李詠梅， 李騰飛， 田相利,2??， 羅 凱， 王龍斌， 張盛坤， 魏 聰， 劉 楊

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室， 山東 青島 266237)

益生菌是指在一定濃度范圍內(nèi)可以促進宿主健康的活體微生物制劑[4]，作為抗生素的替代品，近幾年，益生菌被廣泛用于促進水生動物的生產(chǎn)性能及預防和治療疾病，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究和應用焦點[5]。研究表明，益生菌不僅可以通過與致病菌競爭生存環(huán)境等來抑制致病菌的生長，從而提高水產(chǎn)動物的存活率[6]，還能夠調(diào)控水質(zhì)，降低水體中的氨氮等有害物質(zhì)的濃度[7]。其中，芽孢桿菌經(jīng)常被用作水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的有益微生物。例如，Zhou等[8]發(fā)現(xiàn)水體潑灑凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)SC8168，在一定濃度下能顯著提高凡納濱對蝦幼蝦的存活率和消化酶活性。此外，當用于水體潑灑時，凝結(jié)芽孢桿菌B16也有效促進了羅非魚(Oreochromisniloticus)的生長[9]。現(xiàn)有研究表明，芽孢桿菌作為益生菌，單獨或與其他益生菌聯(lián)合使用可有效提高魚類生長速度和飼料利用率。Gobi等[10]和Aly等[11]報道了地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)Dahb1和短小雙歧桿菌(B.pumilus)顯著促進了低眼巨鯰(Pangasiushypophthalmus)和羅非魚(O.niloticus)的生長。Zokaeifar等[12]則發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)L10和G1可以通過增強凡納濱對蝦的免疫反應來提高其生長性能和抗病性。

研究表明，養(yǎng)殖水體添加適量的碳源，會提高水體中的碳氮比，促進益生菌的生長繁殖，并可通過異養(yǎng)菌的同化作用去除水中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮[13]。聚羥基丁酸戊酸酯(Poly hydroxybutyrate-co-valerate，PHBV)是微生物在非平衡狀態(tài)下(如缺乏氮、磷)在細胞內(nèi)合成的一種熱塑性聚酯，具有生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學活性等許多優(yōu)良特性[14]。因其具有較好的生物降解性，同時能夠以固體材料形式存在，使其在異養(yǎng)反硝化中的應用成為可能[15]。PHBV作為碳源在污水處理系統(tǒng)中的固相反硝化過程的應用已經(jīng)取得了較好的效果[16]。同時，PHBV具有緩釋碳的特點，放入水體后，可以持續(xù)提供碳源且易于控制。不過，迄今為止，盡管PHBV等固體碳源在工業(yè)污水處理應用廣泛，但作為碳源在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用還少見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

所用凡納濱對蝦幼蝦購自青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。實驗之前，使對蝦在實驗條件下適應和馴化2周。馴化過程中，水溫控制在(25±0.5) ℃，鹽度控制在29.0±1.0，日換水1次，每次換水量為10%，連續(xù)充氣。每天定時投喂凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料3次(7：00、12：00和18：00)。馴化結(jié)束后，挑選質(zhì)量、大小相似的健康凡納濱對蝦用于實驗。

實驗所用菌株均來自中國海洋大學水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學實驗室保種中心，為3株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，包括枯草芽孢桿菌H1及其與短小芽孢桿菌BP-171和鹽單胞菌DN3[25-27]。實驗過程中，各處理組均使用鮮活菌液，活菌量為1×109cfu·mL-1。PHBV材料形狀為圓柱形，高為4 mm，內(nèi)徑為1 mm，白色，購自豪圣工程有限公司。由于PHBV 材料只能在微生物膜的作用下分解并釋放DOC[14-15,28]，所以在使用前，PHBV材料在海水中活化10 d，使其能夠自然掛膜，活化過程中進行充分曝氣。

1.2 實驗設計

凡納濱對蝦養(yǎng)殖實驗在18個容積為500 L白色聚乙烯養(yǎng)殖水槽中進行。設置了6個不同處理組，其中，D1處理組僅添加PHBV，D2處理組僅添加枯草芽孢桿菌H1，而D3、D4和D5則在添加PHBV的基礎(chǔ)上，分別添加枯草芽孢桿菌H1(D3)、枯草芽孢桿菌H1+鹽單胞菌DN3組合(1∶1，D4)以及枯草芽孢桿菌H1+鹽單胞菌DN3+短小芽孢桿菌BP-171組合(1∶1∶1，D5)。同時，以不添加PHBV和益生菌處理組作為對照(DZ)。每個處理組分別設置3個重復，每個重復隨機放養(yǎng)120尾規(guī)格相似的對蝦，對蝦平均體質(zhì)量為(2.26±0.02) g。

PHBV材料置于內(nèi)徑為10 cm，高35 cm的PVC塑料管中，PVC管內(nèi)設置氣石進行充氣，不僅可通過充氣充分攪動顆粒，還可通過充氣產(chǎn)生的水流將緩釋的碳源持續(xù)釋放到水體中。PHBV材料裝填完成后，用合適的紗網(wǎng)將塑料管兩端覆蓋，防止材料露出，并將整個裝置置于相應的處理組養(yǎng)殖設施內(nèi)。

整個養(yǎng)殖實驗在青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司16號車間進行，實驗持續(xù)時間為9周。

1.3 日常管理

1.3.1 活菌的培養(yǎng) 將保藏的菌種接種于2216E液體培養(yǎng)基，在160 r/min、(28.0±1.0) ℃的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期待用。經(jīng)檢測，此期每毫升菌液中含活菌1×109cfu。

1.3.2 養(yǎng)殖管理 實驗期間，每日按照對蝦總質(zhì)量的5%投喂凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料3次(7：00、12：00和18：00)，并根據(jù)剩余餌料狀況、對蝦的體長和天氣變化等情況，適度調(diào)整投餌量。每隔7 d向不同處理組均勻潑灑培養(yǎng)至適量濃度的菌液(活菌濃度約為1×109cfu·mL-1)。菌液由實驗室自行制備，潑灑后使各處理組水體中的益生菌濃度約達到1×104cfu·mL-1。

圖1 固體碳源PHBV緩釋裝置示意圖Fig. 1 Diagram of PHBV slow release device for solid carbon source

1.4 樣品采集及測定

1.4.1 生長指標的測定 分別在實驗開始和結(jié)束時對各個處理組對蝦進行計數(shù)和稱重，并計算凡納濱對蝦特定成活率、飼料效率和特定生長率。各類生長指標計算公式如下：

成活率(Survival rate，SR)=Nt/N0×100% ；

飼料效率(Feed conversion ratio，F(xiàn)ER)=

(Wt-W0)/Wf×100%；

特定生長率(Specific growth rate，SGR)=

(lnWt- lnW0)/t×100%。

式中：Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wf為每個網(wǎng)箱所投飼料總質(zhì)量(g)；Wt和W0分別為對蝦的初體質(zhì)量和末體質(zhì)量(g)，均為濕質(zhì)量；t為實驗天數(shù)(d)。

1.4.2 非特異性免疫酶活性的測定 實驗結(jié)束后，每個養(yǎng)殖桶中隨機抽取15尾對蝦進行血清采集。用1 mL無菌注射器從凡納濱對蝦腹部血竇中緩慢抽取血淋巴置于1.5 mL無菌離心管中。經(jīng)4 ℃靜置過夜，5 000 r/min-1離心15 min取上清液，于-80 ℃冰箱中保存。

對蝦血清中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、總一氧化氮合酶(TNOS)和過氧化物酶(POD)活性，以南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進行具體測定，參照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 水質(zhì)指標測定 每周采集500 mL水樣，當天送回實驗室進行水質(zhì)指標的測定。使用全自動間斷化學分析儀(Clever Chem 380G，德國DeChem-Tech. GmbH公司)，按照說明書進行操作，測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮、總氮、可溶性活性磷酸鹽和總磷的數(shù)據(jù)。同時，取1 mL水樣用無菌生理鹽水以10的倍數(shù)進行逐級稀釋，最終取稀釋倍數(shù)為105～109水樣在2216E培養(yǎng)基上均勻涂布，28.0 ℃培養(yǎng)24 h后進行平板計數(shù)，確定水體中總菌數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)的方式表示，數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0分析軟件中的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P<0.05則表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 添加益生菌和PHBV對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

2.1.1 實驗期間水質(zhì)指標 實驗期間，水溫在24和26 ℃之間波動，水中溶解氧一直高于7 mg·L-1。各處理組溶氧及pH與對照相比未見顯著差異(P>0.05)。

表1 實驗期間各水質(zhì)參數(shù)的平均值±標準差Table 1 Each water quality parameter during the experiment(Mean±SD)

2.1.3 活性磷酸鹽和總磷的變化 DZ組和D2組活性磷酸鹽(SRP)濃度顯著高于其他處理組(P<0.05)，各處理組的活性磷酸鹽濃度在0～42 d均呈現(xiàn)出上升趨勢，42～56 d時期上升速率提高，在56 d之后可溶性活性磷酸鹽均呈現(xiàn)下降趨勢。在實驗開始28 d后，對照組的活性磷酸鹽濃度基本高于其他處理組。

各處理組中總磷(TP)的濃度變化趨勢均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，均在42～56 d之間達到峰值，然后開始下降，與活性磷酸鹽變化趨勢基本一致，但實驗前期(0～21 d)對照組的總磷濃度顯著高于其他處理組(P<0.05)，中后期與其他處理組差別不大。實驗期間，各處理組與對照相比，總磷平均濃度未見顯著差異(P>0.05)。

圖3 活性磷酸鹽(A)和總磷(B)在不同處理組中的濃度變化Fig. 3 Fluctuations of active phosphorus SPR(A) and TP(B)

2.2 添加益生菌和PHBV對凡納濱對蝦生長的影響

不同處理對蝦生長情況如表2所示?？梢钥闯觯砑右嫔蚉HBV可不同程度提高凡納濱對蝦的生長速度。其中，各處理組對蝦末體質(zhì)量均顯著高于對照組(P<0.05)，各處理組對蝦的總質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)，而D3、D4和D5組對蝦總質(zhì)量則顯著高于對照組和D1(P<0.05)。除D1組外，其他處理組的對蝦成活率均顯著高于對照組(P<0.05)。各處理組對蝦特定生長率均顯著高于對照組(P<0.05)，但對蝦飼料效率未見顯著差異(P>0.05)。

表2 凡納濱對蝦的總質(zhì)量、成活率、特定生長率和飼料效率Table 2 Gross weight, survival rate, specific growth rate, feed efficiency ratio of L. vannamei

2.3 添加益生菌和PHBV對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響

圖4所示分別為不同處理組和對照組凡納濱對蝦血清中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、總一氧化氮合酶(TNOS)和過氧化物酶(POD)等非特異性免疫酶活性。由圖4可知，在養(yǎng)殖過程中各處理組對蝦血清ACP和LZM活性顯著高于對照組(見圖4A，圖4C，P<0.05)。其中，以D5組的ACP活性最高，D2、D3和D5組LZM活性顯著高于D1和DZ組(P<0.05)。D1組AKP活性與對照組相比差異不顯著，其他處理組均顯著高于對照組(見圖4B，P<0.05)，其中D4組的AKP活性最高。D1和D5組超氧化物歧化酶(SOD)活性與對照差異不顯著，其他處理組均顯著高于對照組(P<0.05)(見圖4D)。各處理組TNOS酶活性與對照組相比未見顯著差異(見圖4E，P>0.05)，除D4組外，各處理組過氧化物酶(POD)活性均顯著高于對照組(見圖4F，P<0.05)。

(圖中不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，n=3。 The data with different letters mean significant differences between groups(P < 0.05). The data were expressed as mean ± SE, n=3.)

3 討論

3.1 添加益生菌和PHBV對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中氮和磷的影響

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的主要水質(zhì)問題之一是由殘餌和糞便導致的水體中氮的大量積累問題，而部分氮的形態(tài)如氨氮及亞硝酸氮等，則直接對養(yǎng)殖動物具有直接的毒性作用[29]。研究表明，適宜的益生菌可以有效降低水體中氨氮等有害物質(zhì)的濃度，從而改善水產(chǎn)動物的生存環(huán)境[30]。近年來，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化生物脫氮技術(shù)已成為研究熱點，但相關(guān)應用方面的研究主要集中在實驗室小試階段，中試以上規(guī)模的報道較少，且多以生物強化的手段為主，即將好氧反硝化菌(群)以菌劑的形式外源投加于生物反應器中，以期提高反應器的脫氮效能[31]。本研究所使用的菌株枯草芽孢桿菌H1、短小芽孢桿菌BP-171和鹽單胞菌DN3均分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在實驗室研究中表現(xiàn)出了優(yōu)異的脫氮性能[25-27]。在本研究中，添加枯草芽孢桿菌H1或同時添加PHBV和益生菌的各處理水體總氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮的平均濃度均顯著低于對照組。在研究期間，各處理組水體不同形態(tài)氮濃度動態(tài)變化有所差異?？傮w上看，各處理組氮濃度與對照相比，主要差異體現(xiàn)在實驗的中、后期。添加益生菌和碳源各處理組的總氨氮和硝酸氮濃度均顯著降低。其中，以單獨加枯草芽孢桿菌H1的處理組(D2)效果最佳；而同時添加碳源和3種益生菌處理組(D5)水體中亞硝酸氮濃度最低?？梢钥闯觯M管在養(yǎng)殖期間各處理組的降氮效果有所差異，但除了單獨添加PHBV對亞硝酸氮去除作用不明顯外，添加益生菌和碳源及其不同組合均可以有效地降低對蝦養(yǎng)殖水體不同形態(tài)的氮濃度。但與單獨添加枯草芽孢桿菌H1相比，3株菌等比例組合處理僅在亞硝酸氮處理能力上表現(xiàn)出了一定優(yōu)勢，如何進一步優(yōu)化3株菌組合比例需要進一步的研究與驗證。目前，關(guān)于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體應用的報道還很少見。從本研究看，盡管3株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌體現(xiàn)出了較好的降氮效果，但在實際養(yǎng)殖條件下的降氮效果與實驗室研究[25-27]相比還存在一定的差異，這可能與實際養(yǎng)殖環(huán)境條件的復雜性有關(guān)。因此，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌在對蝦養(yǎng)殖中的實際應用技術(shù)值得進一步深入研究。

一般來講，異養(yǎng)菌的菌體成分需要必需氨基酸、糖類等有機物才能夠合成，因此其生長需要在適宜的C/N中完成[32]。因此，理論上添加碳源可以促進對蝦養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌的生長，通過異養(yǎng)菌的同化作用，將水體中的無機氮轉(zhuǎn)化為自身的生物量[33]。因此，在本研究中，添加PHBV處理組可能主要是通過異養(yǎng)菌同化作用降低水體氮濃度。而異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌與PHBV的組合，則通過細菌的同化作用、硝化作用與反硝化作用共同加強了水體中氮的轉(zhuǎn)化過程，降低了水體氮濃度。

在養(yǎng)殖系統(tǒng)中，磷的輸入主要來自飼料和肥料，為沉積性循環(huán)元素，其利用率有待提高[34]。本研究中磷的主要輸入為投餌，主要的利用途徑為細菌和藻類，當然，部分磷也可以通過食物鏈被對蝦利用。總體上看，添加益生菌和PHBV對各處理水體總磷濃度影響不大，但同時添加益生菌和PHBV可有效降低水體活性磷濃度，具體機制有待于進一步研究。

3.2 不同益生菌組合和PHBV對凡納濱對蝦生長的影響

研究表明，補充投喂益生菌可以通過補充消化酶、提高飼料效率、預防腸道菌群紊亂[35]，進而促進水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長速度。例如，Rahiman 等[36]將NL110 桿菌和NE17 弧菌用于羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)，對蝦生長率、存活率及免疫水平均得到顯著提高。劉翠玲等[37]將枯草芽孢桿菌添加至鯉(Cyprinuscarpio)飼料中進行投喂，發(fā)現(xiàn)可提高鯉的特定生長率。本研究中，通過水體添加方式，將益生菌和碳源應用到對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)，各處理凡納濱對蝦的生長和產(chǎn)量均顯著提高，但對飼料效率影響不大。這一作用可能與益生菌和碳源對養(yǎng)殖水質(zhì)的改善直接相關(guān)。通過添加碳源提高養(yǎng)殖水體C/N，可促進與優(yōu)化異養(yǎng)細菌的生長，也可起到改善水質(zhì)的作用[38]。例如，添加PHBV材料使養(yǎng)殖水體中更易形成生物絮團，降低養(yǎng)殖水體中氮的濃度，從而提高凡納濱對蝦的成活率和產(chǎn)量[38]。Li等[39]也發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖水體中添加PHBV和PBS作為碳源，可以顯著促進羅非魚生長。Ray等[40]的研究則表明，生物絮團系統(tǒng)通過降低養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮和氨氮的濃度，可提高凡納濱對蝦的成活率。

3.3 添加益生菌和PHBV對凡納濱對蝦非特異性免疫指標的影響

與脊椎動物不同，無脊椎動物高度依賴非特異性免疫，因為它們?nèi)狈Λ@得性免疫系統(tǒng)[41]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(POD)是甲殼動物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基、活性氧，防止生物分子方面的損傷，起到免疫抗病作用[42]。水產(chǎn)動物腸道微生物易受到所生活環(huán)境菌群的影響，進而對機體免疫等生理過程產(chǎn)生影響。本研究中，添加益生菌處理組對蝦血清SOD和POD總體顯著高于對照組，這與Liu等[43]和李軍亮等[44]的結(jié)果相似。溶菌酶屬于對蝦體內(nèi)的第一道防線，主要作用是溶解革蘭氏陽性細菌[45]。本研究中添加益生菌處理對蝦血清溶菌酶活性均顯著高于對照組，這與Kewcharoen等[46]的結(jié)果相似。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，與生物體內(nèi)物質(zhì)攝取與轉(zhuǎn)運直接相關(guān)，也是機體免疫抗病不可缺少的重要免疫酶[47]。本研究中，添加益生菌和PHBV均可顯著提高對蝦血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，且提高幅度隨添加益生菌種類增多而增加，這表明復合益生菌的效果可能比單一益生菌更顯著。這一結(jié)果與胡毅等[48]在凡納濱對蝦中發(fā)現(xiàn)復合芽孢桿菌比單一芽孢桿菌有更好的添加效果相似。推測這可能是由于不同細菌在腸道微生物區(qū)系中占有不同的生態(tài)位，因而添加復合益生菌組比添加單一益生菌有更好的免疫及生長效果[49]?？傄谎趸厦冈跈C體免疫物質(zhì)誘導下會釋放出大量的NO，這些被釋放的NO可參與到后續(xù)免疫反應中，從而對病原生物產(chǎn)生殺滅作用[50]。本研究中添加益生菌和PHBV對蝦血清總一氧化氮合酶與對照組未見顯著差異，這與常杰等[51]的結(jié)果有所不同，這可能由于對蝦未受到弧菌等病原菌的感染，所以體內(nèi)沒有誘導出總一氧化氮合酶表達的免疫物質(zhì)，使得總一氧化氮合酶的活性未出現(xiàn)差異。另外，碳源的添加可提高水體中的碳氮比，利用水體中的糞便、殘餌形成生物絮團，這種生物絮團也可以被凡納濱對蝦攝食[52]，生物絮團中富含維生素和多糖類等多種有益物質(zhì)[53]，這些物質(zhì)被凡納濱對蝦攝取之后，也有助于對蝦免疫力的提高。例如，Mansour等[54]發(fā)現(xiàn)生物絮團增加了羅非魚(O.niloticus)SOD和POD活性，與本研究結(jié)果相似。

4 結(jié)語

水體中添加PHBV和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株枯草芽孢桿菌H1、短小芽孢桿菌BP-171以及鹽單胞菌DN3的不同組合均可有效改善水質(zhì)，提高了對蝦的生長性能，并在一定程度上增強了對蝦非特異免疫能力?？傮w比較而言，添加益生菌各處理優(yōu)于僅添加PHBV處理，同時添加益生菌與PHBV對水體氮去除能力與僅添加枯草芽孢桿菌H1差異不大，但益生菌與PHBV的組合有助于提高對蝦的生長性能。