高 倩

（北京安潔康生物科技有限公司，北京，100071）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

樣品為白鯊牌過硫酸氫鉀復(fù)合粉（北京安潔康生物科技有限公司出品）

-20 ℃冰箱（Haier BCD-223WDPT）

40 ℃烘箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 GSP-9270MBE)

生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 BSC-1100A2-X）

菌種：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）

1.2 硫代硫酸鈉中和法測(cè)試濃度

濃度測(cè)試方法依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）[1]。具體步驟如下：

（1）取一份樣品加適量水稀釋，作為顏色對(duì)照。

（2）使用碘量瓶精確稱量0.5 g樣品（精確到0.0001），用10 ml純化水溶解。

（3）加入10 ml的2 mol/L硫酸+水（質(zhì)量比1︰15），搖勻。

（4）加入10 ml的100 g/L碘化鉀溶液，搖勻，蓋上玻璃塞，水封，放置暗處5 min。

（5）拔掉玻璃塞，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉滴定至溶液呈淡黃色，加入5 g/L淀粉溶液10滴，溶液立即變藍(lán)色，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄消耗硫代硫酸鈉體積。過硫的百分含量計(jì)算如下：

其中X為過硫的百分含量，%；

C為硫代硫酸鈉的濃度，mol/L；

V是消耗硫代硫酸鈉的體積，ml；

m為稱取的樣品的質(zhì)量，g。

（6）測(cè)試結(jié)果：白鯊牌過硫酸氫鉀復(fù)合粉的有效含量為10.6%。

1.3 懸液定量殺菌法測(cè)試殺菌能力

1.3.1 菌種制備方法

（1）以無菌操作方式開啟菌種管，用移液槍加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0～10.0 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h，即為第3代培養(yǎng)物。

（2）取第3～6代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h的新鮮斜面培養(yǎng)物，吸取3.0～5.0 ml0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液，加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0 ml吸管將洗液移至另一無菌試管中，用蝸旋振蕩器混合20 s，或在手掌上振打80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。

（3）初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需濃度。

（4）細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用，應(yīng)當(dāng)天使用不得過夜。

（5）懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化實(shí)驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。

1.3.2 中和劑測(cè)試

（1）參照《消毒技術(shù)規(guī)范》第2002版[1]。選用中和肉湯作為中和劑，試驗(yàn)設(shè)置四組：

第1組 中和劑+硬水+菌懸液→培養(yǎng)

第2組 （消毒劑+中和劑）+菌液→培養(yǎng)

第3組 稀釋液+硬水+菌懸液→培養(yǎng)

第4組 稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基→培養(yǎng)

（2）測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 中和劑測(cè)試結(jié)果

從表1結(jié)果可知，中和肉湯可以作為過硫酸氫鉀消毒液的中和劑。

1.3.3 殺菌能力測(cè)試

殺菌能力測(cè)試方法依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）[1]，具體步驟如下：

（1）配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液，使其菌體濃度達(dá)到1×108～5×108cfu/ml。

（2）按照測(cè)試要求配制消毒液（濃度=目標(biāo)濃度×1.25），本實(shí)驗(yàn)使用消毒液濃度為1︰400，故實(shí)際稀釋比例為1︰320。

（3）取消毒實(shí)驗(yàn)用無菌試管，先加入0.5 ml實(shí)驗(yàn)用菌懸液，再加入0.5 ml有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻，再吸取上述各濃度消毒液4.0 ml注入其中，迅速混勻并立即計(jì)時(shí)。

（4）待實(shí)驗(yàn)菌與消毒劑相互作用至20 min，分別吸取0.5 ml實(shí)驗(yàn)菌與消毒劑混合液加于4.5 ml中和劑中，混勻。

（5）各管實(shí)驗(yàn)菌與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用10 min后，分別吸取1.0 ml樣液，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可進(jìn)行系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

（6）同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒液，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，作為陽性對(duì)照。

（7）所有實(shí)驗(yàn)樣本均在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48 h觀察最終結(jié)果。

（8）實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，計(jì)算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值：

殺滅對(duì)數(shù)值（KL）＝對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（No）—實(shí)驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（Nx）

計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值時(shí)，取小數(shù)點(diǎn)后兩位值，可以進(jìn)行數(shù)字修約。但是，如果消毒實(shí)驗(yàn)組消毒處理后平均生長(zhǎng)菌落數(shù)小于1時(shí)，本規(guī)范規(guī)定此時(shí)的殺滅對(duì)數(shù)值，即大于等于對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（KL≥No）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

將白鯊牌過硫酸氫鉀復(fù)合粉以1︰320稀釋，分裝于三個(gè)容器內(nèi)，分別放置于4 ℃冰箱、室溫（20 ℃）、40 ℃烘箱內(nèi)，等溫度穩(wěn)定后使用懸液定量殺菌法在各自溫度下殺菌20 min，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下殺菌對(duì)數(shù)值

由表2可以看出過硫酸氫鉀復(fù)合粉在常溫下可有效殺滅金黃色葡萄球菌，但是低溫會(huì)影響它的殺菌效果。因此我們使用兩種方法來消除低溫對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉的影響，分別是延長(zhǎng)殺菌時(shí)間和增加消毒液濃度。

由表3可以看出，通過提高消毒液濃度至1︰200或者延長(zhǎng)殺菌時(shí)間至40 min都可以使過硫酸氫鉀復(fù)合粉在低溫下有效殺滅金黃色葡萄球菌。

表3 4℃條件下，不用濃度和不同作用時(shí)間下殺菌對(duì)數(shù)值

2.1.2 水硬度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

分別使用純水、500 mg/kg硬水、1000 mg/kg硬水、2000 mg/kg硬水將白鯊牌過硫酸氫鉀復(fù)合粉以1︰320稀釋，使用懸液定量殺菌法殺菌20 min，結(jié)果見表4。

表4 不同水硬度下殺菌對(duì)數(shù)值

由表4可以看出，隨著水硬度的增加，過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力會(huì)逐漸降低。

2.1.3 有機(jī)干擾物對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

將白鯊牌過硫酸氫鉀復(fù)合粉進(jìn)行1︰320稀釋，進(jìn)行懸液定量殺菌試驗(yàn)時(shí)分別以純水、1.5 g/L、3g/L的牛血清白蛋白代替有機(jī)干擾物進(jìn)行試驗(yàn)，殺菌20 min，結(jié)果見表5。

表5 不用有機(jī)干擾物濃度下殺菌對(duì)數(shù)值

由表5可以看出，有機(jī)干擾物會(huì)影響過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力，但是在標(biāo)準(zhǔn)濃度下（3 g/L），過硫酸氫鉀復(fù)合粉對(duì)金黃色葡萄球菌仍然有良好的殺菌效果。

2.2 結(jié)果討論

2.2.1 溫度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌效果影響比較大，而實(shí)際應(yīng)用的環(huán)境溫度根據(jù)一年四季溫度的變化而變化，一般都在4～40 ℃之間（此消毒液不防凍，不能在0 ℃下使用），在常溫下，消毒工作可按照正常的稀釋比例和消毒時(shí)間操作；當(dāng)冬天溫度較低時(shí)，正常的濃度和殺菌時(shí)間條件下無法達(dá)到應(yīng)有的殺菌效果，所以應(yīng)根據(jù)本地的環(huán)境條件適當(dāng)增加使用濃度或者延長(zhǎng)消毒時(shí)間以便達(dá)到預(yù)期的消毒效果。

2.2.2 水硬度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

工廠稀釋消毒劑時(shí)均會(huì)選用自來水，不同地區(qū)的水質(zhì)區(qū)別也很大，因此在使用此消毒劑時(shí)應(yīng)對(duì)本地區(qū)的水質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)水硬度過大時(shí)需要對(duì)消毒劑濃度或者消毒時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，或者可以將水進(jìn)行處理后再配制成消毒劑。雖然水硬度對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力影響不是很明顯，但是使用優(yōu)質(zhì)水進(jìn)行稀釋會(huì)更好地達(dá)到預(yù)期消毒效果。

2.2.3 有機(jī)干擾物對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺菌效果的影響

工廠內(nèi)部會(huì)有很多種類的有機(jī)干擾物，比如養(yǎng)殖動(dòng)物的糞便，因此消毒前的清潔衛(wèi)生就成了消毒質(zhì)量的關(guān)鍵因素。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有機(jī)干擾物的存在不會(huì)對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力產(chǎn)生很大影響，但是如果有機(jī)干擾物的量過大的話依然會(huì)使過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力下降，使消毒工作達(dá)不到預(yù)期的效果。因此，清潔是消毒的前提，在做消毒工作之前一定要先做好清潔工作。

3 結(jié)論

通過在不同溫度、水硬度、有機(jī)干擾物濃度條件下進(jìn)行過硫酸氫鉀復(fù)合粉殺滅金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)過硫酸氫鉀復(fù)合粉的殺菌能力受多種因素的影響。這些因素與地理位置、季節(jié)和其他一些原因變化有關(guān)，因此我們?cè)谶x用此消毒液進(jìn)行對(duì)環(huán)境消毒時(shí)，一定要考慮周圍的環(huán)境因素，避免發(fā)生無法達(dá)到預(yù)期的消毒效果的情況。