張?jiān)萍t，彭云娉，盧春霞,2, ，黃 巧，嚴(yán)慧娟，魏 雪，任江濤

（1.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2.蘇州賽飛福德檢測科技有限公司，江蘇蘇州 215100；3.重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 408100）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）隸屬于葡萄球菌屬，為革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，在適當(dāng)?shù)臈l件下（20～37 ℃）可產(chǎn)生腸毒素（Staphylococcal enterotoxins,SEs），引起食物中毒[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國和美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量占病原菌引起的食源性疾病的前五位[2?3]，對公共健康和食品安全帶來巨大威脅。我國食品中金黃色葡萄球菌總體污染現(xiàn)狀不容樂觀，常污染肉和肉制品、乳和乳制品、禽蛋類制品、熟食制品等[4]，目前，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 29921-2013規(guī)定食品中金黃色葡萄球菌的可接受水平限量值為100 CFU/g（mL）、最高安全限量為1000 CFU/g（mL）[5]。因此，發(fā)展簡便經(jīng)濟(jì)的的金黃色葡萄球菌快速檢測方法是保障食品質(zhì)量安全的重要技術(shù)手段。

目前，金黃色葡萄球菌的鑒定和檢測方法主要有以下三種：（1）傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法：該法為金黃色葡萄球菌鑒定和檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]，但操作步驟復(fù)雜，耗時(shí)較長（3～5 d），無法滿足快速檢測及批量樣品初篩的需要。（2）分子生物學(xué)檢測技術(shù)：主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)等[7?8]，PCR 方法靈敏度高，但需要昂貴的精密儀器和專業(yè)的技術(shù)人員，無法在基層推廣應(yīng)用。（3）免疫學(xué)分析技術(shù)：該技術(shù)是目前檢測金黃色葡萄球菌及腸毒素最為常用的快速檢測技術(shù)，具有檢測快速、操作簡便等優(yōu)勢[9?10]。但其識別分子為抗體，抗體的制備需要免疫動物，存在周期長、成本高、抗體易受環(huán)境影響等不足?；诖耍怂徇m配體作為一種新型識別分子進(jìn)入研究者的視野，并逐漸成為研究熱點(diǎn)。

核酸適配體（Aptamer）是采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫中篩選獲得的可與靶標(biāo)高特異性結(jié)合的一段單鏈核苷酸。其空間結(jié)構(gòu)的多樣性可與多種靶標(biāo)如細(xì)胞因子[11]、蛋白[12]、金屬離子[13]、小分子物質(zhì)[14]、細(xì)胞[15]、微生物[16]等相結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有制備簡單、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定、應(yīng)用范圍廣、易于標(biāo)記和保存等優(yōu)點(diǎn)。因此，適配體作為一種新型識別分子在分析領(lǐng)域成為人們研究的焦點(diǎn)[17]。近些年，研究者們利用SELEX 技術(shù)已篩選多條金黃色葡萄球菌適配體[18?19]，并利用篩選出的適配體建立了多種快速檢測方法[20?21]。如Duan 等[20]將適配體固定在磁珠表面作為捕獲探針，以適配體功能化的雙色上轉(zhuǎn)換納米材料為檢測探針，構(gòu)建了一種可同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的新方法，該方法對兩種食源性致病菌具有寬的線性范圍（101～105CFU/mL）和低的檢測限（8、5 CFU/mL）。Abbaspour 等[21]充分結(jié)合電化學(xué)傳感器和核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種基于雙適配體夾心的電化學(xué)傳感檢測方法，實(shí)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的定性及定量檢測。

在諸多的快速檢測技術(shù)中，試紙條層析技術(shù)具有操作簡單、快速、低成本、肉眼可見結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于批量樣品初篩和現(xiàn)場檢測[22?23]。但目前很少見到基于適配體識別的金黃色葡萄球菌試紙條的研究報(bào)道。為此，本研究將膠體金層析技術(shù)的簡便、快速和適配體的高親和力、低成本等優(yōu)勢充分結(jié)合，構(gòu)建一種簡便、經(jīng)濟(jì)、快速的金黃色葡萄球菌適配體試紙條。與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比，具有識別分子易制備、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為食源性致病菌的快速檢測提供了新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19155、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）O157:H7 ATCC25922、阪崎腸桿菌（Bntorobater sakazakii）ATCC29544、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae） 重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所提供；氯金酸（純度>99%） Sigma-Aldrich公司；吐溫-20、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris（2-chloroethyl）phosphate,TCEP）、三磷酸脫氧腺苷（dATP）、鏈霉親和素、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、曲拉通X-100（Triton-100）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）、蔗糖、瓊脂糖 生物工程（上海）股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（≥18.2 MΩ·cm）；玻璃纖維膜（8906）、硝酸纖維素膜（CN140）、吸水紙（H-1）、PVC 底板（J-B6） 上海捷寧生物科技有限公司；畜禽肉、乳制品和涼拌菜食品 本地超市；金黃色葡萄菌核酸適配體[18]由生物工程（上海）股份有限公司合成。

FEI Tecnai G2 F20 場發(fā)射透射電子顯微鏡 美國FEI 公司；HM3030/HM3035 XYZ 三維劃膜噴金儀、ZQ4200 數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī) 上海金標(biāo)生物科技有限公司；UV-2800 紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；5424R 臺式冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司；MS3 basic 渦旋混合器 德國IKA 公司；Gel Doc XR System 凝膠成像系統(tǒng)、Powerpac 300電泳儀 美國BIO-RAD 公司；BSD-100 振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 適配體和探針序列及修飾 巰基修飾的適配體1（SH-apt 1）：5’-SH-C6-TCCCTACGGCGCTAACC CCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA CCGTGCTACAAC-3’；生物素修飾的適配體2（Bioapt 2）：5’-Bio-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAAC CGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTA CAAC-3’；適配體1 互補(bǔ)DNA：5’-Bio-GTTGTAGCA CGGTGGCGGTGTGAGGCTGGGAGGACGGACTG GGGGGGTTAGCGCCGTAGGGA -3’。

1.2.2 納米金的制備與表征 根據(jù)檸檬酸鈉還原法[24]制備納米金顆粒（Goldnanoparticles,GNPs），將100 mL 0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰，持續(xù)2 min，迅速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，直到溶液變成透亮的酒紅色，繼續(xù)加熱10 min，停止加熱，冷卻至室溫，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將納米金溶液在400～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，獲取金溶液的紫外-可見光光譜，測定納米金的最大吸收波長[25]。納米金顆粒的尺寸和形貌采用透射電鏡表征，將制備的金溶液超聲分散均勻后，滴在渡有碳膜的通網(wǎng)上，50 ℃干燥12 h，置于透射電鏡樣品臺，在100 kV 電壓下觀察金顆粒的形貌和粒徑[25]。

1.2.3 納米金-適配體1（GNPs-apt 1）偶聯(lián)物的制備與表征 參考文獻(xiàn)方法[26]將巰基修飾的適配體1 通過Au-SH 共價(jià)方式結(jié)合到納米金表面。首先取1 mL 納米金溶液，用0.1 mmol/L K2CO3調(diào)pH 至7.4，10000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去900 μL 上清，獲得濃縮的納米金溶液。加入適配體1 溶液，使其最終濃度為1 μmol/L，加入2 μL TCEP 溶液（1 mmol/L）中，常溫避光活化1 h，加入上述納米金溶液中，常溫下偶聯(lián)反應(yīng)2 h。然后加入9 μL dATP 溶液（100 μmol/L），室溫反應(yīng)1 h。封閉結(jié)束后，加入NaCl 溶液，使其終濃度達(dá)到80 mmol/L，老化30 min，置于4 ℃繼續(xù)老化過夜。將偶聯(lián)物于10000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清，用100 μL 重懸液復(fù)溶（20 mmol/L Tris-HCl（pH8.5），5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，1% BSA），4 ℃保存?zhèn)溆?。將上述制備的納米金-適配體1 偶聯(lián)物及適配體1 用4%的瓊脂糖凝膠電泳表征，電壓120 V，電泳時(shí)間40 min。

1.2.4 試紙條的制備 玻璃纖維膜的處理：將玻璃纖維膜裁成2.0 cm 和0.5 cm 寬的條狀，在處理液（0.1 mol/L Tris-HCl 溶液，1% NaCl，0.5% Tween-20，1% BSA，2%蔗糖，1% Triton X-100）中浸泡2 h，37 ℃烘箱中烘干，分別作為樣品墊和結(jié)合墊，用點(diǎn)膜噴金儀將GNPs-apt 1 復(fù)合物以20 μL/cm2的速率噴涂到結(jié)合墊上，25 ℃烘箱烘干備用。

T、C 線的制備：分別將生物素修飾的適配體2（Bio-apt2）或生物素修飾的互補(bǔ)DNA 與鏈霉親和素按摩爾比4:1 混合，即得到捕獲探針和質(zhì)控探針。利用點(diǎn)膜噴金儀將捕獲探針和質(zhì)控探針噴到硝酸纖維膜（NC 膜）上，分別作為檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C 線），25 ℃烘箱中烘干備用。

試紙條的組裝：將處理好的樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜和吸水墊依次黏貼于PVC 底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2 mm，T 線與C 線間隔距離為7 mm，用切條機(jī)切成4 mm 寬的試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試紙條性能測定

1.3.1 可視化檢測限 將金黃色葡萄球菌用無菌SELEX 篩選緩沖液[18]（40 mmol/L Hepes（pH8.0）,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,2 mmol/L MgCl2,150 mmol/L NaCl）進(jìn)行梯度稀釋，同時(shí)以SELEX 緩沖液設(shè)陰性對照，將制備好的試紙條插入200 μL 待測溶液中，5 min 后觀察結(jié)果，將T 線完全消失前的菌液濃度定為肉眼可視化檢測限。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 特異性分析 將鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌用無菌SELEX 緩沖液稀釋成5×106CFU/mL的菌液，同時(shí)用SELEX 緩沖液作為陰性對照。將試紙條插入到200 μL的待測菌液中，5 min 后觀察結(jié)果，分析試紙條的特異性。每個實(shí)驗(yàn)3 個重復(fù)。

1.3.3 實(shí)際樣品檢測 參照GB 4789.10-2016 執(zhí)行[6]，稱取25 g（mL）樣品加入到盛有225 mL的7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中，充分均質(zhì)，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，混勻。取50 μL 菌液用SELEX 緩沖液稀釋4 倍，加入到酶標(biāo)板中，將試紙條插入菌液，5 min 后判讀結(jié)果。同時(shí)采用GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[6]進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定三次，使用Origin 8.5 軟件制圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 納米金質(zhì)量鑒定

納米金的大小及形貌對核酸偶聯(lián)效率和檢測靈敏度至關(guān)重要[27?28]，有研究報(bào)道，納米金粒子直徑一般在15～30 nm 比較合適[29]。T 線和C 線的顏色是由納米金顆粒聚集到一定程度時(shí)形成肉眼可見的信號，若GNPs 粒徑過小，產(chǎn)生的顏色較淡，影響試紙條靈敏度；粒徑過大，位阻效應(yīng)也相應(yīng)增大，影響其在NC 膜上的流動性。從圖1a 中可以看出，本研究制備的納米金溶液呈晶瑩透亮的酒紅色，紫外光譜分析顯示，金溶液最大吸收峰波長為520 nm，為納米金的特征吸收峰。透射電鏡表征結(jié)果顯示（圖1b），GNPs形貌為球型，粒徑較為均一（約20 nm），分散性良好。

圖1 納米金紫外光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.1 Absorption spectra (a) and TEM images (b) of the synthesized GNPs

2.2 納米金-適配體偶聯(lián)物的表征

本研究采用4%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證巰基化的適配體1 是否成功修飾到納米金表面，如圖2 所示，泳道1 為納米金-適配體1 偶聯(lián)物的條帶，泳道2 為巰基化的金黃色葡萄球菌適配體1，可以看出納米金-適配體1 偶聯(lián)物的遷移率比適配體1 遲緩較多，因?yàn)榻痤w粒標(biāo)記核酸適配體后，分子量增大，遷移速率變慢。綜合以上，可初步判斷巰基化的適配體1 成功偶聯(lián)到納米金表面。

圖2 納米金-適配體1 和適配體1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The agarose electrophoresis of the GNPs-aptamer 1 and aptamer 1

2.3 適配體試紙條檢測原理

所構(gòu)建的適配體試紙條檢測原理如圖3 所示。當(dāng)樣品中有金黃色葡萄球菌時(shí)，目標(biāo)菌和結(jié)合墊上包被的納米金-適配體1 特異性結(jié)合，隨著毛細(xì)管作用遷移到硝酸纖維素膜上，目標(biāo)菌與T 線上包被的生物素化適配體2 結(jié)合，形成適配體1-目標(biāo)菌-適配體2 夾心結(jié)構(gòu)，納米金在T 線沉積顯色。納米金-適配體1 繼續(xù)層析至質(zhì)控線（C 線），納米金表面的適配體1 與C 線上的生物素化互補(bǔ)DNA 結(jié)合，納米金沉積使C 線顯色。如果樣品中無目標(biāo)菌，納米金-適配體1 在T 線上不富集顯色，繼續(xù)層析遷移與C 線上的互補(bǔ)DNA 發(fā)生結(jié)合，C 線顯色。

圖3 基于適配體試紙條檢測金黃色葡萄球菌原理圖Fig.3 Schematic illustration of aptamer-based lateral flow strip for detection of S.aureus

2.4 試紙條制備和檢測條件優(yōu)化

2.4.1 NaCl 濃度的確定 在納米金-適配體偶聯(lián)物制備過程中，加入適當(dāng)濃度的鹽溶液“老化”處理，對提高適配體在納米金表面的偶聯(lián)效率至關(guān)重要[29]。本研究加入過量適配體（2 μmol/L），對照組不添加適配體，分別將實(shí)驗(yàn)組及對照組加入NaCl 溶液，使其終濃度分別20、40、60、80、100 mmol/L，然后采用目測法確定NaCl 濃度。結(jié)果如圖4 所示，當(dāng)NaCl濃度增加至80 mmol/L 時(shí)，對照組納米金沉淀聚集，顏色變藍(lán)，而實(shí)驗(yàn)組由于適配體覆蓋在納米體金表面，保護(hù)納米金不團(tuán)聚，納米金溶液仍保持紅色。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇NaCl 濃度為80 mmol/L。

圖4 NaCl 濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of NaCl concentration by visual inspection

2.4.2 最小適配體偶聯(lián)濃度的確定 在納米金-適配體偶聯(lián)物制備中，合適的適配體濃度對提高金溶液穩(wěn)定性和檢測靈敏度較為重要。如適配體濃度過低，當(dāng)體系中有NaCl 存在時(shí)，適配體對納米金起不到足夠的保護(hù)作用，金溶液不穩(wěn)定易沉聚變藍(lán)，另外，若納米金表面偶聯(lián)的適配體較少，特異性結(jié)合靶標(biāo)的數(shù)量也相應(yīng)較少，進(jìn)而影響檢測靈敏度。本實(shí)驗(yàn)采用目測法確定納米金標(biāo)記最佳適配體濃度，分別向金溶液中加入不同濃度的適配體，室溫孵育5 min 后加入NaCl溶液（終濃度80 mmol/L），選擇金溶液仍保持紅色的最小適配體濃度即為納米金標(biāo)記最小適配體用量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，當(dāng)適配體終濃度小于1 μmol/L時(shí)，金顆粒聚集變藍(lán)，此時(shí)的適配體濃度不足以穩(wěn)定納米金溶液；當(dāng)適配體終濃度≥1 μmol/L 時(shí)，膠體金溶液保持紅色，表明此時(shí)納米金-適配體體系較為穩(wěn)定。因此，選擇1 μmol/L 為穩(wěn)定納米金溶液的最小適配體濃度。

圖5 適配體濃度優(yōu)化Fig.5 The optimum of aptamer concentration by visual inspection

2.4.3 納米金-適配體1 及捕獲探針包被量的確定納米金-適配體1（GNPs-apt 1）包被量對試紙條檢測信號有較大影響[24]，包被量過多易導(dǎo)致背景信號提高，包被量太少，在高濃度的待測靶標(biāo)條件下很容易飽和，導(dǎo)致T 線上的信號強(qiáng)度降低，影響檢測靈敏度。本研究固定T 線捕獲探針濃度為50 μmol/L，將GNPs-apt 1分別按1:1、1:2、1:4、1:6 體積比稀釋，固定同等體積噴于結(jié)合墊上，檢測5×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌。結(jié)果如圖6a 所示，隨著納米金-適配體1 濃度的降低，試紙條T 線顯色逐漸變?nèi)?，?dāng)稀釋倍數(shù)為1:4 時(shí)，檢測信號明顯變?nèi)?。因此，結(jié)合墊上GNPs-apt 1的稀釋比例選擇1:2。

圖6 納米金-適配體1（a）和捕獲探針（b）包被濃度對T 線顯色的影響Fig.6 Visual colorc hanges at the test lines with different concentrations of GNPs-aptamer 1 and capture probe

T 線上的捕獲探針（鏈霉親和素-生物素化適配體2）包被濃度影響與GNPs-apt 1的結(jié)合比例，最終影響試紙條的檢測靈敏度。捕獲探針包被濃度低，T 線顯色不清晰，濃度高時(shí)易出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象。本研究將捕獲探 針分別稀釋 50、25、12.5、6.25、3.12 μmol/L，固定同等體積噴于硝酸纖維素膜上，檢測濃度為5×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌，比較T 線顯色效果。從圖6b 中可以看出，當(dāng)捕獲探針濃度小于25 μmol/L 時(shí)，T 線顯色明顯減弱，因此，捕獲探針包被濃度選擇25 μmol/L。

2.4.4 樣品溶液對試紙條檢測性能的影響 樣品溶液的pH 和離子成分對適配體與目標(biāo)物的結(jié)合有顯著影響，因此最佳的運(yùn)行緩沖液對試紙條檢測性能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)分別采用SELEX 篩選緩沖液[18]、10 mmol/L PBS 緩沖液（8 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，1.44 g Na2HPO，pH7.4）、Tris 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2、120 mmol/L NaCl、0.1% Tween-20,1% PEG 20000,2% 蔗糖，pH8.5）和無菌生理鹽水稀釋金黃色葡萄球菌，考察不同樣品溶液對檢測性能的影響。結(jié)果如圖7 所示，選擇SELEX 緩沖液作為樣品檢測溶液時(shí)，試紙條T 線顯色信號最強(qiáng)，這可能與該適配體篩選時(shí)使用的緩沖液一致有關(guān)。有研究證明，改變適配體稀釋溶液及離子強(qiáng)度可能影響適配體的三維折疊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響靶標(biāo)與適配體的識別及相互作用[30]。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SELEX 緩沖液作為樣品檢測溶液。

圖7 樣品溶液對適配體試紙條檢測性能的影響Fig.7 The influence of sample solution on the detection performance of aptamer-based lateral flow strip

2.5 試紙條檢測性能評估

2.5.1 可視化檢測限 采用同一批次試紙條檢測不同濃度的金黃色葡萄球菌ATCC6538，觀察T 線顯色信號，確定試紙條肉眼可視化檢測限。結(jié)果如圖8所示，隨著金黃色葡萄球菌濃度的降低，試紙條上的檢測信號逐漸減弱。當(dāng)濃度為2×102CFU/mL 時(shí)，檢測線肉眼完全不可見。因此，該適配體試紙條對金黃色葡萄球菌的裸眼可視化檢測限為2×103CFU/mL。

圖8 適配體試紙條靈敏度分析Fig.8 Sensitivity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.2 試紙條特異性 采用本研究構(gòu)建的試紙條分別檢測相同濃度（5×106CFU/mL）的金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌O157:H7 ATCC25922、單增李斯特菌ATCC19155、阪崎腸桿菌ATCC29544、痢疾志賀氏菌，以確定適配體試紙條的特異性，結(jié)果如圖9 所示，試紙條對兩株金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果為陽性，其他食源性致病菌的檢測結(jié)果為陰性，表明該試紙條具有優(yōu)良的特異性。

圖9 適配體試紙條特異性分析Fig.9 Specificity analysis of the aptamer-based lateral flow strip

2.5.3 實(shí)際樣品檢測 為驗(yàn)證本試紙條的實(shí)用性和可行性，本實(shí)驗(yàn)選取畜禽肉、乳制品、涼拌菜等116個食品樣品，分別采用國標(biāo)法[6]和本方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明（表1），本方法檢測結(jié)果與國標(biāo)方法完全一致，肉制品和涼拌菜樣品中金黃色葡萄球菌的檢出率均為3.85%和3.33%。以上結(jié)果表明，該方法操作簡單、檢測快速、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于批量樣品中金黃色葡萄球菌的快速定性檢測，在食品安全快速檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。

表1 本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果對比Table 1 Comparison of detection results of the proposed method and the GB sandard method

3 結(jié)論

以核酸適配體為特異性識別分子，代替抗體構(gòu)建了一種基于雙適配體夾心模式的層析試紙條，在優(yōu)化條件下（NaCl 濃度為80 mmol/L、適配體偶聯(lián)濃度為1 μmol/L、結(jié)合墊上納米金-適配體的稀釋體積比為1:2、捕獲探針濃度為25 μmol/L），該試紙條對金黃色葡萄球菌的可視化檢測限為2×103CFU/mL，檢測時(shí)間為5 min，在實(shí)際樣品檢測中，檢測結(jié)果與國標(biāo)方法完全一致。與傳統(tǒng)的免疫膠體金試紙條相比，本方法識別分子可人工合成，故成本可大大降低。與基于適配體的其他快速檢測方法相比[20?21]，本方法不需制備納米材料和對適配體過多的功能化修飾，不需要特殊的專業(yè)設(shè)備。本方法具有操作簡單、檢測結(jié)果直觀、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，為批量樣品初篩和食品安全監(jiān)管提供了新的技術(shù)支撐。