黎海靈，黃艷萍,，周 游，陳旭冰, ，徐 金，周 濃,,

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120）

?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥根皮稱為桑白皮，其藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是瀉白散、華蓋散、桑白皮湯等古代經(jīng)典名方的重要組成藥味[1]。2020 版《中國(guó)藥典》一部記載桑白皮味甘、寒，歸肺經(jīng)，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少，面目肌膚浮腫等功效[2?3]。?？浦参镫u桑（Morus australisPoir.）或華桑（Morus cathayanaHemsl.）的干燥根皮稱為崖桑皮，其入藥與桑白皮具有相似的功效，作為川渝民用藥材被2010 版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載[4]。桑白皮因具有降血脂[5?7]、鎮(zhèn)痛抗炎[8?9]、抗癌保肝[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]等藥理作用，于2002 年被列入衛(wèi)生部發(fā)布的保健食品類中藥名單中[12]。同時(shí)，桑白皮還常被用于制作具有一定保健功能的藥膳食用，例如麻黃連翹桑白皮湯、桑白皮粥、南杏桑白皮豬肺湯等[13?14]。因此，桑白皮在疾病康復(fù)和日常食補(bǔ)中發(fā)揮著重要作用。

雞桑、華桑和桑皮中研究較多的為黃酮類[15?16]、茋類[17]、生物堿類[18?19]、植物甾醇類[20?21]、香豆素類和多糖類[22?23]等活性成分，但對(duì)其含有的核苷類成分鮮有報(bào)道。核苷是一類由含氮堿基與糖縮合而成的糖苷，是構(gòu)成生命體DNA 和RNA的基本物質(zhì)，具有抗腫瘤[24?25]、抗菌[26?28]、抗血小板聚集[29?30]、免疫調(diào)節(jié)[31?33]等多種功效，這與桑皮的生物活性具有一定的關(guān)聯(lián)性，可為其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。目前關(guān)于不同產(chǎn)地雞桑、華桑和桑的核苷類成分比較研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用HPLC 法測(cè)定雞桑、華桑和桑的根皮中7 種核苷類成分的含量，并采用聚類分析和主成分分析法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較雞桑、華桑和?；瘜W(xué)成分的差異，探究三種桑的質(zhì)量等同性，以期為雞桑、華桑代替桑使用，解決桑白皮基源單一的狀況提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑、雞桑、華桑 2018 年10 月采集于重慶市相關(guān)區(qū)縣，對(duì)照藥材購(gòu)自相關(guān)中藥材市場(chǎng)及公司，共58 批（表1），經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為桑科植物雞桑（Morus australisPoir.）、華桑（Morus cathayanaHemsl.）和桑（Morus albaL.）的根皮；腺嘌呤、腺苷（批號(hào)分別為：110886-200001、110879-200202，純度均≥98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；胞苷、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、尿嘧啶、2'-脫氧腺苷（批號(hào)分別為：PHA0053、PHA0024、PHA0064、PHA0060、PHA0071，純度均≥98%） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；甲醇 色譜純，德國(guó)默克公司；水娃哈哈純凈水。

表1 不同產(chǎn)地的樣品信息Table 1 The information of samples from different origins

LC-20AT 型高效液相色譜儀 日本島津集團(tuán)；SB-5200DTN 型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TDZ5-WS 型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ML204 型分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DZF-6050MBE 型電熱恒溫真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CP225D 型分析天平 德國(guó)Sartorius 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 選擇自秋末葉落時(shí)至次春發(fā)芽前采挖的根部，刮去黃棕色粗皮，縱向剖開(kāi)，剝?nèi)〉玫礁2,4]。因同一采收期不同植株的含量有所差異，實(shí)驗(yàn)采用不同居群?jiǎn)沃瓴蓸右詼p少實(shí)驗(yàn)誤差。將精選樹(shù)齡相近的桑、雞桑、華桑的根皮洗凈后置于45 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎過(guò)三號(hào)篩，密封儲(chǔ)存于4 ℃，用于品質(zhì)分析。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品胞苷、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷，加水溶解，配制成濃度分別為0.007、0.061、0.018、0.033、0.042、0.006、0.017 mg/mL的對(duì)照品混合溶液。用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末0.500 g，置具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，混勻，在室溫條件下超聲（300 W，40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量后，以4000 r/min 離心10 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得[34]。

1.2.4 色譜條件 Venusil MP C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫程序如下表2 所示。檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 線性關(guān)系考察 取1.2.2 對(duì)照品溶液制備液，按一定梯度稀釋后在1.2.4 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液，按1.2.4 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積。

1.3.3 重復(fù)性考察 取樣品粉末0.500 g，平行6 份，按1.2.3 項(xiàng)下的提取方法制備供試品溶液，按

1.2.4 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分峰面積。

1.3.4 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 按1.2.4 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分峰面積。

1.3.5 加樣回收率考察 取6 份0.250 g 樣品粉末，加混合對(duì)照品適量，按1.2.3 項(xiàng)下的提取方法制備供試品溶液，按1.2.4 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的液相色譜測(cè)定結(jié)果

按照上述色譜條件對(duì)7 種核苷成分進(jìn)行分析，對(duì)照品、樣品色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明各成分分離度較好，符合分析要求。

圖1 對(duì)照品（A）、華桑（B）、雞桑（C）和桑（D）的HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrums of references (A)，Morus cathayana(B),Morus australis (C) and Morus alba (D)

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察 測(cè)得7 種核苷的線性方程及其線性范圍，如表3 所示。結(jié)果表明，7 種核苷的濃度與峰面積成線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好。

表3 7 種核苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Table 3 Standard curves and linear ranges of 7 nucleosides

2.2.2 方法學(xué)其他項(xiàng)考察結(jié)果 由表4 可知，胞苷、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率的RSD 均小于3%，且加樣回收率在97.49%～101.45%之間，表明制備與檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好，符合要求。

表4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察結(jié)果（RSD%）Table 4 Precision,repeatability,stability and recovery (RSD%)

2.3 樣品中7 種核苷的含量

按1.2.3 項(xiàng)下方法制備雞桑、華桑和桑樣品共58 批的供試品溶液，平行3 份。在1.2.4 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算雞桑、華桑和桑皮根皮中7 種核苷類成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，所有樣品均檢測(cè)到了7 種單體核苷成分。雞桑與華桑中胞苷含量范圍在0.016～0.270 mg/g，次黃嘌呤含量范圍在0.009～0.945 mg/g，鳥(niǎo)苷含量范圍在0.039～0.325 mg/g，腺嘌呤含量范圍在0.015～0.377 mg/g，尿嘧啶含量范圍在0.059～0.429 mg/g，腺苷含量范圍在0.016～0.311 mg/g，2'-脫氧腺苷含量范圍在0.003～0.327 mg/g。桑白皮中胞苷含量范圍在0.030～0.196 mg/g，次黃嘌呤含量范圍在0.032～0.324 mg/g，鳥(niǎo)苷含量范圍在0.067～0.353 mg/g，腺嘌呤含量范圍在0.073～0.370 mg/g，尿嘧啶含量范圍在0.066～0.322 mg/g，腺苷含量范圍在0.046～0.262 mg/g，2'-脫氧腺苷含量范圍在0.025～0.162 mg/g。雞桑與華桑的胞苷、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷的含量略低桑。從整體上看，雞桑與華桑中核苷成分略低于桑；相同采集地點(diǎn)不同居群雞桑、華桑和桑的根皮中核苷類含量具有差異，可能是由于生長(zhǎng)地域、自然條件、栽培管理等不同引起次生代謝成分組成和含量的變化[35]。

表5 樣品中7 種核苷類的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

表5 樣品中7 種核苷類的含量（，n=3，mg/g）Table 5 Contents of 7 nucleosides in the sample（,n=3,mg/g）

續(xù)表 5

2.4 兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)

兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)是對(duì)兩個(gè)樣本均值檢驗(yàn)，比較兩樣本中各成分含量的差異性。以雞桑和華桑樣本為一類，以桑樣本為另一類，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩類樣本的7 種核苷類含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，如表6 所示。7 種單體核苷均具有方差相等（P1>0.05），（P2>0.05），表明以雞桑和華桑制成的崖桑皮在核苷類成分層面與以桑制成的桑白皮無(wú)顯著性差異，崖桑皮可代替桑白皮藥用以緩解桑皮供應(yīng)不足的問(wèn)題。

表6 獨(dú)立樣品t 檢驗(yàn)Table 6 The results of t-test

2.5 主成分分析

主成分分析是利用降維的思想，在損失很少信息的前提下把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)的多元統(tǒng)計(jì)方法[36]。利用SPSS.22.0 對(duì)58 批樣品中7 種核苷成分進(jìn)行KMO 和Bartelett 球形度檢驗(yàn)，結(jié)果顯示KMO 統(tǒng)計(jì)量=0.640，Bartelett 球形度檢驗(yàn)卡方統(tǒng)計(jì)量=141.452，自由度=21，P<0.001，表明數(shù)據(jù)適合做主成分分析。通過(guò)對(duì)58 批樣品的單體核苷含量進(jìn)行主成分分析，并提取了2 個(gè)主成分（特征值>1）進(jìn)行分析，如表7 所示。主成分1的特征值為2.758，特征貢獻(xiàn)率為39.401%；主成分2的特征值為1.673，特征貢獻(xiàn)率為23.902%，2 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為63.303%。由表7 可知，主成分1 主要反映了鳥(niǎo)苷、尿嘧啶成分的主要信息；主成分2 主要反映了2'-脫氧腺苷成分的主要信息。對(duì)提取的主成分進(jìn)行主成分得分計(jì)算（得分系數(shù)Z標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)）以及排序。計(jì)算公式：

表7 樣品主成分陣距Table 7 Principal component matrix of samples

如表8 所示，對(duì)主成分1 來(lái)說(shuō)，樣品Y4的得分最高；對(duì)主成分2 來(lái)說(shuō)，樣品Y4的得分最高；綜合得分最高的是樣品Y4，說(shuō)明樣品Y4的鳥(niǎo)苷、尿嘧啶和2'-脫氧腺苷的含量較多，起到了主導(dǎo)的作用。根據(jù)2 個(gè)主成分的得分，并繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖2。如圖，可將58 批樣品分成4 組。其中，樣品Y4 為第1 組；樣品Y1、Y26、Y28、Y38 為第2 組；樣品S5、S6、S10、Y19、Y20、Y21 為第3 組，其余的47 組樣品均聚在一起，可看成一大組，即為第4 組。說(shuō)明主成分分析未能將崖桑皮與桑白皮區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖2 樣品主成分散點(diǎn)圖Fig.2 Principal component scatter charts of samples

表8 樣品主成分得分、綜合得分及其排序Table 8 Scores of principal components,comprehensive scores and ranking for samples

2.6 聚類分析

聚類分析是一種可將一組數(shù)據(jù)按照本身內(nèi)在的規(guī)律較合理地分為幾類的探索性的分類方法[33]。利用SPSS 22.0 對(duì)58 批樣品采用Euclidean 法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)歐氏距離為10.0 時(shí)，58 批樣品可被分為4 大類：第Ⅰ類：Y4；第Ⅱ類：Y34、Y36；第Ⅲ類：S10、Y38；第Ⅳ類：剩余的樣品。

圖3 樣品的聚類分析Fig.3 Results of cluster analysis of all samples

其中，第Ⅰ類與上述主成分分析中的第1 組相對(duì)應(yīng)；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類與2、3、4 組相對(duì)應(yīng)。雖然有些類別和組別相互交叉，但聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致。綜上所述，核苷含量相近或相同的崖桑皮與桑白皮在主成分和聚類分析中多距離較近，雞桑、華桑和桑以核苷類成分為指標(biāo)的層面存在交叉，表明各產(chǎn)地的雞桑、華桑的核苷類成分含量與桑無(wú)明顯差別。

3 結(jié)論

本文對(duì)雞桑、華桑和桑的根皮中7 種核苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，58 批樣品中均含有胞苷、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、2'-脫氧腺苷這7 種核苷，說(shuō)明雞桑、華桑和桑的根皮中的核苷類成分較為相似。對(duì)58 批樣品進(jìn)行主成分分析和聚類分析，結(jié)果表明不同基源桑屬根皮的核苷含量有所不同，桑中7 種核苷的含量略高于雞桑和華桑。與桑白皮標(biāo)準(zhǔn)藥材相比，桑中的7 種成分含量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)藥材桑白皮中7 種單體核苷的含量(P<0.05)，說(shuō)明采集的桑樣品符合藥用指標(biāo)。雞桑、華桑根皮中的7 種單體核苷含量基本高于標(biāo)準(zhǔn)藥材崖桑皮中7 種核苷的含量。雞桑、華桑和桑的根皮中7 種單體核苷含量雖略有不同，但是區(qū)別不明顯，它們屬于同屬不同種植物，基源相近，根皮的化學(xué)成分較為相似。

整體上來(lái)說(shuō)，桑的根皮較其他雞桑和華桑的根皮品質(zhì)較好。但它們之間具有相同的活性成分，以華桑與雞桑來(lái)源的崖桑皮藥材中7 種單體核苷的含量和組成均無(wú)明顯差異(P>0.05)，其核苷類成分具有一定的等同性，建議臨床應(yīng)用中應(yīng)擴(kuò)大對(duì)雞桑和華桑的使用，以期崖桑皮代替桑白皮使用，解決桑白皮基源單一的狀況。