郝俊光，柯 鋒，梁振榮，張 龍，戴梓茹, ，施紹穎，羅 丹，李官連

（1.欽州市食品風味分析與調(diào)控重點實驗室，北部灣大學食品工程學院，廣西欽州 535011；2.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司，廣西河池 546400）

白酒有機酸按物理性質(zhì)可以分成三類：C1～C6的揮發(fā)性脂肪酸、C7～C22的不揮發(fā)脂肪酸和熱不穩(wěn)定酸（如琥珀酸、草酸、檸檬酸等多元酸）[1]。有機酸的組成和含量不僅影響白酒發(fā)酵過程微生物的生長與繁殖[2?4]，也影響酯類香氣物質(zhì)的合成[4?5]。作為成品酒的重要呈味物質(zhì)，有機酸還能起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量高低及相互比例直接影響著白酒的風味、質(zhì)量[4?5]以及飲后舒適度[6?7]。

米香型白酒是中國四大基本白酒香型之一，以大米為原料、小曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)米飯固態(tài)培菌糖化、加水半液態(tài)發(fā)酵以及蒸餾而成[8]。隨著產(chǎn)業(yè)設備技術的發(fā)展以及白酒消費習慣的改變，以效率提升、風味優(yōu)化為目的的米香型白酒的現(xiàn)代化和低度化生產(chǎn)成為歷史的必然[9?11]。目前，米香型白酒在市場上呈現(xiàn)風味多樣化，不同工廠的風味物質(zhì)分布差異非常大[12]。關于米香型白酒有機酸的產(chǎn)生與分布的報道較少[13?14]，有待進一步細化研究。有機酸的定量一直是白酒風味物質(zhì)研究的重點和熱點之一。目前，可以檢測白酒有機酸的方法有氣相法[15]、氣質(zhì)法[16?17]、離子色譜法[18?20]、液質(zhì)法[21]、液相法[22?24]等。氣相直接檢測技術適用于揮發(fā)性高的脂肪酸檢測[15]，但不適合熱不穩(wěn)定酸（如乳酸）的檢測。氣相（質(zhì)）衍生技術可以實現(xiàn)乳酸等熱不穩(wěn)定酸的檢測，但操作繁瑣[16?17]。陰離子交換色譜法可實現(xiàn)白酒短、中鏈揮發(fā)酸和包括乳酸在內(nèi)的難揮發(fā)酸的同時檢測，但儀器專用、購置成本高[18?20]。高分辨液相質(zhì)譜可實現(xiàn)白酒中多種微量有機酸的檢測，但儀器和檢測成本昂貴[21]。液相色譜法成本相對較低，在白酒有機酸的檢測中應用較多，已實現(xiàn)了對乙酸、乳酸及其它熱不穩(wěn)定酸的檢測[22?24]，但尚未見其對白酒短鏈脂肪酸檢測的報道[25?26]。

鑒于短鏈脂肪酸的重要性[6?7]，以及液相色譜因價格比離子交換色譜、氣相質(zhì)譜、液相質(zhì)譜便宜而在工廠中更為普及的事實，本研究將利用液相色譜開發(fā)一種能實現(xiàn)短鏈脂肪酸和熱不穩(wěn)定脂肪酸同時檢測的技術，并對米香型白酒的發(fā)酵過程進行跟蹤，以期為米香型白酒生產(chǎn)提供有機酸品控的實用性手段，明確其發(fā)酵過程中不同有機酸的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米香型白酒發(fā)酵醪、小曲（糖化力34 g/100 g，發(fā)酵力37%vol） 廣西天龍泉酒業(yè)有限公司；晚稻大米廣西河池市售；葡萄糖酸溶液（純度51%）、甲醇、磷酸、乙酸、KH2PO4、草酸、L-蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、L-酒石酸、奎尼酸、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、異戊酸、抗壞血酸、L-乳酸 色譜純，上海麥克林生化科技有限公司。

Alliance 高效液相色譜儀（配備2695HPLC 分離單元、2996PDA 檢測器、Empower 工作站） 美國Waters 儀器公司；DK-98-II 電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；INNOVA 43R 落地式低溫搖床 上海巴玖實業(yè)有限公司；H1850 高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ME204E 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cascada I 實驗室超純水系統(tǒng) 美國Pall 公司；0.22 μm SLGP 033RB針頭濾膜 美國Millipore 公司；PHS-3E 雷磁pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；白酒生產(chǎn)中試線（配備100 kg 蒸飯鍋一套、300 L 控溫發(fā)酵罐5 個） 廣西天龍泉酒業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定性標準溶液的配制 稱取適量化合物，配制成草酸100 mg/L、L-酒石酸800 mg/L、葡萄糖酸5000 mg/L、奎尼酸150 mg/L、甲酸200 mg/L、丙酮酸40 mg/L、L-蘋果酸400 mg/L、抗壞血酸60 mg/L、L-乳酸400 mg/L、乙酸5000 mg/L、檸檬酸200 mg/L、富馬酸6 mg/L、琥珀酸400 mg/L、丙酸400 mg/L、異丁酸400 mg/L、正丁酸400 mg/L、戊酸400 mg/L、異戊酸400 mg/L的單標，用于不同有機酸保留時間和峰形的確定。上述單標溶液等體積混合后用于色譜條件的優(yōu)化，不同色譜條件下色譜峰的辨識基于峰形、強度和出峰順序。

1.2.2 色譜的基本操作條件 色譜柱：Waters Atlantis?T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：甲醇溶液；流動相B：KH2PO4緩沖液（0.02 mol/L，pH2.6）；洗脫方式：線性梯度；流速變化方式：恒速；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。

1.2.3 色譜條件的優(yōu)化和有機酸的定性 在檢測波長、流動相pH 固定的前提下，分別進行了線性洗脫梯度一（見表1），流速分別是0.43、0.40、0.37 mL/min的比對實驗A、B、C，確定出適合的流速。進而在最佳流速條件下，進行梯度二、三（見表1）的比較實驗E、F，以確定分離度高且檢測周期短的優(yōu)化洗脫梯度。在優(yōu)化的色譜條件下，測定每個有機酸的保留時間，完成有機酸的定性。

表1 優(yōu)化過程所采用的三種洗脫梯度Table 1 The comparison of the three eluent gradients adopted in the optimization process

分離度的計算公式為[27]：Rs=2（tR2?tR1）/（Y1+Y2）

式中，Rs是兩個相鄰組分的分離度；tR1、tR2和Y1、Y2分別為兩組分的保留時間和峰寬。

1.2.4 混合標準儲備液的配制 稱取各種標準品適量，用KH2PO4緩沖液溶解并定容至100 mL 容量瓶，得到濃度為草酸500 mg/L、L-酒石酸4000 mg/L、葡萄糖酸25000 mg/L、奎尼酸750 mg/L、甲酸100 mg/L、丙酮酸200 mg/L、L-蘋果酸2000 mg/L、抗壞血酸300 mg/L、L-乳酸2000 mg/L、乙酸20000 mg/L、檸檬酸1000 mg/L、富馬酸30 mg/L、琥珀酸2000 mg/L、丙酸2000 mg/L、異丁酸2000 mg/L、正丁酸2000 mg/L、戊酸2000 mg/L、異戊酸2000 mg/L的混合標準儲備液，4 ℃保存。

1.2.5 標準曲線的建立與樣品定量 分別吸取2.5、5、10、20、40 mL 混合標準儲備液于100 mL 容量瓶中，用KH2PO4緩沖液定容，得到5 個混合標樣的濃度梯度。在優(yōu)化的條件下對濃度梯度1～5 由低到高進行檢測，將峰面積（y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線。將液相測出樣品的不同有機酸的峰面積帶入各自的標準曲線，即可實現(xiàn)樣品中有機酸定量。

1.2.6 定量方法的方法學評估 把最低濃度標準溶液逐步稀釋檢測，取信噪比等于S/N 3 和10 時對應分析物的濃度作為檢出限和定量限。向米香型白酒9 d 發(fā)酵液的5 倍稀釋液中加入等體積的梯度4 混合標準溶液，平行測定6 次，計算出相應組分的加標回收率和相對標準偏差。

1.2.7 米香型白酒的發(fā)酵和取樣 米香型白酒的發(fā)酵工藝路線為：大米→淘洗→蒸飯→冷卻→加曲糖化→加水入罐→發(fā)酵。操作要點為：

a、蒸飯

將100 kg 大米置于不銹鋼桶中浸泡2 h，倒入蒸飯機中預煮45 min，然后開蓋邊攪拌邊加入適量的水，進行第2 次蒸煮33 min，再次開蓋攪拌加水（米飯水分控制在64%～66%），進行第3 次蒸煮25 min，出鍋攤晾，降溫至33 ℃，下曲1 kg，轉(zhuǎn)入糖化槽進行糖化。

b、糖化

室溫糖化24 h，期間每8 h 翻拌一次，加入重量比120%的水混合均勻，用泵抽入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。

c、發(fā)酵

發(fā)酵12 d，前6 d 發(fā)酵溫度控制在27～29 ℃，此為主發(fā)酵期，后6 d 控制在21～22 ℃，此為后發(fā)酵期。

d、取樣與檢測

共進行3 次發(fā)酵實驗，分別取每批實驗的第0、3、6、9、12 d的醪液進行有機酸、總酸的檢測；分別取每批實驗的第0、1、2、3、6、9、12 d的樣品進行有酒精度、pH的檢測。

1.2.8 有機酸的檢測 將所取樣品以8000 r/min 離心15 min，然后經(jīng)0.22 μm 針頭微孔濾膜過濾至樣品瓶。在優(yōu)化的色譜條件下檢測，進樣量：10 μL，外標法定量，每個樣品檢測三次。

1.2.9 酒精度、總酸、pH的檢測 參照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》的密度瓶法測定酒精度、電位滴定法測定總酸、pH 計法測定pH，結果分別以酒精的體積占比（% V/V）、以乙酸計的濃度（g/L）、pH 值表示，每個樣品檢測三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以三次實驗的九個檢測數(shù)據(jù)的平均值±標準偏差形式表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究是在利用Waters Atlantis?T3 色譜柱測定毛葡萄發(fā)酵液中有機酸的基礎上增加6 種短鏈脂肪酸的檢測方法開發(fā)，其檢測波長210 nm、柱溫箱溫度30 ℃、流動相為“甲醇和KH2PO4緩沖液（0.02 mol/L，pH2.6）”、進樣量10 μL[28]，被直接沿用。由于短鏈脂肪酸的出峰較晚，需采用梯度洗脫縮短檢測周期。

首先采用梯度一（見表1）、流速0.43 mL/min 進行標樣分離（結果見圖1），發(fā)現(xiàn)除奎尼酸（峰4）與甲酸（峰5），異丁酸（峰15）與正丁酸（峰16）分離度略差外，其它有機酸均能有效分離。降低流速可以提高分離度，為此進行了0.40、0.37 mL/min 分離效果的比對實驗，結果見圖2。為提高圖片的可視性，圖2只顯示了6～34 min 時間段的圖譜。經(jīng)比對計算，流速0.43、0.40、0.37 mL/min 對應的奎尼酸與甲酸分離度分別達到1.26、1.51、1.61。鑒于流速0.40 mL/min條件下二者達到了完全分離（分離度≥1.50）[27]，且較0.37 mL/min的檢測周期短，故確定0.40 mL/min為優(yōu)化的洗脫流速。

圖1 18 種有機酸標樣在流速0.43 mL/min的HPLC 色譜圖Fig.1 Chromatograms of 18 organic acid standards at eluent velocity of 0.43 mL/min

圖2 18 種有機酸標樣在不同流速下的HPLC 色譜圖Fig.2 Chromatograms of 18 organic acid standards at three eluent velocities

在梯度一、流速0.40 mL/min的洗脫條件下，異丁酸與正丁酸的分離度已達到1.39，能較好地實現(xiàn)定性、定量?？紤]到最后出峰的異戊酸在此條件下保留時間已達到63 min，且流動相重新回到下一個測定起始狀態(tài)需要較長的平衡時間，不再進行降低洗脫強度提高分離度的實驗，而是進行為縮短檢測周期而降低洗脫強度的梯度二、梯度三比對試驗。洗脫液中有機相甲醇比例增加時，會減弱有機酸疏水端與固定相的作用，縮短保留時間[26]，但流動相甲醇比例過高、梯度改變速率過快時會導致磷酸鹽析出而造成色譜柱堵塞[26]，因而梯度洗脫終點設為42%且梯度變化較緩慢。三種梯度條件下，四種酸的分離情況見圖3。梯度一、二、三所對應的異丁酸與正丁酸的分離度分別為1.39、1.13、1.28，異戊酸的保留時間分別為63.02、61.73、62.69 min，可以看出梯度改變對檢測周期縮短作用不大，卻會明顯降低分離效果，因而仍選取梯度一作為優(yōu)化的洗脫梯度。

圖3 18 種有機酸標樣在三個洗脫梯度下的HPLC 色譜圖Fig.3 Chromatograms of 18 organic acid standards at three eluent gradients

2.2 有機酸的定性

在優(yōu)化的條件下確定每個有機酸的保留時間，實現(xiàn)了18 種有機酸的定性（見圖4）。除異丁酸與正丁酸的分離度為1.39 未達到完全分離外，其它相鄰有機酸的分離均實現(xiàn)完全分離[27]。

圖4 優(yōu)化條件下18 種混合標準品的HPLC 譜圖Fig.4 Chromatograms of 18 organic acid standards under optimum condition

2.3 標準曲線建立及方法的評價

在優(yōu)化的條件下對5 個混合標準梯度進行檢測，將峰面積（y）和濃度（x）進行強制過原點的線性擬合，建立標準曲線，進行方法評價。標準曲線及其線性范圍與R2、檢出限、定量限、加標回收率、標準偏差的結果見表2。結果顯示，該方法的線性范圍較寬，標準曲線R2為0.9891～0.9999；檢出限0.084～0.941 mg/L，定量限0.280～3.138 mg/L，加標回收率93.03%～107.21%，相對標準偏差<3.70%，說明該方法線性良好，精密度和準確度高，可用于米香型白酒發(fā)酵液、米酒的檢測。

表2 有機酸組分的保留時間、線性范圍、標準曲線、相關系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率、標準偏差Table 2 Retention time,linear range,regression equation,correlation coefficient,limit of detection,limit of quantitation,recovery,RSD of organic acids by HPLC

2.4 米香型白酒發(fā)酵過程有機酸、pH、酒精度、總酸的變化

2.4.1 米香型白酒發(fā)酵過程有機酸的變化 米香型白酒發(fā)酵液中有機酸變化見圖5。主要有機酸的變化趨勢不一樣：檸檬酸和富馬酸呈現(xiàn)主酵明顯下降，而后酵趨于平穩(wěn)的趨勢；L-蘋果酸、丙酮酸、奎尼酸呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但峰值出現(xiàn)時間各不相同，前期上升可能與主酵期間酵母代謝活躍有關[3]，而L-蘋果酸的后期下降或與蘋乳發(fā)酵有關[29]；葡萄糖酸、琥珀酸、L-乳酸、異戊酸在發(fā)酵過程中一直呈上升趨勢，可能與釀酒酵母在主酵、耐酒精的產(chǎn)酸菌在后酵都容易產(chǎn)生此類酸有關[3,10,17]；乙酸、草酸和正丁酸在發(fā)酵前期變化不大、后期增加明顯，可能與釀酒酵母不易產(chǎn)生此類酸而耐酒精的產(chǎn)酸菌在后酵容易產(chǎn)生此類酸有關[3,17,30]；正戊酸在前9 d的發(fā)酵液中均未檢出，只在第12 d 發(fā)酵液中有檢出。不同發(fā)酵時間醪液的有機酸圖譜不相同，說明與發(fā)酵溫度、曲種、料水比一樣，發(fā)酵時間也是影響米香型白酒有機酸組成的一個關鍵工藝參數(shù)。

圖5 發(fā)酵過程18 種有機酸的變化情況Fig.5 The changes of 18 organic acids during fermentation

12 d 發(fā)酵是米香型白酒的常用工藝，故對12 d醪液的有機酸組成進行詳細的分析。12 d 發(fā)酵液的總有機酸含量為24505 mg/L，各有機酸濃度按由大到小的順序依次是：L-乳酸>乙酸>異丁酸>異戊酸>琥珀酸>葡萄糖酸>正丁酸>奎尼酸>丙酸>檸檬酸>甲酸>正戊酸>L-酒石酸>草酸>L-蘋果酸>丙酮酸>富馬酸>抗壞血酸。其中，占總有機酸比例達10%以上的有5 種，分別是L-乳酸（占19.76%）、乙酸（占15.64%）、異丁酸（占15.47%）、異戊酸（占14.28%）、琥珀酸（占13.30%）。與初始醪液相比，12 d 醪液中只有檸檬酸、L-蘋果酸、富馬酸的含量出現(xiàn)降低，降幅分別達到54.51%、64.34%、46.93%；其它有機酸均增加，增幅達100%以上的有機酸按由大到小的順序依次是葡萄糖酸（73.10 倍）、乙酸（38.64 倍）、奎尼酸（17.87 倍）、正丁酸（4.89 倍）、琥珀酸（3.88 倍）、甲酸（3.28 倍）、異丁酸（2.67 倍）、L-乳酸（1.85 倍）、丙酮酸（1.57 倍）、丙酸（1.56 倍）、異戊酸（1.22 倍）。

2.4.2 米香型白酒發(fā)酵過程中總酸、pH、酒精度、總有機酸的變化 發(fā)酵過程中醪液的pH、酒精度見圖6。酒精度在主酵期間增加明顯，前3 d 就達到最終酒精度的91.8%。pH 在整個發(fā)酵過程中呈下降趨勢，表明發(fā)酵過程游離氫離子在一直增加，且后酵也有較多的游離酸性物質(zhì)產(chǎn)生；12 d 醪液的pH 較初始醪液降低了10.58%。

圖6 發(fā)酵過程pH、酒精度的變化Fig.6 Change of pH,alcohol by volume during fermentation

總酸、總有機酸的變化見圖7?？偹岷涂傆袡C酸在發(fā)酵過程中一直呈上升趨勢，12 d 醪液的總酸和總有機酸較初始醪液分別增加了2.42 倍和1.95 倍。后酵發(fā)酵液中酒精度高而對應的總酸和總有機酸呈增加趨勢，可能與發(fā)酵液中有源自釀酒小曲的耐酒精的乙酸菌、乳酸菌等存在有關[29?30]。

圖7 發(fā)酵過程總酸、總有機酸的變化Fig.7 Change of total acidity and total organic acid during fermentation

3 結論

利用反相高效液相-紫外二極管陣列法建立了米香型白酒中包括短鏈脂肪酸在內(nèi)的18 種有機酸的定量分析方法。該方法線性好（R2>0.989）、定量限低（0.280～3.138 mg/L）、加標回收率高（93.03%～107.21%）、精密度好（<3.70%）。方法可同時準確定量測定揮發(fā)性短鏈脂肪酸和熱不穩(wěn)定多元羧酸的檢測方法，為米香型白酒的品質(zhì)控制提供了一個有效手段，也為果酒果醋發(fā)酵液等有機酸的檢測提供了一個潛在的方法。米香型白酒發(fā)酵過程中，pH、總酸、總有機酸的變化趨勢相對應，且12 d 醪液總有機酸占總酸的70%，說明本方法所監(jiān)測到的有機酸覆蓋了發(fā)酵液酸性物質(zhì)的絕大部分。不同有機酸隨時間的變化規(guī)律不同。12 d 醪液總酸和總有機酸較初始醪液分別提高了2.42 倍和1.95 倍，說明米香型白酒的發(fā)酵過程是一個明顯的增酸過程。L-乳酸、乙酸、異丁酸、異戊酸、琥珀酸在12 d 發(fā)酵醪中含量占比大于10%，為米香型白酒發(fā)酵液中含量高的5 種主要有機酸。乙酸、L-乳酸、異丁酸、異戊酸在發(fā)酵后期增加明顯，可能與后酵有能耐受高酒精度的產(chǎn)酸菌存在有關。不同發(fā)酵進程對應的有機酸分布差異較大，暗示著在其它參數(shù)一定的情況下選擇合適的發(fā)酵終止時間是控制米香型白酒有機酸組成的一個有效工藝手段。