陳彥君，劉家宏，張 翔，崔敬愛，陳曉平

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

飲食結(jié)構(gòu)和人體健康有著非常緊密的聯(lián)系，高血糖、高血脂、結(jié)直腸癌等各類由于飲食結(jié)構(gòu)不合理導(dǎo)致的疾病也隨之而來，代謝綜合征的患病率在世界范圍內(nèi)急劇增加并達(dá)到流行水平[1]?？剐缘矸郏≧esistant starch，RS）作為一種來源廣泛、口感良好的新興食品原料，具有飽腹感強(qiáng)、消化率低、血糖生成指數(shù)低等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[2?3]。RS的性質(zhì)與溶解性纖維相似，可發(fā)揮出膳食纖維的功效，可降低由糖尿病和心血管等高脂飲食相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對高血脂癥、高血壓和糖尿病患者具有非常積極的作用[4?6]。研究證實(shí)，RS 不僅可以降低總膽固醇、甘油三酯等的含量，對腸道微生物菌群及腸道上皮細(xì)胞更具有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用[7?8]。短鏈脂肪酸是厭氧微生物在腸道內(nèi)發(fā)酵分解抗消化多糖、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)生成的代謝產(chǎn)物[9]。Akbaryan 等[10]發(fā)現(xiàn)，RS 進(jìn)入大腸后能夠促進(jìn)有益微生物代謝，使腸道中有益微生物發(fā)酵RS 與腸道代謝產(chǎn)物被吸收利用，從而有效降低2 型糖尿病、結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，可預(yù)防和緩解一些由于不健康飲食所引起的慢性疾病[11]。白建江等[12]的研究結(jié)果表明，高抗性淀粉稻米可較明顯地降低2 型糖尿病大鼠血糖的作用和糖耐量的提高，有明顯改善2 型糖尿病大鼠脂代謝紊亂和降脂的作用。目前，國內(nèi)外對RS的研究多為香蕉、鷹嘴豆、蓮子等單一品種，對于復(fù)合性抗性淀粉研究較少，本文將綠豆、苦蕎、藜麥混合后制成復(fù)合RS。

本文探究了復(fù)合RS 對高糖高脂小鼠體質(zhì)量、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL-C）、肝糖原及腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）等指標(biāo)的影響，為多元復(fù)合RS 作為高血糖癥、高血脂癥人群的膳食主料提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級(jí)雄性C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2019-0008） 60 只，4 周齡，體質(zhì)量在18～22 g 之間，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，喂養(yǎng)期間，動(dòng)物室內(nèi)設(shè)置12 h 光暗交替循環(huán)，小鼠可自由獲取飲食和隨意飲水，維持動(dòng)物室內(nèi)溫度在21～25 ℃之間，濕度50%～70%，飼養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室[13]；高糖高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料52.5%、豬油10%、膽固醇2%、蔗糖30%、蛋黃粉5%、膽酸鹽0.5%[14]；二甲雙胍 上海施貴寶藥廠；氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甘油 范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司；正己酸、硫酸 北京化工廠；無水乙醚 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；三諾安穩(wěn)血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司；總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白試劑盒、肝糖原試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

三諾安穩(wěn)血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司；H01-B 電子天平 廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；GRM-1 磨粉機(jī) 天津市秦斯特儀器有限公司；TL80-2高速離心機(jī) 江蘇天力醫(yī)療器械有限公司；GC-2010型氣相色譜 日本島津公司；MK-X 潔凈動(dòng)物培養(yǎng)箱 上海堃擇實(shí)業(yè)有限公司；Systec V-75 立式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多元復(fù)合RS 制備 綠豆、苦蕎、藜麥，市售。磨粉處理，過篩100 目，綠豆粉、苦蕎粉和藜麥粉以1:1:1 比例充分混勻[15]。壓熱方法制取抗性淀粉，121 ℃下壓熱反應(yīng)30 min 冷卻至室溫后，加入0.2%α-淀粉酶，在70 ℃恒溫水浴鍋中水解1 h，冷卻至室溫。添加0.4%普魯蘭酶，恒溫60 ℃下酶解12 h 后取出，100 ℃滅菌10 min，冷卻至室溫。在4 ℃冰箱中冷藏24 h，60 ℃烘干至恒重粉碎過100 目篩，制得多元復(fù)合RS，得率為27.3%。

1.2.2 高糖高脂模型小鼠的建立及分組 將60 只小鼠隨機(jī)成6 組，每組10 只，分為正常對照組、模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組和陽性對照組。在基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)下使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 周后，模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組、陽性對照組小鼠進(jìn)行自由飲食，進(jìn)入8 周高糖高脂小鼠模型實(shí)驗(yàn)。8 周后，模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組和陽性對照組小鼠經(jīng)隔夜禁食處理后尾尖取血測空腹血糖，空腹血糖在12.0 mol/L 以上的小鼠可宣布高糖高脂小鼠模型成功[13]。各組小鼠連續(xù)灌胃4 周，各組灌胃試劑及劑量如表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and animal grouping

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 小鼠處理 每周拾取新鮮的小鼠糞便，記錄每只小鼠的體質(zhì)量，尾處尖取血，使用血糖儀測定空腹血糖數(shù)值[17?18]。處死前12 h 小鼠禁食不禁水，解剖前進(jìn)行稱重、測血糖，摘取小鼠眼珠進(jìn)行采血，然后將血樣儲(chǔ)存在4 ℃下干凈的離心管中進(jìn)行3000 r/min、10 min 離心處理，將小鼠腹腔和胸腔打開，將肝臟和結(jié)腸腸道內(nèi)容物保存在甘油中，儲(chǔ)存在?20 ℃冰箱中，用于測量肝糖原含量和SCFAs[19?21]。檢測小鼠血清內(nèi)TC、TG 和HDL-C 糖脂代謝指標(biāo)，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作[22]。

1.2.3.2 短鏈脂肪酸（SCFAs） 取0.2 g 腸道內(nèi)容物，加入0.2 mL 正己酸。并向其中繼續(xù)注入1.6 mL蒸餾水，搖勻，然后添加0.4 mL 50%硫酸和2 mL 無水乙醚。然后將這一些取得液體在振蕩器上于120～160 r/min 混合30 min?；旌虾?，加入無水氯化鈣，然后以3000 r/min的速率離心5 min。最后，取上清液用于氣相檢測。SCFA的測定使用外標(biāo)方法繪制乙酸、丙酸和丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。氫火焰探測器（FID）；色譜柱為DB-FFAP；載氣為N2，分流比為10:1，流速為2 mL/min；爐溫240 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；初始溫度在120 ℃下持續(xù)5 min，然后以10 ℃/min的溫度升至250 ℃并保持1 min的加熱程序[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS（21）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（），各組小鼠之間的比較采用單因素卡方檢驗(yàn)，P<0.05 為差異性顯著，P<0.01 為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元復(fù)合RS 對小鼠體質(zhì)量的影響

多元復(fù)合RS 對小鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果見表2。如表2 所示，正常對照組小鼠體質(zhì)量漲幅均在正常范圍內(nèi)變化，在4 周小鼠高糖高脂模飲食實(shí)驗(yàn)后，模型對照組小鼠與正常對照組體質(zhì)量有極顯著差異（P<0.01）。4 周多元復(fù)合RS 干預(yù)后，RS 低、RS中、RS 高劑量組體質(zhì)量與模型對照組相比均有一定降低，RS 高劑量組與模型對照組小鼠的體質(zhì)量相比體質(zhì)量下降9.24%，RS 高劑量組小鼠的體質(zhì)量與正常對照組無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明，RS 能有效減緩高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重的快速上升，且其效果與劑量存在依賴關(guān)系。

表2 多元復(fù)合RS 對小鼠體質(zhì)量的影響(g)Table 2 Effect of multiple compound RS on the body weight of mice(g)

2.2 多元復(fù)合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響

多元復(fù)合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響結(jié)果見表3。如表3 所示，72 h 后檢測血糖濃度，各干預(yù)組小鼠血糖值均高于12.0 mmol/L 以上，模型對照組與正常對照組相比差異極顯著（P<0.01），高血糖小鼠造模成功。經(jīng)4 周灌胃后，模型對照組血糖濃度呈持續(xù)增高趨勢；RS 高劑量組與模型對照組相比小鼠血糖濃度極顯著降低（P<0.01），下降了59.71%，且RS 高劑量組與陽性對照組血糖濃度無顯著差異（P>0.05），說明多元復(fù)合RS 可有效控制血糖，RS 高劑量的多元復(fù)合RS 降血糖功能效果更佳。

表3 多元復(fù)合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響(mmol/L)Table 3 Effect of multi compound RS on blood glucose of mice(mmol/L)

2.3 多元復(fù)合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影響

多元復(fù)合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影響結(jié)果見表4。如表4 所示，在為期4 周的實(shí)驗(yàn)過程中，模型對照組小鼠血清TC 和TG 與正常對照組相比有極顯著的升高（P<0.01），HDL-C 極顯著減少（P<0.01）。RS 高劑量組的TC、TG 與模型對照組相比均有極顯著減少（P<0.01），分別下降31.22%、36.72%，RS 中劑量組、RS 高劑量組的效果與陽性對照組相似無顯著差異（P>0.05）。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，多元復(fù)合RS 與陽性藥物二甲雙胍兩者都能有效的減弱高糖高脂小鼠血清TC 和TG 水平。RS 高劑量組與模型對照組相比，RS處理能顯著升高小鼠血清中HDL-C 水平（P<0.01），上升58.93%。實(shí)驗(yàn)表明，多元復(fù)合RS 可以有效控制小鼠血清中TC 和TG 含量，可提升小鼠血清中的HDL 水平。

表4 多元復(fù)合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C 含量的影響Table 4 Effect of multi-component RS on the serum contents of TG,TC,and HDL-C in mouse

2.4 多元復(fù)合RS 對小鼠肝糖原含量的影響

多元復(fù)合RS 對小鼠肝糖原含量的影響結(jié)果見表5。

表5 多元復(fù)合RS 對小鼠肝糖原含量的影響Table 5 Effect of multiple compound RS on hepatic glycogen in mice

體內(nèi)的肝糖原代謝調(diào)節(jié)血糖水平，飯后或糖分?jǐn)z入后為了降低血糖水平，攝入過多的葡萄糖可進(jìn)入肝臟以肝糖原的狀態(tài)儲(chǔ)存起來；當(dāng)體內(nèi)血糖不足時(shí)，肝糖原經(jīng)磷酸化酶催化代謝產(chǎn)生葡萄糖，進(jìn)入血液中維持血糖穩(wěn)定，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。如表5 所示，模型對照組與正常對照組相比肝糖原含量極顯著降低（P<0.01），RS 處理組小鼠肝糖原相比于模型對照組均有升高，其中RS 高劑量組與模型對照組相比肝糖原含量極顯著升高207.86%（P<0.01）。經(jīng)4 周的多元復(fù)合RS 誘導(dǎo)后，RS 高劑量組的肝糖原含量與陽性對照組無顯著差異（P>0.05）。說明多元復(fù)合RS 能有效提高小鼠體內(nèi)肝糖原濃度，且其效果與劑量存在依賴關(guān)系。

2.5 多元復(fù)合RS 對小鼠結(jié)腸SCFAs的影響

2.5.1 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中乙酸的影響 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中乙酸的影響結(jié)果見圖1。

圖1 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中乙酸的影響Fig.1 The effect of multiple compound RS on acetic acid in colon

如圖1 所示，在4 周干預(yù)中，多元復(fù)合RS 灌胃小鼠結(jié)腸中乙酸含量顯著高于正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結(jié)腸中乙酸濃度，模型對照組與RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組乙酸濃度增長較為明顯。干預(yù)灌胃初期，各組增長變化較為緩慢，干預(yù)4 周時(shí)，RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組結(jié)腸中乙酸的含量與模型對照組相比均有顯著升高，RS 高劑量組的小鼠結(jié)腸中乙酸濃度高于其他各組，說明一定劑量的多元復(fù)合RS 可有效促進(jìn)小鼠腸道厭氧菌群代謝產(chǎn)生乙酸。

2.5.2 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中丙酸的影響 多元復(fù)合RS 對小鼠結(jié)腸中丙酸含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 多元復(fù)合RS 對小鼠結(jié)腸中丙酸含量的影響Fig.2 Effect of multiple compound RS on propionic acid contents in colon of mice

如圖2 所示，隨著干預(yù)時(shí)間增加，多元復(fù)合RS 灌胃的小鼠結(jié)腸中丙酸濃度均有不同程度的上升,多元復(fù)合RS 灌胃的小鼠結(jié)腸中丙酸濃度明顯超過了正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結(jié)腸中丙酸濃度。在2 周干預(yù)后RS 高劑量組與RS 中劑量組小鼠結(jié)腸中的丙酸濃度明顯高于RS 低劑量組，在4 周時(shí)RS 高劑量組與RS 低劑量組、RS 中劑量組相比丙酸含量顯著升高。說明一定劑量的多元復(fù)合RS 可有效促進(jìn)小鼠腸道代謝產(chǎn)生丙酸。

2.5.3 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中丁酸的影響 多元復(fù)合RS 對結(jié)腸中丁酸的影響結(jié)果見圖3。

圖3 多元復(fù)合RS 對小鼠結(jié)腸中丁酸含量的影響Fig.3 Effect of multiple compound RS on butyric acid contents in colon of mice

如圖3 所示，隨著干預(yù)時(shí)間增加，多元復(fù)合RS 灌胃的小鼠結(jié)腸中丁酸濃度均有不同程度的上升,多元復(fù)合RS 灌胃的小鼠結(jié)腸中丙丁酸濃度明顯超過了正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結(jié)腸中丁酸濃度。各組多元復(fù)合RS 小鼠在干預(yù)后，各組中丁酸濃度以較快的速度增長，在干預(yù)2 周后RS 高劑量組與RS 中劑量組小鼠結(jié)腸中丁酸濃度明顯高于RS 低劑量組，在4 周時(shí)RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組的丁酸濃度與模型對照組的丁酸濃度差異顯著。一定劑量的多元復(fù)合RS 可有效促進(jìn)小鼠腸道代謝產(chǎn)生丁酸。

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，RS 對體質(zhì)量和血糖水平具有調(diào)節(jié)作用，因其具有抗消化的特點(diǎn)，RS 可明顯降低空腹和餐后血糖，增加胰島素敏感性，起到控制干預(yù)糖尿病病情的作用[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)灌胃4 周后多元復(fù)合RS 能有效控制由于高糖高脂飲食引起的小鼠的體重異常，一定劑量的多元復(fù)合RS 具有與陽性藥物二甲雙胍相當(dāng)?shù)慕档透咛歉咧Ｐ托∈蟛秃笱堑淖饔?，可有效調(diào)節(jié)血糖值。有研究表明RS 具有調(diào)節(jié)血脂的作用[25]，多元復(fù)合RS 能降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂質(zhì)代謝異常高糖高脂小鼠血脂水平，對脂代謝紊亂進(jìn)行糾正，對高糖高脂小鼠具有一定的調(diào)節(jié)血脂作用。2 型糖尿病患者肝組織的肝葡萄糖輸出量異常和胰島素抵制作用，RS 可以在肝糖原修復(fù)中發(fā)揮作用，人體機(jī)體對于胰島素含量的敏感程度通過肝臟組織糖原含量的變化可有效反映[26?27]。經(jīng)多元復(fù)合RS 灌胃的小鼠肝糖原含量均有明顯增加，推測多元復(fù)合RS 能有效促進(jìn)肝糖原的合成或降低肝糖原的分解速率，有效地改善肝功能。RS 促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸濃度升高可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)酸堿度降低，積極促進(jìn)有益菌的生成，減少腸道腐敗菌的數(shù)量，腸道菌群達(dá)到平衡的狀態(tài)，并且對維持機(jī)體生命活動(dòng)的能量輸送和調(diào)控具有重要作用，產(chǎn)生的SCFAs 能在短期內(nèi)降低肝葡萄糖的產(chǎn)量從而減少輸出[28?29]。楊玥熹等[30]、賈彥等[31]的研究表明，RS 可促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸的合成，提高結(jié)腸中SCFAs的含量。多元復(fù)合RS 由三種原料谷物混合提取而成，存在多種膳食纖維與微量元素，三種原料之間是否有協(xié)同促進(jìn)作用及其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，以綠豆、苦蕎、藜麥三種谷物為原料制得的多元復(fù)合RS，能有效地控制高糖高脂模型小鼠的體質(zhì)量增長，有效調(diào)節(jié)小鼠血糖水平，促進(jìn)肝糖原合成；多元復(fù)合RS 可調(diào)節(jié)小鼠血脂濃度，降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂質(zhì)代謝紊亂，預(yù)防高血脂癥；多元復(fù)合RS 可積極促進(jìn)腸道內(nèi)菌群發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs，有助于腸道中SCFAs的代謝，促進(jìn)小鼠腸道中發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸含量，調(diào)節(jié)腸道菌群。對研究開發(fā)高糖高脂不良飲食習(xí)慣人群相關(guān)功能保健食品的適用性提供了參考依據(jù)。