高志麗，王瑞雯，崔嘉紋，白亞楠，史海龍，李 洋

（華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山 063000）

許多污染物如藥物、殺蟲劑、煙草煙霧、有機溶劑和有毒物質(zhì)等都會引起氧化應(yīng)激[1]，使體內(nèi)活性氧自由基的生成和細胞抗氧化防御體系之間失衡，危害機體健康。由于大腦代謝率很高且主要為有氧代謝，會產(chǎn)生大量活性氧自由基，更容易發(fā)生氧化應(yīng)激[2]，對腦組織造成氧化損傷。多種腦部疾病如心腦血管疾病、阿爾茲海默癥等的發(fā)生發(fā)展機制，都涉及到氧化應(yīng)激損傷[3]?？寡趸瘎┠芤种谱杂苫纳?，改善機體抗氧化防御體系，延緩慢性疾病的發(fā)展[4]。因此，研究安全、有效、無毒、無副作用、能預(yù)防或減輕氧化應(yīng)激的天然抗氧化劑具有重要意義。國內(nèi)外研究表明，黃酮類化合物在體內(nèi)外具有清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強體內(nèi)抗氧化的能力[5]，是天然抗氧化劑研究的熱點。

楮果是桑科構(gòu)屬植物構(gòu)樹（Broussonetia papyriferaL.）的成熟果實，無毒、可食用，在我國分布非常廣泛，資源豐富[6]，在民間已有上千年的歷史，是我國傳統(tǒng)民間草藥和保健食品。楮果中含有礦物元素、多糖、維生素、脂肪油、生物堿、色素等多種化學(xué)成分[7]，其中色素呈橙紅色，色澤鮮艷，穩(wěn)定性較好，經(jīng)初步分析屬于黃酮醇類黃酮化合物[8]。楮果在改善記憶[9]、保護神經(jīng)元[10]、抗氧化[11]等方面表現(xiàn)出良好的活性，但目前國內(nèi)外對楮果總黃酮的研究還集中于提取、含量測定等方面，關(guān)于其抗氧化活性、防治氧化應(yīng)激的研究報道較少，其食用和藥用價值尚未得到開發(fā)利用。

動物四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）中毒是一種模擬氧化應(yīng)激的實驗?zāi)Ｐ停诟闻K、腎臟、大腦和血液等組織中都能引起自由基的產(chǎn)生，造成氧化應(yīng)激損傷[12?13]。本研究將楮果總黃酮的體外抗脂質(zhì)過氧化實驗與CCl4誘導(dǎo)小鼠腦組織氧化損傷實驗相結(jié)合，評價其體內(nèi)外抗氧化能力，為楮果總黃酮在功能性食品、抗氧化保健品和化妝品方面的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級昆明雄性小鼠60 只 體重（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境12 h 黑暗的光照周期，溫度在21～23 ℃和濕度在50%～60%，給予喂食認證的飲食和純凈水；楮果 采摘于唐山，經(jīng)華北理工大學(xué)藥學(xué)院劉占軍教授鑒定為桑科構(gòu)樹屬植物構(gòu)樹（Broussonetia papyriferaL.）的果實；肝素鈉 美國biosharp 公司；過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2） 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；L-抗壞血酸、硫代巴比妥酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸 北京邁瑞達科技有限公司；蘆?。兌?95%） 中國藥品生物制品檢定所；水飛薊素 美國Sigma 公司；CCl4分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染色液 珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

Lambda 35 紫外可見分光光度計 美國Perkin-Elmer 公司；VCX 130 超聲勻漿器 美國Sonics &Materials 公司；ST 16R 冷凍離心機 美國Thermo Fisher 公司；ELX800 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BX53F 顯微鏡 日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 楮果總黃酮的制備與含量測定 楮果洗凈晾干，加入80%乙醇（料液比1:10 g/mL）在40 ℃、640 W超聲下提取30 min，反復(fù)提取3 次，合并濾液，減壓濃縮，得楮果總黃酮粗提液[14]；稱取活化的D-101 大孔樹脂3 g（濕重），加楮果總黃酮粗提液50 mL，置于轉(zhuǎn)速140 r/min、25 ℃恒溫振蕩器上，振蕩吸附12 h后，用去離子水清洗吸附了黃酮的D-101 大孔樹脂，然后加入50 mL 80%乙醇溶液，置于恒溫振蕩器上解吸24 h，抽濾，保存濾液（解吸液）[15]。解吸液減壓濃縮后凍干，得楮果總黃酮粉末。參照《中國藥典》2015 年版第一部“山楂葉”項下總黃酮的含量測定方法，以蘆丁標準品為對照，用NaNO2?Al（NO3）3?NaOH 分光光度法繪制回歸曲線，得到回歸方程為：y=11.152x+0.0001，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。按以上方法測得楮果總黃酮純度達63.6%。

1.2.2 楮果總黃酮體外抗氧化能力的測定

1.2.2.1 對紅細胞溶血抑制率的測定 昆明種小鼠禁食過夜，摘眼球采血，加入肝素鈉抗凝。血樣中加10 倍磷酸鹽緩沖液（pH7.4），2000 r/min 離心5 min，沉淀物按上述方法離心洗滌3 次，制備為0.5%的紅細胞懸液，于4 ℃保存（制備6 h 內(nèi)使用）。

取1 mL 紅細胞懸液，加0.1 mL 不同濃度的楮果總黃酮溶液（對照組加去離子水0.1 mL）和0.1 mL H2O2（100 mmol/L），37 ℃恒溫水浴1 h，加入4 mL磷酸鹽緩沖液，2000 r/min 離心5 min，415 nm 測吸光度，以抗壞血酸為陽性對照[16]。紅細胞溶血抑制率計算公式如下：

式中：A415（對照）為空白組吸光度；A415（樣品）為樣品組吸光度。

1.2.2.2 對肝、腦組織勻漿的脂質(zhì)過氧化抑制率的測定 取新鮮小鼠肝、腦組織，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗血漬，擦干，稱重。按料液比1:9的比例加磷酸鹽緩沖液，將肝、腦組織于冰上剪碎、研磨，制成10%組織勻漿，3500 r/min 離心15 min，上清液4 ℃保存?zhèn)溆茫ㄓ脮r稀釋）。

取10%肝勻漿和2%腦勻漿各1 mL，分別加入0.1 mL 不同濃度楮果總黃酮溶液（對照組加去離子水），混勻，37 ℃水浴30 min，然后加0.1 mL H2O2（100 mmol/L），再水浴30 min，最后加入20%三氯乙酸和0.67%硫代巴比妥酸各1 mL，混勻后置于95 ℃水浴15 min，冷卻后以5000 r/min 離心10 min，在532 nm 處測定上清液吸光度，用抗壞血酸作為陽性對照[17]。脂質(zhì)過氧化抑制率計算公式如下：

式中：A532（對照）空白組吸光度；A532（樣品）樣品組吸光度。

1.2.2.3 線粒體腫脹度的測定 在4 ℃條件下，將10%肝勻漿1000 r/min 離心20 min，再將上清液10000 r/min 離心20 min，所得沉淀再加10 倍體積磷酸鹽緩沖液10000 r/min 離心20 min，最后用冰磷酸鹽緩沖液重懸制成懸液[18]?？捡R斯亮藍染色法測定其蛋白濃度，調(diào)整為0.5 mg/mL 線粒體懸液，4 ℃保存。

取線粒體懸液2 mL 加不同濃度的楮果總黃酮溶液0.2 mL，再加FeSO4溶液（0.5 mmol/L）和抗壞血酸溶液（0.5 mmol/L）各0.2 mL，混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋，每隔5 min 在520 nm 測吸光度[18]。空白組用等體積磷酸鹽緩沖液代替黃酮溶液、FeSO4溶液和抗壞血酸溶液，模型組用等體積磷酸鹽緩沖液代替黃酮溶液，用蘆丁作為陽性對照。

1.2.2.4 總抗氧化能力的測定 依次向試管中加H2SO4（3.0 mol/L）、Na3PO4（0.14 mol/L）和鉬酸銨（0.02 mol/L）各1.0 mL，然后加入1.0 mL 不同濃度的楮果總黃酮溶液（空白組加等體積去離子水），再加入1.0 mL去離子水，混勻后95 ℃水浴加熱90 min，695 nm 測吸光度[19]。用抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.3 楮果總黃酮對CCl4致小鼠腦損傷的防護作用

1.2.3.1 小鼠腦損傷模型的建立 將60 只昆明種小鼠隨機分為6 組（每組10 只）：空白組、模型組、陽性對照組（水飛薊素，0.2 g/kg）、楮果總黃酮低劑量組（0.15 g/kg）、楮果總黃酮中劑量組（0.3 g/kg）、楮果總黃酮高劑量組（0.6 g/kg），灌胃給藥（楮果總黃酮低、中、高劑量組灌胃劑量設(shè)置依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果），1次/d，空白組和模型組每天灌胃10 mL/kg 等體積羧甲基纖維素（CMC）。除空白組外，其余各組隔天腹腔注射1:1 CCl4花生油溶液2 mL/kg，空白組給予同體積花生油，持續(xù)14 d[4,20]。末次給藥后，禁食24 h處死小鼠，迅速取出腦組織。將右腦固定在4%多聚甲醛中以制備石蠟切片，將其余部分立即儲存在?80 ℃用于其他測定。

1.2.3.2 測定氧化應(yīng)激指標 取腦組織稱重，按重量體積比（1:9）加入生理鹽水，并于冰上剪碎，研磨制備為10%腦組織勻漿。3500 r/min 離心15 min，取適量上清液用于檢測氧化應(yīng)激指標MDA、GSH 含量及SOD、GSH-PX、CAT 活性，具體步驟按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 組織病理學(xué)分析 取空白組、模型組、水飛薊素組和楮果總黃酮各劑量組小鼠腦組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟透明，HE 染色，中性樹膠封固。光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化能力

2.1.1 楮果總黃酮對紅細胞的保護作用 紅細胞具有很典型的生物體細胞膜結(jié)構(gòu)，常用于分析和篩選天然抗氧化劑。在H2O2誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生活性很強的·OH，誘發(fā)多不飽和脂肪酸氧化，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，從而造成紅細胞溶血[16]。由圖1 可見，在實驗濃度0.1～3.2 mg/mL 之間，楮果總黃酮與抗壞血酸都表現(xiàn)出抑制小鼠紅細胞溶血活性，且抑制活性隨濃度的增加而增強。楮果總黃酮和抗壞血酸抑制紅細胞溶血的IC50值分別為1.14 mg/mL 和0.43 mg/mL，雖然楮果總黃酮的IC50大于抗壞血酸，但當(dāng)濃度為3.2 mg/mL 時，其對紅細胞溶血的抑制作用與抗壞血酸已無明顯差異，說明楮果總黃酮對紅細胞溶血有較強的抑制作用。

圖1 楮果總黃酮對紅細胞溶血的抑制能力Fig.1 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on erythrocyte hemolysis

2.1.2 楮果總黃酮對肝、腦勻漿脂質(zhì)過氧化抑制活性 脂質(zhì)過氧化是多不飽和脂肪酸在細胞膜上的氧化過程，是氧自由基引起的主要有害變化之一[21]。不飽和脂肪酸的氧化分解會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)，生成丙二醛等小分子產(chǎn)物容易引起細胞形態(tài)和功能的改變[18]。由圖2 可見，在實驗濃度范圍（0.4～12.8 mg/mL）內(nèi)，楮果總黃酮對肝臟脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增加；其IC50值為1.19 mg/mL，抗壞血酸IC50值為1.06 mg/mL。當(dāng)濃度大于6.4 mg/mL 時，楮果總黃酮對肝脂質(zhì)過氧化的抑制率達90%以上，大于抗壞血酸對肝脂質(zhì)過氧化的抑制率，說明楮果總黃酮對肝組織脂質(zhì)過氧化有較強的抑制作用。

圖2 楮果總黃酮對肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制能力Fig.2 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on lipid peroxidation of liver homogenate

由圖3 可見，在實驗濃度范圍內(nèi)，楮果總黃酮對腦勻漿脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象的抑制作用迅速增長，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；其IC50值為0.87 mg/mL，抗壞血酸IC50值為7.88 mg/mL，說明楮果總黃酮對腦組織勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用遠高于抗壞血酸。

圖3 楮果總黃酮對腦勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制能力Fig.3 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on lipid peroxidation of brain homogenate

2.1.3 楮果總黃酮對線粒體腫脹度的抑制作用 在自由基存在下，線粒體膜極容易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，致使膜結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體通透性發(fā)生改變，從而引發(fā)線粒體腫脹[22]。由圖4 可見，模型組的吸光度隨著時間的增長呈明顯下降趨勢，楮果總黃酮2、4 mg/mL 組和蘆丁實驗組吸光度下降幅度明顯降低，楮果總黃酮濃度越大吸光度下降幅度越小，同濃度下楮果總黃酮較陽性對照蘆丁組的吸光度下降幅度小，表明楮果總黃酮對線粒體腫脹有抑制作用，且對線粒體的保護作用強于蘆丁。

圖4 楮果總黃酮對線粒體腫脹的抑制能力Fig.4 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on mitochondrial swelling

2.1.4 楮果總黃酮的總抗氧化力 用磷鉬酸鹽絡(luò)合物法測樣品的總抗氧化力，該方法的原理是鉬在硫酸和磷酸的作用下發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)物為綠色，在695 nm 處有較強的吸收峰[23]。而抗氧化劑會與鉬競爭發(fā)生還原反應(yīng)，其抗氧化的能力可由生成鉬藍的量間接反映，吸光度越大代表總抗氧化能力也越大。由圖5 可知，隨著楮果總黃酮濃度的增加，總抗氧化能力逐漸增強，抗氧化能力與濃度之間存在明顯的量效關(guān)系，說明楮果總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖5 楮果總黃酮的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of total flavonoids from paper mulberry fruits

2.2 楮果總黃酮對CCl4 致腦氧化損傷小鼠的保護作用

2.2.1 楮果總黃酮對小鼠腦組織MDA 含量的影響MDA 是細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化自由基的分解產(chǎn)物，是脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的重要生物標志物之一，產(chǎn)生過量會破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[24]。MDA 含量可反映組織細胞脂質(zhì)過氧化的速率或強度。如圖6 所示，與空白組相比，模型組MDA 含量極顯著增加（P<0.01），表明CCl4誘導(dǎo)的小鼠腦氧化損傷模型成功建立。與模型組相比，連續(xù)灌胃楮果總黃酮后，楮果總黃酮中、高劑量組小鼠腦組織MDA 含量極顯著降低（P<0.01），降低程度與灌胃劑量成明顯的量效關(guān)系，可見楮果總黃酮能降低小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防護腦組織氧化損傷。

圖6 楮果總黃酮對小鼠腦組織MDA的影響（,n=10）Fig.6 Effects of total flavonoids from paper mulberry fruits on MDA content in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.2 楮果總黃酮對小鼠腦組織GSH 含量的影響GSH 是一種重要的非酶促抗氧化劑，在細胞內(nèi)和細胞外都能對抗外來生物和中和活性氧，因此，體內(nèi)GSH 水平被認為是其抗氧化能力的重要指標[20,25]。如圖7 所示，模型組小鼠腦組織GSH 含量較空白組顯著降低（P<0.01），表明CCl4能破壞機體抗氧化防御機制。連續(xù)灌胃楮果總黃酮后，各劑量組小鼠腦組織GSH 含量顯著提高（P<0.01），表明楮果總黃酮能顯著增強小鼠腦組織的抗氧化能力。同時，楮果總黃酮高劑量組的GSH 含量與空白組相比已無顯著性差異（P>0.05），可見高劑量的楮果總黃酮對組織抗氧化能力的恢復(fù)作用效果出色。

圖7 楮果總黃酮對小鼠腦組織GSH 含量的影響（,n=10）Fig.7 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on GSH content in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.3 楮果總黃酮對小鼠腦組織中SOD、GSH-PX和CAT 活性的影響 SOD、GSH-PX 和CAT 等是體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除活性氧和防止活性氧形成的過程中起著至關(guān)重要的作用。SOD 是機體抵抗活性氧的一種防御機制，在氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，是過氧陰離子自由基的清除劑，能抑制自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷[26]。GSH-PX 部分位于細胞膜內(nèi)，是抗脂質(zhì)過氧化作用的酶保護系統(tǒng)之一[27?28]。GSH-PX 和CAT 分解H2O2，同時最大限度減少羥基自由基的潛在危害[2]。如圖8 所示，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-PX 和CAT 酶活性較空白組均明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明給予小鼠CCl4后，機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，楮果總黃酮各組小鼠腦組織中SOD 和GSH-PX 活性均極顯著升高（P<0.01），楮果總黃酮中、高劑量組小鼠腦組織CAT 活性顯著升高（P<0.05 或P<0.01），且呈良好的劑量依賴關(guān)系，同時，楮果總黃酮高劑量組與空白組SOD 和GSHPX 活性相比已無顯著差異（P>0.05），可見楮果總黃酮對CCl4誘導(dǎo)的小鼠腦組織氧化應(yīng)激具有較明顯的抑制作用；以上結(jié)果表明楮果總黃酮可通過提高CCl4致腦損傷小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 和CAT 酶活性，發(fā)揮防護腦組織氧化應(yīng)激損傷的作用，且劑量越高保護效果越好。

圖8 楮果總黃酮對小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 和CAT 活性的影響（,n=10）Fig.8 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on SOD,GSH-PX,CAT activity in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.4 病理組織學(xué)觀察 如圖9 可見，空白組腦組織海馬區(qū)組織學(xué)表現(xiàn)正常，神經(jīng)細胞數(shù)目多，排列緊密，均勻整齊，胞核全染；而模型組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)疏松，數(shù)量減少，排列紊亂，核輪廓不規(guī)則，核異色、固縮、核仁消失、胞漿周圍暈染、細胞間距大，說明腦組織發(fā)生了嚴重的氧化應(yīng)激損傷。楮果總黃酮干預(yù)后，腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細胞有不同程度的恢復(fù)。低劑量組海馬區(qū)細胞疏松，部分神經(jīng)細胞不飽滿，神經(jīng)細胞胞漿和細胞核界限不清；中劑量組海馬區(qū)病理性形態(tài)學(xué)改變有明顯改善；高劑量組海馬區(qū)細胞較為致密，細胞數(shù)量和形態(tài)基本恢復(fù)正常。由此可見，楮果總黃酮對CCl4致小鼠腦氧化損傷具有顯著的防護作用，防護作用與楮果總黃酮濃度呈明顯的量效關(guān)系。

圖9 楮果總黃酮對小鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響（HE，400×）Fig.9 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on pathomorphological of hippocampus in mice brain tissue (HE，400×)

3 結(jié)論

體外實驗數(shù)據(jù)表明，楮果總黃酮對生物膜實驗體系中紅細胞溶血和肝組織脂質(zhì)過氧化的抑制作用達到一定濃度時，大于陽性對照；而其對于腦組織脂質(zhì)過氧化和線粒體腫脹的抑制作用均大于陽性對照，且抑制能力與濃度呈顯著的量效關(guān)系，總抗氧化能力也很強。由此證明，楮果總黃酮具有較強的體外抗氧化能力。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，低劑量楮果總黃酮對小鼠腦組織SOD、GSH 和GSH-PX 水平均有改善作用，對MDA 含量和CAT 活性無明顯改善作用；而中、高劑量楮果總黃酮均能顯著降低CCl4致氧化損傷小鼠腦組織中過氧化物質(zhì)MDA 含量，升高抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT 活性，增加GSH 含量，提高機體防御能力，并修復(fù)腦組織海馬區(qū)病理學(xué)變化。由此可見，楮果總黃酮對小鼠腦組織氧化損傷的保護作用是通過降低MDA 水平，升高GSH 含量，同時提升SOD、GSH-PX 和CAT 活性來實現(xiàn)的。有研究表明，黃酮類化合物槲皮苷通過降低MDA 水平并將SOD、GSH-PX 和CAT 酶的活性恢復(fù)到接近正常水平來發(fā)揮其對CCl4誘導(dǎo)小鼠腦損傷的保護作用[20]。這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，楮果總黃酮具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性，有助于保護機體免受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害影響，可作為新型天然抗氧化劑，對功能性食品、營養(yǎng)保健品方面的研究和開發(fā)具有巨大的經(jīng)濟價值。