNA基因序列分析 通過測序菌株的16S rRNA基因片段，結(jié)果顯示菌株HM190601序列長度為1 438 bp，菌株HM190606的序列長度為1 400 bp（GenBank登錄號分別為MT814720和MT814721）。經(jīng)BLAST比對結(jié)果及利用MEGA6.06構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹表明，菌株HM190601與Vibrio vulnificus聚類，與V. vulnificus NBRC 15645=ATCC 27562的相似性為99.78%;菌株HM190606與V. parahae-molyticus聚類，與V. parahaemolyticus msr5的相似性為100%（圖2）。

2.3.2 菌株的多位點基因序列分析 通過進一步采用HSP60、topA、gyrB、merB等4個看家基因?qū)闔M190601和HM190606進行鑒定，結(jié)果顯示，菌株HM190601的HSP60、topA、gyrB、merB基因片段長度分別為529 bp、720 bp、1115 bp、700 bp，菌株HM190606的HSP60、topA、gyrB、merB基因片段長度分別為521 bp、655 bp、1138 bp、892 bp。通過生物學聚類軟件MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HM190601與創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）聚成一簇，菌株HM190606與副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）聚成一簇（圖3）。因此，綜合2.2和2.3的結(jié)果，鑒定菌株HM190601為創(chuàng)傷弧菌，菌株HM190606為副溶血弧菌。

2.4 人工感染試驗結(jié)果

HM190601菌和HM190606菌對大海馬的腹腔注射人工感染結(jié)果顯示，這2株菌對大海馬都具有明顯的致病性，單菌感染和混合菌感染48 h，大海馬的死亡率均為100%（表3）。其中，HM190601菌感染大海馬主要病癥為注射部位發(fā)炎，肝略腫、有色斑;HM190606菌感染的主要病癥為注射部位發(fā)炎，肝變軟腫脹，腹水較多;而混合菌感染的大海馬病癥更加多樣化，除了單菌感染的一些癥狀外，有的還出現(xiàn)了腎腫、腸道發(fā)炎的癥狀。帶菌糠蝦投喂試驗顯示，2菌株都可以通過大海馬腸道感染進入體內(nèi)且可導致大海馬出現(xiàn)體表潰爛癥狀，而混合菌感染后的癥狀與自然發(fā)病海馬病癥完全一樣，在發(fā)病大海馬體內(nèi)又可分離到較純的感染菌，但大海馬出現(xiàn)典型癥狀時至少是實驗7 d以上（表4）。

采用腹腔注射斑馬魚測定2菌株的半數(shù)致死量（LD50），得到以下數(shù)據(jù)（表5）。根據(jù)Santos等[16]對細菌毒力的判定標準，菌株HM190601和HM190606都具有強致病性。

2.5 菌株的溶血活性

菌株HM190601和HM190606在28℃的哥倫比亞血平板上培養(yǎng)24 h后均呈β溶血，溶血圈直徑分別為13 mm和11 mm。

2.6 菌株的毒力基因檢測結(jié)果

從2菌株的12種毒力基因檢測結(jié)果可見，菌株HM190601能檢測出9種毒力基因，菌株HM190606能檢測出6種毒力基因（表6）。

3 討論

目前，細菌的分子鑒定一般采用16S rRNA基因，但由于弧菌種間的16S rRNA基因序列相似度極高，對于種水平的鑒定準確性有限。因此，本研究在16S rRNA基因鑒定的基礎(chǔ)上，對菌株HM190601和HM190606又進行了HSP60、topA、gyrB、merB 4個看家基因的序列分析，并結(jié)合形態(tài)學和生理生化特性試驗確定菌株HM190601為創(chuàng)傷弧菌，菌株HM190606為副溶血弧菌。

據(jù)報道，創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌都是G-嗜鹽條件致病菌，廣泛存在于河口、近海及海底沉積物中，是人和動物的常見病原菌。創(chuàng)傷弧菌最早由Hollis[17]等在1976年鑒定為嗜鹽性弧菌，1979年被Farmer[18]命名為創(chuàng)傷弧菌，它可引起鰻鱺（Anguilla japonica）、矛尾復蝦虎魚（Synechogobius hasta）、珍珠龍躉（Pearl gentian）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、鯔魚（Mugil cephalus）、黃姑魚（Nibea albiflora）、赤魟（Dasyatis akajei）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）等多種魚類及蝦、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）等水產(chǎn)動物疾病。副溶血弧菌最早由Fujino等[19]1953年從日本1例食用咸沙丁魚中毒患者排泄物中分離并鑒定，1963年被Sakazaki等命名，其后陸續(xù)有許多關(guān)于該菌感染水產(chǎn)動物的病例被報道，是至今研究相對較多的海水養(yǎng)殖主要病原菌之一，可引起鯔魚、大黃魚（Pseudosciaena crocea）、石斑魚（Epinephelus spp.）、海鯛（Sparus aurata）等多種魚類和蝦、蟹等甲殼類[20-21]及九孔鮑（Haliotis diversicolor）、縊蟶（Sinonovacula constricta）等貝類[22-23]患病死亡。而創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌引起魚類的病癥很相似，主要為體表出血潰瘍、爛鰭爛尾、肝腎等組織病變。目前，關(guān)于創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌引起海馬疾病的報道很少，僅Jiang等報道從頭頸潰爛的大海馬體內(nèi)分離到一株創(chuàng)傷弧菌，發(fā)病大海馬死亡前表現(xiàn)嗜睡、內(nèi)臟發(fā)炎和腸道發(fā)白等癥狀;Lin[24]和姜芳燕等曾分別從患腸炎病的灰海馬（H.erectus）和大海馬體內(nèi)分離到副溶血弧菌，該菌可以引起消化系統(tǒng)疾病。而本研究的人工感染結(jié)果顯示，單菌感染和混合菌感染都可引起大海馬注射部位發(fā)炎潰爛、肝腎等組織病變，其中混合菌感染引起的病癥更加復雜多樣，主要癥狀與這二種菌感染魚類的癥狀也更為相似。

本研究的結(jié)果還顯示，菌株HM190601和HM190606都具β溶血活性，對大海馬都具有強毒性，其中菌株HM190601含有vvhA、viuB、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA等毒力基因，它們可以編碼與菌體致病性相關(guān)的毒力因子，這些毒力因子與于明明[25]、葉淑瑤[26]等報道的創(chuàng)傷弧菌的主要毒力因子完全相符。而菌株HM190606有pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、hlyA等毒力基因，不具有tdh和trh基因，雖然tdh或trh依賴型溶血活性被認為是副溶血弧菌致病性的典型標志，但李妍等[27]的研究結(jié)果認為缺tdh和trh基因的菌株其基因組中可能存在其他溶血素基因，從而導致了溶血，這與本研究的結(jié)果相同。

此外，已有的一些研究也證實，創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌都可以通過體表損傷部位或消化道等途徑感染水產(chǎn)動物。而對本次大海馬發(fā)病養(yǎng)殖場的調(diào)查顯示，大海馬日常養(yǎng)殖用水和養(yǎng)殖池等養(yǎng)殖設(shè)施均經(jīng)過嚴格的消毒，養(yǎng)殖池內(nèi)面光滑且海馬性情溫和，不會因互相撕咬而造成體表損傷，由此認為本次病害弧菌直接透過體表造成大海馬感染發(fā)病的可能性不大。而經(jīng)過進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在本次大海馬發(fā)病前一周，曾投喂過從養(yǎng)殖場外塘自然捕獲的鮮活糠蝦，經(jīng)檢測剩余凍糠蝦，發(fā)現(xiàn)其弧菌含量很高，與本研究的病原菌存在一定相關(guān)性。因此，推測本次大海馬發(fā)病可能是由投喂含致病菌糠蝦餌料引起的，人工感染試驗也證實投喂帶菌糠蝦可導致大海馬患病死亡，發(fā)病癥狀與自然發(fā)病大海馬基本相同。本研究認為當創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌進入腸道后，由于條件適宜繁殖快速并產(chǎn)生多種毒力因子，這些毒力因子先作用于腸粘膜細胞，使其通透性增強、細胞破壞，進而促使血管通透性增強，大量菌體進入血液并通過血液循環(huán)進入肝腎等組織器官引起病變，包括皮膚潰爛，最后機體因全身性感染至各機能衰竭死亡。

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責任編輯：黃艷飛

Abstract In June 2019， a large number of seahorses died in a farm in Zhejiang Province. In order to determine the cause of the disease， tissue samples from diseased seahorses were collected and two pathogenic bacterial strains were isolated and named as HM190601 and HM190606. The HM190601 and HM190606 strains were subsequently identified as Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus by morphological observation， physiological and biochemical characteristics and molecular identification， respectively. The detection test of virulence factors showed that HM190601 strain carried nine virulent genes such as vvhA， vvpE， pilA， Wza， vvpE， rtxA， ctxA， toxR， tcpA， while HM190606 strain expressed only six virulent genes including pilA， Wza， vvpE， rtxA， ctxA， hlyA. Hemolysis test showed that both HM190601 and HM190606 strains were observed to be β-hemolytic. The experimental infections were conducted by intraperitoneal injection with bacterial isolates into zebrafish， and the results showed that both strains were highly pathogenic with the median lethal dose （LD50） value of 1.41×105 CFU/g and 9.82×102 CFU/g， respectively. Feeding test with shrimp Mysis spp. carrying bacteria demonstrated that both strains could cause the pathological changes of liver and kidney， and skin ulceration through the intestinal infection of seahorses， but the typical symptoms did not appear until 7 days.

Key words Hippocampus kuda; Skin ulcer disease; Pathogen identification; Path-ogenicity