張宇婷， 楊 建， 耿龍武， 王 雨，姜海峰，李晨宇，徐 偉??

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所， 黑龍江 哈爾濱 150070；2. 黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心， 上海 201306)

我國有大量的鹽堿水資源，尤其是東北地區(qū)水體堿度高、硬度大[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽堿脅迫會導致魚類產(chǎn)生應激反應[2]，而魚類在應激狀態(tài)下，其機內(nèi)會產(chǎn)生大量的有害的氧自由基或者磷酸化的產(chǎn)物，從而對魚體產(chǎn)生危害[3-5]。為了協(xié)調(diào)機體應對環(huán)境中的鹽堿脅迫，魚體重新進行能量分配和生理調(diào)節(jié)，不可避免的削弱魚類的生長、繁殖和免疫等機能，嚴重甚至造成魚類的死亡[6-7]。研究表明，不同魚類在鹽堿脅迫下的免疫應激反應和調(diào)控機制不盡相同[8-9]。因此，掌握不同養(yǎng)殖對象在鹽堿脅迫下生理生化變化和應激反應機制，可為鹽堿水體中的養(yǎng)殖與生產(chǎn)提供一定的理論基礎。

大鱗鲃(Luciobarbuscapito)原產(chǎn)于烏茲別克斯坦，具有耐鹽堿、抗逆性強以及生長速度快等特點[10-12]。目前，有關大鱗鲃的堿度適應性研究主要集中在生存[12]、生長發(fā)育[11]、滲透調(diào)控[2]等方面，而在氧化應激響應方面，本實驗室前期僅針對NaHCO3堿度脅迫下大鱗鲃肝、腎和鰓組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等的活性變化進行了初步分析[8]，為了更全面地揭示堿度脅迫對大鱗鲃機體氧化應激水平的影響，本研究檢測分析了不同堿度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)等氧化應激參數(shù)、血清皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素水平以及組織結(jié)構(gòu)的變化，以期闡明堿度脅迫對大鱗鲃抗氧化能力和機體應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚取自中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站。隨機挑選300尾體長(28.7±1.0) cm，體質(zhì)量(246.00±7.56) g的健康、體型正常1齡幼魚于室內(nèi)暫養(yǎng)3 d。其中，實驗魚的雌雄比例為1∶1。暫養(yǎng)用水為曝氣2 d的自來水，水溫23 ℃。

根據(jù)楊建等[8]的報道和預實驗結(jié)果，設置4個NaHCO3堿度實驗組(10.0、20.0、30.0和40.0 mmol/L)和淡水對照組實驗組(0.5 mmol/L)，pH分別為8.28、8.43、8.55、8.63和8.05。每組設置3個平行，每個平行組隨機放魚30尾，各實驗組3個平行共用一個循環(huán)缸。實驗溶液采用曝氣2 d的自來水和NaHCO3(國產(chǎn)，分析純)在體積202 L的玻璃缸中進行配制[13]，并用酸堿滴定法檢測校準，穩(wěn)定2 d后放魚，開始為期7 d的脅迫實驗，期間每天換1/3溶液。為減小魚體在打撈過程中產(chǎn)生的應激反應，實驗期間每天投喂1次，水溫為(22.0±1.5) ℃。

1.2 試驗方法與樣品采集

實驗開始后分別于3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和7 d共 7個時間點進行樣品采集。用40 mg/L的MS-222麻醉，各組在各時間點分別從3個平行組隨機采集1尾實驗魚，共采集3尾。尾部靜脈采集血液樣本，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清于-80 ℃保存待測；冰上解剖采集實驗魚肝、腎和鰓組織，并用4 ℃預冷的生理鹽水潤洗，用吸水紙吸干后迅速放入凍存管，液氮保存待測[13]。此外，取部分肝、腎和鰓組織用Bouin’s液固定，用于組織切片的制備與觀察。

1.3 組織氧化應激指標和激素水平測定

取0.2 g肝、腎和鰓組織樣本，按照質(zhì)量與體積比1∶9加入預冷的0.86%生理鹽水，用組織研磨儀(MM400，Retsch)10 000～15 000 r/min研磨成10%組織勻漿。將制備好的10%勻漿4 ℃條件下2 500 r/min離心10 min(sigma,德國，離心半徑為13.5 cm)，取上清，用于測定ACP、AKP、GSH-Px和MDA，測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

采用酶聯(lián)免疫法ELISA和Synergy HTX多功能檢測儀(Bio Tek)測定大鱗鲃血清皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司(Cat.# m1003467-C)。

1.4 石蠟切片制作

石蠟切片采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色法)。將固定好的組織在乙醇中梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明后，將組織用石蠟包埋、在切片機上進行切片，切片厚度為5 μm。切片用蘇木精溶液、酒精、伊紅染料進行染色，染色后切片經(jīng)酒精梯度脫水后再經(jīng)二甲苯透明，最后用樹膠封片。在光學顯微鏡(OLMPUS BX53，Japan)下拍照觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果均以Mean±SD表示，并運用SPSS 20.0與Graphpad prism 8軟件單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗其顯著性，采用Duncan’s多重比較分析各指標的差異(P<0.05.)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織ACP活力的影響

如圖1所示，相同堿度脅迫下，大鱗鲃肝和腎組織中ACP活力變化顯著(P<0.05)，其均隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，鰓組織ACP活力則呈現(xiàn)先升后降并逐步趨于平穩(wěn)的變化趨勢；3種組織酶活力均在12 h時達到峰值。在脅迫前期，相同時間點，3種組織中ACP活力均隨堿度的升高而顯著升高(P<0.05)；隨著脅迫時間的延長，各堿度實驗組在脅迫7 d內(nèi)，3種組織 ACP活力均恢復至對照組水平。此外，淡水對照組3種組織ACP活力在整個實驗過程中無顯著性差異(P>0.05)。在堿度脅迫下，腎組織ACP活力最高，為1.5～3.4 U/g；肝組織和鰓組織次之，分別為1.1～2.5 U/g和0.8～2.5 U/g。

(a、b、c分別表示大鱗鲃肝、腎、鰓組織的ACP活力。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。a, b, and c represent the ACP activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.2 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織AKP活力的影響

由圖2可知，相同堿度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中AKP活力均隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的顯著變化(P<0.05)，而腎和鰓組織AKP活力則在脅迫48 h后逐漸趨于穩(wěn)定；3種組織AKP活力均在脅迫12 h時達到最大。堿度脅迫初期，相同時間點，3種組織中AKP活力均隨著堿度的升高而顯著升高(P<0.05)；且3種組織AKP活力均在脅迫7 d內(nèi)基本恢復至對照組水平。此外，對照組3種組織AKP活力在整個實驗過程無顯著性差異(P>0.05)。在堿度脅迫下，腎組織AKP活力(0.9～1.6 U/g)最高，肝組織(0.2～1.7 U/g)次之，鰓組織(0.1～0.7 U/g)最小。

(a、b、c分別表示大鱗鲃肝、腎、鰓組織的AKP活力。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。a, b, and c represent the AKP activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.3 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織GSH-Px活力的影響

由圖3可知，相同堿度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中GSH-Px活力變化顯著(P<0.05)，其均隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，且3種組織酶活力均在脅迫12 h時達到峰值。堿度脅迫初期，相同時間點，3種組織中GSH-Px活力均隨著堿度的升高而顯著升高(P<0.05)，且3種組織各堿度處理組均在脅迫7 d內(nèi)恢復至對照組水平。此外，淡水對照組3種組織中GSH-Px活力在整個實驗過程中無顯著性變化(P>0.05)。在堿度脅迫下，腎組織GSH-Px活力(13.3～90.3 U/L)最高，肝組織(32.6～88.2 U/L)次之，鰓組織(22.9～60.8 U/L)最小。

(a、b、c分別表示大鱗鲃肝、腎、鰓組織的GSH-Px活力。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。a, b, and c represent the GSH-Px activity of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05) .)

2.4 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織MDA含量的影響

由圖4可知，相同堿度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中MDA含量均隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的顯著性變化(P<0.05)，3種組織均在脅迫12 h時MDA含量達到頂峰。堿度脅迫初期，相同時間點，3種組織中MDA含量均隨著堿度的升高而顯著升高(P<0.05)，3種組織均在脅迫7 d內(nèi)基本恢復至對照組水平。在堿度脅迫下，腎組織MDA含量最高，為10.9～58.9 nmol/mg其次是肝組織和鰓組織，分別為3.9～58.6 nmol/mg和11.4～49.1 nmol/mg。

(a、b、c分別表示大鱗鲃肝、腎、鰓組織的MDA含量。圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。a, b, and c represent the MDA content of liver, kidney, and gill. Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.5 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃血清皮質(zhì)醇激素和促腎上腺皮質(zhì)激素水平的影響

由圖5可知，相同堿度脅迫下，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇激素和促腎上腺皮質(zhì)激素水平均隨脅迫時間的延長而呈現(xiàn)先上升后下降的顯著性變化(P<0.05)，且激素水平均在脅迫12 h時達到最高。此外，堿度脅迫初期，相同時間點，大鱗鲃血清中皮質(zhì)醇激素和促腎上腺皮質(zhì)激素的含量均隨著堿度的升高而顯著升高(P<0.05)，且隨著脅迫時間的延長，2種激素水平均在脅迫7 d內(nèi)恢復至對照組水平。堿度脅迫下，皮質(zhì)醇激素和促腎上腺皮質(zhì)激素的變化范圍分別為46.0～209.0 ng/L和1.5～16.0 ng/L。

(圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different low case letters indicate significant differences (P<0.05).)

2.6 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，淡水對照組大鱗鲃肝細胞飽滿，呈多面體，排列緊密(見圖6a)；腎組織的結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，腎小管中細胞飽滿且完整，第一近曲小管(PⅠ)管徑較大，十分發(fā)達，管腔不規(guī)則，上皮細胞呈柱形，第二近曲小管(PⅡ)管徑較小，管腔呈圓形，上皮細胞呈錐形(見圖6c)；鰓組織鰓絲分布均勻，排列緊密，細胞飽滿，胞間間隙不明顯，鰓絲血管腔邊界清晰，內(nèi)有血細胞，鰓小片粗壯，間距較小，尖端膨大(見圖6e)。

(圖中a,c,e分別為7 d后對照組肝臟、腎臟和鰓組織；圖中b,d,f分別為7 d后40 mmol/L堿度組肝臟、腎臟和鰓組織。 N：細胞核；LC：肝細胞；RC：紅細胞；PⅠ：第一近曲小管；PⅡ：第二近曲小管；RT：腎小管；CC：泌氯細胞；SL：鰓小片。1：肝細胞萎縮；2：細胞核偏移；3：腎小管萎縮；4：鰓小片尖端收縮變??；5：鰓小片基部腫脹膨大。a, c and e showed the liver, kidney and gill tissues of the control group after 7 days, respectively；b, d, and f represent the liver, kidney and gill tissues of the 40mmol/L alkalinity group after 7 days, respectively N: cell nucleus; LC: liver cell; RC: red blood cell; PⅠ: first proximal; PⅡ: second proximal segment; RT: renal tubule; CC: chlorine cells; SL: gill lamellae.1: Hepatocyte atrophy; 2: Nuclear migration; 3: Renal tubules atrophy; 4: The tip of the gill lamella shrinks and becomes smaller; 5: Swelling and swelling of the base of the gill lamella.)

40 mmol/L NaHCO3堿度脅迫7 d后，肝細胞出現(xiàn)不同程度萎縮，且少量細胞出現(xiàn)細胞核偏移(見圖6b)；腎組織中各級腎小管出現(xiàn)不同程度萎縮，腎小管外圍出現(xiàn)大小不一，形狀不規(guī)則的空白間隙(見圖6d)；鰓組織中鰓絲細胞收縮，血管腔邊界模糊，血細胞數(shù)量減少，鰓小片基部腫脹膨大，鰓小片尖端收縮變小(見圖6f)。

3 討論

3.1 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃抗氧化水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫會引起魚類機體應激反應，為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，機體各組織亦會產(chǎn)生相應的應激響應[14]。ACP和AKP是衡量機體免疫能力的重要指標[15]，通過催化機體生物活性物質(zhì)的磷酸化和去磷酸化反應調(diào)控機體的新陳代謝；而GSH-Px是機體中用于清除過氧化物的一種酶，將過氧化物分解為水和氧氣，從而保護機體免受過氧化物的損害[16]。本研究中，堿度脅迫初期，相同脅迫時間下大鱗鲃肝、腎和鰓組織中ACP、AKP和GSH-Px活力與堿度呈顯著正相關性。說明大鱗鲃在進入堿度環(huán)境后，隨著堿度濃度的升高，機體產(chǎn)生的應激響應強度隨之增加，機體的ACP、AKP和GSH-Px水平亦升高從而應對環(huán)境對魚體造成的應激損傷[13]。在高NaHCO3堿度環(huán)境下3種酶活力恢復穩(wěn)定所需時間明顯長于低堿度環(huán)境，這是由于高堿環(huán)境比低堿環(huán)境對機體產(chǎn)生的損傷更顯著[8]，這與王卓等[17]、劉汝建等[18]的結(jié)果一致，與張宇婷等[13]在NaCl鹽度環(huán)境對大鱗鲃脅迫的研究結(jié)果相似。此外，相同堿度條件下，不同組織ACP、AKP和GSH-Px活力大小亦不相同，其中腎組織3種酶的活力最大，肝次之，鰓組織最??；表明腎組織在應對NaHCO3堿度脅迫過程中發(fā)揮著至關重要的作用。

MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，可以有效反映機體脂質(zhì)的過氧化水平高低，是衡量機體氧化損傷水平的重要指標之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，堿度脅迫初期，相同時間下，大鱗鲃肝、腎、鰓組織中MDA含量隨NaHCO3堿度的升高而顯著升高；這表明在NaHCO3堿度脅迫下，大鱗鲃體內(nèi)產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物并被分解生成大量的MDA，且堿度越高，機體中脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象越嚴重[13,20]。此外，高堿條件下，3種組織MDA含量恢復初始水平所需時間顯著高于低堿環(huán)境，這與廖亞麗等[21]的結(jié)果一致。

3.2 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃血清皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素水平的影響

皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素水平的高低是反映魚類應激狀態(tài)的重要指標[22]。在環(huán)境因子脅迫下，魚類機體可通過其下丘腦-垂體-腎間腺軸(HPI)，釋放促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇等激素，進而促進機體糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝和免疫水平等，以應對機體的應激反應。本研究顯示，脅迫初期，在同一脅迫時間下，大鱗鲃機體血清中皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素的含量在高堿脅迫下(40和30 mmol/L)明顯高于低堿度組(10和20 mmol/L)且隨著堿度梯度的升高急劇上升；而隨著脅迫時間的延長，皮質(zhì)醇激素和促腎上腺皮質(zhì)激素的濃度在7 d內(nèi)均逐漸恢復至對照組水平，表明大鱗鲃在堿度環(huán)境中通過機體自身的調(diào)控，逐步適應了堿度環(huán)境，這與Albert等[23]對鹽度脅迫下花鰻鱺(Anguillamarmorata)的結(jié)論一致。

3.3 NaHCO3堿度脅迫對大鱗鲃組織結(jié)構(gòu)的影響

環(huán)境脅迫下，魚類機體除產(chǎn)生相應的生理生化變化外，機體某些組織的結(jié)構(gòu)亦會發(fā)生適應性變化[24]。研究表明，NaHCO3堿度會對魚類肝組織造成組織學病變[25]。本研究顯示，在NaHCO3堿度脅迫下，大鱗鲃肝細胞出現(xiàn)輕微萎縮并伴有細胞核偏移等病理性變化，但實驗期間并未出現(xiàn)細胞壞死現(xiàn)象。

腎臟是魚類重要的滲透調(diào)控器官，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮著重要作用[26]。淡水魚類的腎組織的結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，腎小管中細胞飽滿且完整；而海水魚類的腎臟退化，腎小球變小，腎小管縮短；這一差異主要是由外界環(huán)境的滲透壓差異所導致的。本研究亦發(fā)現(xiàn)，40 mmol/L高NaHCO3堿度脅迫下，大鱗鲃腎組織各級腎小管均出現(xiàn)不同程度萎縮，這與楊建等[27]的結(jié)果相一致。

鰓是魚類與其生存環(huán)境直接接觸的器官，易于受到環(huán)境因子的干擾而影響其正常的生理功能。本研究表明，在高堿度(40 mmol/L)脅迫下，大鱗鲃鰓絲細胞收縮，鰓小片基部腫脹膨大，鰓小片尖端收縮變小，比表面積增大，在一定程度上增加了水體與鰓絲的接觸面積，有利于鰓組織與外界環(huán)境的離子交換和溶氧的獲取[27]。隨著環(huán)境堿度的進一步升高，鰓小片進一步萎縮，鰓上皮細胞壞死和脫落，鰓小片比表面積減小，生理機能亦受到影響，進而導致機體的死亡[25,27]。

在本研究中，大鱗鲃的肝、腎和鰓組織在40 mmol/L NaHCO3堿度脅迫下雖發(fā)生了病理性變化，但并未出現(xiàn)病理性表現(xiàn)或者死亡現(xiàn)象。由于本實驗為短期脅迫試驗，大鱗鲃的組織結(jié)構(gòu)是否為適應性變化還需進行長期脅迫實驗進行進一步的驗證。

4 結(jié)語

在大鱗鲃剛進入堿度環(huán)境時，對外界環(huán)境產(chǎn)生了劇烈的反應，在曝露12 h內(nèi)機體抗氧化能力逐步達到最強，之后隨著時間的延長，逐步適應相應的堿度環(huán)境，7 d內(nèi)各指標均基本穩(wěn)定，整個實驗過程中未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明大鱗鲃在高堿度(40 mmol/L) NaHCO3環(huán)境表現(xiàn)出較強的適應能力。