王吉力特，雍雅萍，蘇 靖，夏美茹，劉 聰（河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000）

大米是世界上三大主要谷物之一，也是食用人口最多、種植歷史最悠久的農(nóng)作物產(chǎn)品[7]。米糠是稻谷加工的副產(chǎn)品之一，是糙米經(jīng)碾米后得到的種皮、果皮、糊粉層和珠心層的混合物，富含蛋白質(zhì)12%～16%，可溶性蛋白質(zhì)約占70%，與大豆蛋白相近，其氨基酸組成與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）建議的模式接近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與雞蛋蛋白相媲美[8?9]。米糠蛋白是已知谷物中過(guò)敏性最低的一種蛋白質(zhì)，多數(shù)植物性蛋白和動(dòng)物性蛋白中都含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，往往會(huì)引起過(guò)敏或中毒等反應(yīng)，而米糠中蛋白質(zhì)不含類(lèi)似致敏因子。但是，人們卻很少關(guān)注米糠蛋白影響健康的潛在價(jià)值?，F(xiàn)已有大米蛋白[10]和糙米[11]降低血清膽固醇作用的相關(guān)報(bào)道，但米糠蛋白降膽固醇作用的報(bào)道卻很少，作用機(jī)制還有很多不明之處。本研究采用高血脂模型大鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，體外模擬人體胃腸消化道環(huán)境試驗(yàn)，對(duì)米糠蛋白質(zhì)改善脂質(zhì)的代謝作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行探討，旨在為其高質(zhì)化開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar 大鼠 5 周齡體重（90～ 100 g），日本SLC 公司；標(biāo)準(zhǔn)飼料（MF） 日本東方酵母工業(yè)株式會(huì)社；酪蛋白 日本明治乳業(yè)株式會(huì)社（Casein，純度82.75%）；米糠蛋白（Rice Bran Protein，純度81.54%）、糙米蛋白（Brown Rice Protein，純度86.80%）、大米蛋 白（White Rice Protein，純度78.80%） Oryza Oil &Fat Chemical Co.Ltd.公司；[4-14C]-膽固醇、[羰基-14C]牛黃膽酸鈉鹽 美國(guó)PerkinElmer Life Sciences；膽固醇 日本片山化學(xué)；?；悄懰徕c、油酸、磷脂酰膽堿等試劑 美國(guó)Sigma 公司；總膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、總膽汁酸試劑盒 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

U-2910 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立公司；2900TR 液體閃爍儀 美國(guó)Perkinelmer 公司；GC-14A 氣相色譜儀 日本島津公司；恒溫水浴振蕩器日本 Yamato 公司；Optima MAX TLX 臺(tái)式超高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；VP-5S 超聲波破碎儀日本Taitec 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境3 d 后，將24 只大鼠按體重隨機(jī)分為4 組，酪蛋白（CAS）作為對(duì)照組，飼料中添加20%酪蛋白作為蛋白質(zhì)來(lái)源；米糠蛋白組（RBP），飼料中添加5%米糠蛋白+15%酪蛋白作為蛋白質(zhì)來(lái)源；糙米蛋白組（BRP），飼料中添加5%糙米蛋白+15%酪蛋白作為蛋白質(zhì)來(lái)源；大米蛋白組（WRP），飼料中添加5%大米蛋白+15%酪蛋白作為蛋白質(zhì)來(lái)源。每組6 只動(dòng)物，在代謝飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)，自由攝食含高膽固醇的高脂飼料，詳細(xì)成分見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)期間室溫（22±2）℃，每12 h 明暗交替，自由飲水，每2 d 稱(chēng)1 次體重，準(zhǔn)確記錄5～6 d 和18～19 d的進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)第21 d，大鼠禁食不禁水18 h，用乙醚麻醉后，心臟采血處死，迅速取肝臟保存于?20 ℃，血清離心分離（3000 r/min，10 min，4 ℃）后?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料成分（g/100 g）Table 1 Composition of experimental diets (g/100 g)

1.2.2 血清及肝臟脂質(zhì)含量測(cè)定 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、血清高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）水平。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。血清低密度脂蛋白膽固醇+極低密度脂蛋白膽固醇（low density lipo-protein cholesterol+very low density lipoprotein cholesterol，LDL-C+VLDLC）含量，依據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

LDL-C+VLDL-C=TC -HDL-C

動(dòng)脈硬化指數(shù)（atherogenic index，AI）的計(jì)算：

(3) 利用硅-焓方程法與硅-焓圖解法估算研究區(qū)地?zé)崴谢烊肜渌谋壤?，其中地?zé)峋欣渌烊氡壤秊?9.47%～70.19%，初始溫度為182.36 ℃～212.22 ℃，溫泉中冷水混入比例為63.33%～86.93%，初始溫度為172.58 ℃～258.23℃，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨地?zé)峋疃仍黾?，混入冷水比例大幅降低，但?jì)算的初始溫度較實(shí)際溫度仍然偏高。

AI=（TC-HDL-C）/ HDL-C

按照Folch 等[12]的方法提取肝臟總脂質(zhì)水平，并參照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定肝臟膽固醇及其甘油三酯水平。

1.2.3 糞中類(lèi)固醇含量測(cè)定 收集實(shí)驗(yàn)最后3 d的糞便，60 ℃恒溫干燥72 h 后，迅速準(zhǔn)確稱(chēng)重記錄。糞便總膽汁酸排泄量，按照Bruusgaard 等[13]報(bào)道的方法提取并參照試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行測(cè)定。按照Malchow-Moller 等[14]報(bào)道的方法，用GC-14A 氣相色譜（日本島津）測(cè)定糞便中性類(lèi)固醇含量?？傤?lèi)固醇含量按以下公式計(jì)算：

總類(lèi)固醇（mg/3 d）=膽汁酸（mg/3 d）+中性糞固醇（mg/3 d）

中性糞固醇（mg/3 d）=膽固醇（mg/3 d）+甾烷醇（mg/3 d）

1.2.4 抑制膽固醇膠束溶解度測(cè)定 參考Satoshi等[15]的方法測(cè)定了酪蛋白、米糠蛋白、糙米蛋白和大米蛋白的體外膽固醇膠束溶解度抑制率。[14C]標(biāo)記的膠束溶液1 mL，由以下濃度的試劑制備并通過(guò)超聲處理3 min 進(jìn)行混合：0.74 kBq [4-14C]-膽固醇，0.1 mmol/L 膽固醇溶液，6.6 mmol/L ?；悄懰徕c溶液，1 mmol/L 油酸溶液，0.6 mmol/L 磷脂酰膽堿溶液，0.5 mmol/L 單油酸甘油酯和15 mmol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）。37 ℃恒溫振蕩孵育24 h 后1 mL 膠束溶液添加到各10 mg 蛋白樣品中，最終濃度為10 mg/mL，通過(guò)超聲波處理3 min 后，再恒溫振蕩孵育60 min，并在37 ℃、100000×g 條件離心60 min。收集上清液，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定[14C]-膽固醇水平。做4 次平行試驗(yàn)，取平均值。計(jì)算公式如下：

膠束溶解度（%）=上清液膽固醇含量（dpm）/ 膠束原液膽固醇含量（dpm）×100

1.2.5 ?；悄懰峤Y(jié)合能力測(cè)定 參考Nagaoka 等[15]的方法，取7 種不同濃度的酪蛋白和米糠蛋白后加入2 mL 含1.85 kBq ?；悄懰徕c鹽[羰基-14C]的混合液（0.1 mmol/L），最終濃度為5、10、20、40、60、80 和100 mg/mL。37 ℃恒溫振蕩消化120 min 后，在37 ℃、15000 r/min 條件離心15 min。上清液放射性含量通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定。由?；悄懰猁}總量與未結(jié)合的膽酸鹽的差值計(jì)算不同濃度酪蛋白和米糠蛋白的結(jié)合率。做3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。計(jì)算公式如下：

膽汁酸結(jié)合率（%）=（A0?A）/ A0×100

式中，A0：總?；悄懰徕c含量（dpm）；A：上清液未結(jié)合牛磺膽酸鈉含量（dpm）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷源不同蛋白對(duì)大鼠生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，實(shí)驗(yàn)期間4 組大鼠的體重均有增加，RBP 組的大鼠體重增加量和2 次采食量與CAS 組、BRP 組和WRP 組無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明各試驗(yàn)組的食物蛋白質(zhì)對(duì)大鼠生長(zhǎng)性能的作用效果無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表2 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠生長(zhǎng)性能的影響（n=6）Table 2 Effects of different proteins from rice on growth performance in Wistar rats (n=6)

2.2 稻谷源不同蛋白對(duì)大鼠血清脂質(zhì)水平的影響

由表3 可見(jiàn)，對(duì)比CAS 組，RBP 組的大鼠血清TC 水平顯著降低（P<0.05），主要反映在LDL+VLDL-C 含量的顯著降低（P<0.05）。對(duì)比CAS 組，BRP 和WRP 組的血清TC 水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。21 d的飼養(yǎng)，只有RBP 組大鼠的動(dòng)脈硬化指數(shù)（AI）較CAS 組顯著降低了45.75%（P<0.05）。對(duì)比CAS，RBP、BRP 和WRP 大鼠血清TG 水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。Zhang 等[9]研究表明，高脂模型倉(cāng)鼠試驗(yàn)中，大米蛋白及糙米蛋白與酪蛋白相比較無(wú)顯著降低血清TC 水平。而脫脂米糠蛋白在高脂模型小鼠試驗(yàn)中，顯著降低血清LDL-C 水平（P<0.05），并顯著促進(jìn)了糞便TC 和膽汁酸排泄量[16]。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果表明，RBP 能夠顯著降低大鼠血清非高密度膽固醇水平（40.81%）（P<0.05），對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化可能具有一定的預(yù)防作用。

表3 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響（n=6）Table 3 Effects of different proteins from rice on serum lipids levels in Wistar rats (n=6)

2.3 稻谷源不同蛋白對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

由圖1 可見(jiàn)，對(duì)比CAS 組，RBP、BRP 和WRP組的肝臟膽固醇水平有降低傾向但無(wú)顯著差異（P>0.05），肝臟甘油三酯水平同樣在RBP 組中有降低傾向（圖2）。對(duì)比CAS 組，RBP 組的肝臟總脂質(zhì)水平顯著降低了11.83%（P<0.05）（圖3）。該結(jié)果表明，飼料中的添加量同等條件下，相比于大米蛋白和糙米蛋白，米糠蛋白可一定程度改善肝臟膽固醇代謝，抑制肝臟脂肪的蓄積，有助于預(yù)防脂肪肝。Tong[6]等研究表明，燕麥蛋白通過(guò)降低高脂模型豚鼠肝臟膽固醇水平，改善肝臟膽固醇代謝。Varun 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，米糠蛋白的胃蛋白酶及胰蛋白酶水解產(chǎn)物具有顯著降低體外膽固醇膠束溶解度能力、結(jié)合膽汁酸能力和降低3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）作用，且分子量分布在25～45 kDa 之間，通過(guò)反向高效液色譜和液質(zhì)聯(lián)用圖譜發(fā)現(xiàn)三個(gè)主要峰的保留時(shí)間13.10、15.91 和22.07 min，質(zhì)量范圍在120～903 m/z之間。結(jié)合以上所述，米糠蛋白在體內(nèi)分解后的一種或復(fù)數(shù)活性肽發(fā)揮了改善脂質(zhì)代謝作用。

圖1 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠肝臟膽固醇水平的影響（n=6）Fig.1 Effects of different proteins from rice on hepatic cholesterol levels in Wistar rats（n=6）

圖2 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠肝臟甘油三酯水平的影響Fig.2 Effects of different proteins from rice on hepatic triglyceride levels in Wistar rats

圖3 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠肝臟總脂質(zhì)水平的影響Fig.3 Effects of different proteins from rice on hepatic total lipids levels in Wistar rats

2.4 稻谷源不同蛋白對(duì)大鼠糞固醇排泄量的影響

由表4 可見(jiàn)，對(duì)比CAS 組，糞干重除了WRP 組顯著增加外（P<0.05），RBP 組或BRP 組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。對(duì)比CAS 組，RBP、BRP 或WRP 組糞中膽汁酸排泄量均顯著增加（P<0.05）。對(duì)比CAS 組，RBP、BRP 或WRP 組糞中中性類(lèi)固醇排泄量沒(méi)有顯著增加（P>0.05），但是糞甾烷醇分別增加279.77%、171.67%或168.10%，具有顯著性差異（P<0.05）。體內(nèi)膽固醇的排出一般是通過(guò)轉(zhuǎn)化為膽汁酸的形式，膽汁酸大部分會(huì)被肝門(mén)靜脈血管重新吸收，而未被吸收的膽汁酸則直接通過(guò)糞便排泄[18]。膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶。Spady 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CYP7A1 過(guò)表達(dá)可改善小鼠高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化。在本實(shí)驗(yàn)中米糠蛋白能促進(jìn)糞便膽汁酸排泄量的原因不明確，因此今后試驗(yàn)中應(yīng)探討米糠蛋白對(duì)大鼠肝臟CYP7A1 基因表達(dá)量的影響。

表4 稻谷源不同蛋白對(duì)Wistar 大鼠糞及糞固醇排泄量的影響（n=6）Table 4 Effects of different proteins from rice on feces and feces sterol excretion in Wistar rats（n=6）

2.5 抑制膽固醇膠束溶解度的測(cè)定

由圖4 可知，在體外模擬人體胃腸消化道環(huán)境中，比較CAS 組，RBP、BRP 或WRP 組膽固醇膠束溶解度顯著降低（P<0.05），且其中RBP 組抑制膠束溶解度能力最強(qiáng)。膳食由來(lái)的游離膽固醇與膽酸鹽復(fù)合成可溶性膠束，透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入肝腸循環(huán)。多數(shù)研究通過(guò)體外膽固醇膠束溶解度試驗(yàn)篩選具有降血脂作用的活性物質(zhì)。包小蘭等[20]以亞麻籽分離蛋白為原料，通過(guò)體外膽固醇膠束溶解度試驗(yàn)制備了具有較高降膽固醇活性的亞麻籽肽。Zhang 等[21]使用不同的蛋白酶制備了米糠蛋白水解物（RBPH），并研究其降低膽固醇膠束溶解度作用。數(shù)據(jù)表明，堿性蛋白酶解產(chǎn)物中的疏水性蛋白能置換膠束溶液中的膽固醇從而顯著降低其溶解性。結(jié)合上述研究結(jié)果，本研究中米糠蛋白疏水性蛋白或體內(nèi)消化后的活性肽等性成分抑制了腸道的膽固醇吸收，促進(jìn)了其糞便中的排泄量。

圖4 稻谷源不同蛋白對(duì)膠束溶解性的影響（n=4）Fig.4 Effects of different proteins from rice on cholesterol micellar solubility（n=4）

2.6 ?；悄懰峤Y(jié)合能力測(cè)定

由圖5 可知，在體外模擬人體胃腸消化道環(huán)境中，米糠蛋白組在不同濃度10、20、40、60、80、100 mg/mL 水平分別高度顯著或者極顯著高于相對(duì)應(yīng)的酪蛋白組（P<0.01 或P<0.001），且結(jié)合程度隨加入量的增加而增加。由此推測(cè)，米糠蛋白可以通過(guò)與膽汁酸的結(jié)合作用減少脂肪在胃腸內(nèi)的消化吸收，具有一定的降脂功能。

圖5 米糠蛋白對(duì)牛黃膽酸結(jié)合能力的影響（n=3）Fig.5 Effects of rice bran protein on taurocholic acid-binding capacity（n=3）

3 討論與結(jié)論

膽固醇是膽汁酸、類(lèi)固醇類(lèi)激素和VD 合成的底物，也是細(xì)胞膜的重要組成部分，但血清膽固醇水平過(guò)高又會(huì)引起許多疾病。許多研究表明，多種植物源蛋白質(zhì)具有改善脂質(zhì)代謝的作用。Anderson 等[22]指出每天攝取25 g 大豆蛋白會(huì)分別降低血清LDLC、TC 及其TG 水平。也有研究表明，連續(xù)5 周每天攝取20 g 大豆蛋白會(huì)有效降低高危中年男性的缺血性心臟病風(fēng)險(xiǎn)[23]。Elisa 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，含有38.1%蛋白質(zhì)的米糠酶分解產(chǎn)物可顯著降低大鼠血清膽固醇水平。但是在該研究中因米糠蛋白或水解產(chǎn)物含量較低而無(wú)法明確其改善膽固醇代謝作用及其機(jī)制。本研究中將各組高脂飼料的蛋白含量統(tǒng)一化，即酪蛋白組添加量20%、米糠蛋白組（15%酪蛋白+5%米糠蛋白）、糙米蛋白組（15%酪蛋白+5%糙米蛋白）大米蛋白組（15%酪蛋白+5%大米蛋白），觀(guān)察比較高膽固醇飲食模式下米糠蛋白、大米蛋白和糙米蛋白對(duì)大鼠脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，與大米蛋白和糙米蛋白相比較米糠蛋白可改善大鼠脂質(zhì)代謝，顯著降低血清膽固醇水平，促進(jìn)膽汁酸的排泄量。

膽汁酸是肝臟內(nèi)膽固醇衍生產(chǎn)物，經(jīng)分泌進(jìn)入動(dòng)態(tài)平衡的膽汁酸池，再經(jīng)盲腸末端被重吸收從而進(jìn)入腸肝循環(huán)。許多研究顯示，一些食品成分能與膽汁酸結(jié)合，抑制膽固醇膠束溶解度，將膽汁酸排出體外，促使膽固醇不斷轉(zhuǎn)化為膽汁酸以維持膽汁酸池的動(dòng)態(tài)平衡，從而降低血液中膽固醇含量，起到降血脂的效果[25?26]。

因此在研究中利用體外模擬人體胃腸消化道環(huán)境試驗(yàn)，測(cè)定了米糠蛋白及其他蛋白源對(duì)膽固醇膠束溶解度抑制率和膽汁酸結(jié)合能力。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了米糠蛋白同等濃度（10 mg/mL）的其他蛋白質(zhì)（酪蛋白、糙米蛋白、大米蛋白）均無(wú)顯著結(jié)合牛磺膽酸的能力。為了更好地解釋米糠蛋白能顯著抑制膽固醇膠束溶解度機(jī)理，本試驗(yàn)只選擇了梯度濃度米糠蛋白，測(cè)定其結(jié)合?；悄懰岬哪芰Α?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，米糠蛋白能顯著降低膽固醇膠束溶解度(P<0.05)，與牛磺膽酸也有顯著的結(jié)合能力(P<0.05)。結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果和體外試驗(yàn)結(jié)果，能充分說(shuō)明米糠蛋白在體內(nèi)與膽汁酸相結(jié)合，抑制其在腸道的吸收，增加其糞便中的排泄量，最后達(dá)到降血脂的作用。

本論文中使用高脂模型大鼠，研究了高純度米糠蛋白對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控的相關(guān)研究，從體內(nèi)外水平闡釋了其降血脂作用，為未來(lái)以米糠蛋白為原料，研發(fā)功能性食品的可行性提供了科學(xué)依據(jù)。今后應(yīng)更深層探究米糠蛋白在體內(nèi)消化、吸收后對(duì)膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。