尚凡貞，劉瑞玲 ，吳偉杰，陳杭君，孟祥紅，郜海燕

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310021）

獼猴桃（Actinidia chinensis），又稱陽桃、奇異果等，我國是其原生中心，因其獨(dú)特的風(fēng)味和極高的營養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者喜愛[1]。獼猴桃果實(shí)多汁，富含維生素C，同時(shí)含有多種氨基酸、有機(jī)酸及礦物質(zhì)元素[2?4]。另外，其含有的多酚、多糖和三萜類物質(zhì)，具有抗炎、抗衰老等功能性作用[5]，因此獼猴桃具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。然而獼猴桃皮薄多汁，又采收于高溫季節(jié)，采后易軟化腐爛，嚴(yán)重影響了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。獼猴桃果脯、果酒等精加工產(chǎn)品不但拓寬了其開發(fā)利用空間，還可延長相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈。

傳統(tǒng)工藝所生產(chǎn)的果脯主要為高糖果脯，其甜度高，色澤鮮亮，飽滿透明度高，初期受到消費(fèi)者的廣泛喜愛。但是隨著生活水平逐漸改善，傳統(tǒng)產(chǎn)品由于含糖量較高，讓大多數(shù)向往營養(yǎng)健康的年輕人及中老年人望而卻步。另外，傳統(tǒng)產(chǎn)品還存在含硫高、果香味不足等問題，由此近年來低糖、無糖果脯產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，相對傳統(tǒng)產(chǎn)品含糖量大大降低，但由于果脯滲糖難度增大，滲糖量減少等問題，導(dǎo)致產(chǎn)品飽滿度、透明度等感官品質(zhì)降低，貯藏性下降[7]。因此，開發(fā)出甜度低、感官品質(zhì)良好且營養(yǎng)價(jià)值更高的無糖果脯是必然的發(fā)展趨勢。

益生菌是為宿主健康提供益處的活性微生物，它們通過維持和改善腸道介質(zhì)的微生物平衡來實(shí)現(xiàn)這一功能特性[8]。研究表明益生菌對胃腸道感染、降血壓和降低血清膽固醇水平、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、穩(wěn)定腸道粘膜屏障系統(tǒng)、抗突變和抗癌等方面均有改善促進(jìn)作用，同時(shí)其在改善便秘、腸炎、呼吸道炎癥以及泌尿生殖器感染也有十分重要的作用[9?10]。然而，市場上大部分益生菌均不耐高溫，應(yīng)用于果脯等產(chǎn)品加工烘烤過程中存活率極低。有研究提出凝結(jié)芽孢桿菌屬于高溫益生菌，被鑒定為公認(rèn)安全（Generally recognized as safe，GRAS）[11]，可于混合粉末、烘烤、微波等加工過程中存活，且無需冷藏。而且其可在胃酸和膽鹽的條件下存活，順利進(jìn)入腸道保障菌群吸收，發(fā)揮促進(jìn)腸道蠕動、調(diào)節(jié)菌群平衡等作用。

本實(shí)驗(yàn)以徐香獼猴桃為原料，添加凝結(jié)芽孢桿菌等益生菌粉，通過優(yōu)化微波-超聲波協(xié)同滲糖方式探究無糖益生菌獼猴桃脯的最優(yōu)工藝條件，并結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對比分析所得獼猴桃脯的營養(yǎng)品質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味，以期為無糖獼猴桃脯的加工及綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃 江山市塘源口鄉(xiāng)神農(nóng)獼猴桃專業(yè)合作社；木糖醇、羧甲基纖維素鈉（CMC）、果膠、DL-蘋果酸 浙江一諾生物科技有限公司；經(jīng)典益生菌型酸奶粉 安琪酵母股份有限公司；凝結(jié)芽孢桿菌碧琪生物科技（上海）有限公司；硫酸、無水乙醇、乙酸乙酯、福林酚、無水碳酸鈉、磷酸、茚三酮 分析純，上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司；蒽酮、鄰二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、奎寧酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

DGG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；EM7KCG4-NR 微波爐廣東美的廚房電器制造有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機(jī) 上海劍凌信息科技有限公司；UV-9000 紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝設(shè)計(jì) 益生菌有多種功能性作用，凝結(jié)芽孢桿菌為耐高溫益生菌，活菌數(shù)可達(dá)109，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)對比，添加益生菌粉增加無糖獼猴桃脯營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)并不會降低產(chǎn)品感官品質(zhì)。且有研究表明益生菌粉的加入會使果干等產(chǎn)品風(fēng)味更濃郁[12]。本研究以裹衣的形式在無糖獼猴桃脯中添加益生菌粉。工藝流程[13]如下：

獼猴桃→清洗→去皮→切片→預(yù)處理→護(hù)色→硬化→劃縫→滲糖→瀝干→裹衣→干燥→冷卻→整形→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料選擇 選擇肉質(zhì)堅(jiān)實(shí)、大小均一，無機(jī)械損傷、霉變病害，八成熟左右的新鮮徐香獼猴桃為原料。

1.2.2.2 切片與預(yù)處理 將挑選后清洗干凈的獼猴桃瀝干去皮，切成厚度為8～10 mm的薄片，于?18 ℃冰箱中冷凍果片2 h 后室溫緩慢解凍，使其果實(shí)內(nèi)部的自由水形成冰晶，破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)以形成大量的空隙和通道，提高滲糖率。

1.2.2.3 護(hù)色與硬化 將緩慢解凍后的獼猴桃放入檸檬酸（0.4%）和抗壞血酸（0.2%）的混合溶液中，護(hù)色處理2 h 后置于配制好的氯化鈣（0.1%）溶液中，硬化處理1.5 h，洗凈后瀝干待用。

1.2.2.4 滲糖處理 將硬化后劃好縫的獼猴桃放入糖液中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用糖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，其中糖液含有0.16%的多糖賦形劑（CMC:果膠=1:1），使用單一微波輔助滲糖、單一超聲輔助滲糖和微波-超聲波協(xié)同輔助滲糖三種滲糖方式，根據(jù)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化分析確定滲糖條件如下。微波組：在30%火力下微波滲糖45 min；超聲組：在超聲波功率為160 W，頻率為40 kHz的條件下滲糖3 h，實(shí)時(shí)監(jiān)測水溫控制在40 ℃以下；協(xié)同組：首先進(jìn)行微波輔助滲糖35 min，之后超聲波輔助滲糖1.25 h，其中微波與超聲波設(shè)置條件與前兩組保持一致。

1.2.2.5 裹衣與干燥整形 滲糖后瀝干獼猴桃片表面糖液，置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，保持55 ℃溫度烘干10 h，均勻噴灑配制好的益生菌調(diào)味粉（木糖醇:酸奶粉:DL-蘋果酸:凝結(jié)芽孢桿菌=4:2:0.1:0.1），之后75 ℃繼續(xù)烘干至水分含量為20%左右時(shí)取出，期間進(jìn)行2 次翻面并同時(shí)整形，使其干燥均勻。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 單一微波滲糖時(shí)間的影響 在木糖醇添加量28%、賦形劑CMC:果膠配比1:1、復(fù)合添加量0.16%的條件下，考察單一微波滲糖時(shí)間（15、25、35、45、55 min）對獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)的影響。

1.2.3.2 單一超聲滲糖時(shí)間的影響 在木糖醇添加量28%、賦形劑CMC:果膠配比1:1、復(fù)合添加量0.16%的條件下，考察單一超聲滲糖時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)的影響。

1.2.3.3 單一滲糖與協(xié)同滲糖方式對比 在木糖醇添加量28%、賦形劑CMC:果膠配比1:1、復(fù)合添加量0.16%的條件下，對比分析單一微波滲糖45 min、單一超聲滲糖4 h、微波滲糖35 min 協(xié)同超聲滲糖1、2 h的獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)得分。

1.2.3.4 多糖賦形劑配比的影響 在木糖醇添加量28%、賦形劑復(fù)合添加量0.16%、微波滲糖35 min-超聲滲糖1.5 h的條件下，考察多糖賦形劑CMC:果膠配比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）對獼猴桃脯飽滿指數(shù)的影響。

1.2.3.5 賦形劑復(fù)合添加量的影響 在木糖醇添加量28%、賦形劑CMC:果膠配比1:1、微波滲糖35 min-超聲滲糖1.5 h的條件下，考察賦形劑復(fù)合添加量（0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%）對獼猴桃脯飽滿指數(shù)的影響。

1.2.3.6 木糖醇添加量的影響 在賦形劑CMC:果膠配比1:1、復(fù)合添加量0.16%，微波滲糖35 min 后超聲輔助滲糖1.5 h的條件下，考察木糖醇添加量（20%、24%、28%、32%、36%）對獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)的影響。

1.2.3.7 協(xié)同滲糖方式的確定 在木糖醇添加量28%、賦形劑CMC:果膠配比1:1、復(fù)合添加量0.16%的條件下，由于本研究以縮短滲糖時(shí)間，提高滲糖效率為目的，協(xié)同滲糖方式中固定微波時(shí)間35 min，之后考察超聲輔助時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇木糖醇添加量、賦形劑復(fù)合添加量、微波-超聲波協(xié)同滲糖方式進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，利用Design-Expert V.8.0.5，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，以益生菌獼猴桃脯總糖含量和感官評價(jià)的綜合得分作為響應(yīng)值，對其進(jìn)行回歸方差分析。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken design

1.2.5 指標(biāo)測定

1.2.5.1 獼猴桃脯總糖含量測定 參考程立超等[15?17]方法稍作修改，采用蒽酮-硫酸比色法測定獼猴桃脯中總糖含量，每樣重復(fù)3 次測定，取平均值。

1.2.5.2 感官評價(jià) 參照NY/T 436-2009 感官評價(jià)部分，選擇12 位有經(jīng)驗(yàn)品評者對加工后成品的色澤、滋味、外形進(jìn)行評分，取均值作為感官評價(jià)得分。

1.2.5.3 飽滿指數(shù)測定 參考宋風(fēng)月[18]的方法，以干燥前后體積比表示樣品飽滿度，以高糖獼猴桃脯的飽滿度為參比計(jì)算各樣品的飽滿指數(shù)。

式中：V1?干燥前獼猴桃脯體積，mL；V2?干燥后獼猴桃脯成品體積，mL；A1?50%糖液制備的高糖獼猴桃脯飽滿度，%；A2?不同工藝制備的獼猴桃脯成品飽滿度，%；

1.2.5.4 綜合得分計(jì)算 參考秦世蓉等[6]方法，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以綜合得分為響應(yīng)值對無糖獼猴桃脯進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。綜合得分為總糖含量和感官評價(jià)權(quán)重各取0.5，即采取客觀與主觀評價(jià)相結(jié)合的方法，以使產(chǎn)品得到相對合理的評價(jià)。

1.2.5.5 Vc 含量測定 參考Cheng 等[19]方法，準(zhǔn)確稱取1 g 樣品，加入5%三氯乙酸（TCA）5.0 mL。混勻離心后取0.4 mL 上清液，加入1.6 mL 5% TCA，1 mL 無水乙醇，0.5 mL 0.5%磷酸-乙醇，1.0 mL 0.5%鄰菲羅琳-乙醇，0.5 mL 0.03% FeCl3-乙醇，30 ℃水浴60 min 后測定OD534nm，重復(fù)三次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Vc 含量，單位為mg/g。

1.2.5.6 游離氨基酸含量測定 參考GBT8314-2013 稍作修改，取1 g 樣品于10 mL 蒸餾水中煮沸提取15 min，離心后取上清液0.2 mL，加入0.1 mL pH 8.0 磷酸鹽緩沖液和0.1 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴15 min，冷卻定容25 mL，測定OD570nm。

1.2.5.7 總酚含量測定 參考Folin-Ciocalteau[20]方法，稍作修改。結(jié)果表示為每克樣品所含沒食子酸含量，單位為mg/g。

1.2.5.8 類黃酮含量測定 參考曹建康等[21]研究方法稍作改動，稱取0.2 g 樣品，加入1.5 mL 1%HCL-甲醇溶液，充分混勻4 ℃避光提取20 min，離心后取上清液測定OD325nm。

1.2.5.9 有機(jī)酸含量測定 參考關(guān)秀杰等[22]方法采用HPLC 法，稍作修改。稱取1.0 g 樣品，加入5 mL流動相于75 ℃水浴45 min，超聲提取15 min，冷卻后轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶定容，過濾后取濾液于10000×g 離心10 min，分別取上清液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液上機(jī)分析，外標(biāo)法定量。其中色譜柱為C18反相色譜柱（3.9 mm×300 mm），柱溫30 ℃，流動相為0.04 mg/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液:甲醇（95:5），流速0.8 mL/min，樣品洗脫時(shí)間15 min，檢測器為紫外-可見光檢測器，于波長214 nm 處進(jìn)行測定。

1.2.5.10 揮發(fā)性風(fēng)味化合物測定 參考邸太菊等[23]方法稍作修改，采用固相微萃?。⊿PME）對樣品中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行萃取。稱取1 g 樣品于10 mL 頂空瓶中，于50 ℃水浴平衡15 min，之后將老化過的萃取針頭插入頂空瓶萃取40 min，然后用GC-MS 進(jìn)行分析。

定性分析：揮發(fā)性物質(zhì)通過NIST MS Search 2.3 質(zhì)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的圖譜對比，采用反匹配度大于800的物質(zhì)。

定量分析：以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)物，采用相對氣味活度值（Relative odor activity value，ROAV）評價(jià)樣品中各揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)度，ROAV≥1的組分為關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV<1的組分對產(chǎn)品總體風(fēng)味具有重要的修飾作用[24]。ROAV 值按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Ci和Ti和分別表示各揮發(fā)性組分的含量和感覺閾值，Cstan和Tstan表示樣品中對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的含量和感覺閾值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2010 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SPSS 23.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)并應(yīng)用Graphpad Prism 8.0.2 軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一滲糖方式單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1A 所示，隨著微波滲糖時(shí)間的增加，獼猴桃脯的總糖含量也隨之增加，但當(dāng)微波滲糖時(shí)間達(dá)到35 min 時(shí)，總糖含量上升速率驟減，且微波滲糖45 min 與55 min 之間無顯著性差異（P>0.05）。同時(shí)，當(dāng)滲糖時(shí)間超過45 min 后，產(chǎn)品色澤暗淡，脯體變硬，感官評價(jià)得分顯著降低（P<0.05），這可能由于微波時(shí)間過長，溫度過高，對產(chǎn)品結(jié)構(gòu)造成破壞。馮媛媛等[25]發(fā)現(xiàn)微波滲糖方式對歐李果體的滲糖效率有明顯促進(jìn)作用，但并不是時(shí)間越長滲糖效果越佳，與本研究結(jié)果一致。

圖1 單一微波（A）和超聲滲糖時(shí)間（B）對獼猴桃脯總糖含量及感官評價(jià)的影響Fig.1 Effects of individual microwave (A) and ultrasonic (B)sugar penetration treatment time on total sugar content and sensory evaluation of preserved kiwifruit

超聲波“空穴效應(yīng)”會在果體組織中形成微小孔道，以便提高獼猴桃脯滲糖過程中的物質(zhì)交換效率[26]。如圖1B 所示，隨超聲滲糖時(shí)間的延長，獼猴桃脯總糖含量逐漸上升，滲糖時(shí)間為3 h 時(shí)達(dá)到最高值，繼續(xù)延長滲糖時(shí)間，總糖含量開始降低，超聲滲糖3 h 和4 h 所得產(chǎn)品間差異不顯著（P>0.05），另外，產(chǎn)品感官得分隨超聲時(shí)間增加也逐漸上升，但當(dāng)超聲滲糖超過4 h 后，感官得分不增反降。雖然延長超聲時(shí)間有利于果體滲糖效率提高，但達(dá)到一定時(shí)間會對果體造成一定損傷破壞。

2.2 單一滲糖與協(xié)同滲糖方式對比分析

單一滲糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微波滲糖時(shí)間短、總糖含量相對較高，但是會對感官品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，超聲滲糖有益于獼猴桃脯品質(zhì)保持但是時(shí)間過長。而有研究表明微波-超聲波協(xié)同處理可在一定程度上克服單一微波和超聲波的不足[27]，因此，本研究采用微波-超聲協(xié)同滲糖方式加工獼猴桃脯。綜合總糖含量及感官評價(jià)結(jié)果，單一滲糖方式分別選擇單一微波滲糖45 min，單一超聲滲糖4 h 與協(xié)同滲糖方式進(jìn)一步對比。協(xié)同滲糖方式以提高滲糖效率、感官品質(zhì)及縮短加工時(shí)間目的，初步選擇固定微波滲糖35 min，之后超聲輔助滲糖分別為1、2 h。如表2 所示，協(xié)同滲糖明顯提高了獼猴桃脯的滲糖效率，但微波35 min 協(xié)同超聲滲糖1 h 所得產(chǎn)品的感官評價(jià)與單一滲糖無顯著性差異（P>0.05），而超聲時(shí)間上升到2 h 后，其感官評價(jià)顯著高于其他滲糖組（P<0.05）。因此，在相對降低工藝耗時(shí)的條件下協(xié)同滲糖有助于提高滲糖效果與感官品質(zhì)，且其超聲協(xié)同時(shí)間有待進(jìn)一步研究確定。

表2 不同滲糖方式對比分析Table 2 Comparative analysis of different sugar infiltration methods

2.3 滲糖工藝條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果表明CMC 與果膠對產(chǎn)品的賦形效果較好，且復(fù)配后優(yōu)于單一賦形劑。其不同配比對獼猴桃脯賦形效果的影響由圖2A 所示，隨果膠添加量的增加，產(chǎn)品的飽滿指數(shù)呈先上升后下降趨勢，其中配比為1:1 時(shí)，飽滿指數(shù)最高達(dá)92.1%，且與配比為1:2 時(shí)的飽滿指數(shù)差異不顯著（P>0.05）；由圖2B 可知，當(dāng)添加量為0.16%時(shí)，獼猴桃脯飽滿度最高（P<0.05），因此，確定賦形劑選用CMC 和果膠復(fù)配，配比為1:1，復(fù)合添加量為0.16%。木糖醇添加量對獼猴桃脯的質(zhì)地、飽滿度、口感等感官品質(zhì)有著明顯的影響。由圖2C 可知，隨著木糖醇添加量的增加，總糖含量逐漸上升，當(dāng)添加量達(dá)到32%后，產(chǎn)品總糖含量上升減緩，增加并不明顯；而添加量增加至28%時(shí)，產(chǎn)品感官評價(jià)得分達(dá)到最高值84.4，繼續(xù)增加反而會導(dǎo)致產(chǎn)品感官品質(zhì)降低，可能由于過甜導(dǎo)致滋味下降。

圖2 不同滲糖條件對獼猴桃脯飽滿指數(shù)、總糖含量及感官評價(jià)的影響Fig.2 Effects of different sugar penetration conditions on the full index,total sugar content and sensory evaluation of preserved kiwifruit

不同微波-超聲協(xié)同滲糖方式對獼猴桃脯總糖含量及感官的影響如圖2D 所示，固定微波時(shí)間不變，隨著超聲時(shí)間延長，產(chǎn)品總糖含量呈先上升后下降的趨勢。微波35 min 超聲1.5 h 時(shí)的總糖含量最高，為34.31%。同時(shí)，其感官評價(jià)得分也相對最高，但與微波35 min 超聲2 h 滲糖組無顯著性差異（P>0.05）。對比圖1，微波-超聲波協(xié)同滲糖方式所得獼猴桃脯總糖含量明顯高于單一微波和超聲滲糖的總糖含量，并且綜合感官評定結(jié)果高于單一滲糖產(chǎn)品的感官評分，且相比品質(zhì)較好的單一超聲滲糖相對縮短了加工時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RSM 設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4 所示。對表中結(jié)果進(jìn)行分析，得到綜合得分（Y）對木糖醇添加量（A）、賦形劑添加量（B）、協(xié)同滲糖方式中超聲時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=60.81?1.37A+1.69B?2.09C+1.10AB?1.57A C+1.61BC?4.06A2?6.46B2?1.79C2

試驗(yàn)所選用模型的F值為31.16，P<0.0001，表明該回歸模型極顯著。決定系數(shù)R2=0.9756>0.9，失擬誤差不顯著（P=0.9784>0.05），說明響應(yīng)值的變化有97.56%來源于所選變量，表明回歸模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較高，證實(shí)了模型的有效性[28]。但并不是意味著R2越大模型的一致性越好，對于一個(gè)好的統(tǒng)計(jì)模型，模型調(diào)整確定系數(shù)（=0.9443）應(yīng)該與R2相似，以更好地說明模型的有效性[29?30]。各項(xiàng)P值小于0.05 時(shí)所對應(yīng)的工藝條件對產(chǎn)品綜合得分是有顯著影響的，由表4 可知，一次項(xiàng)A（P=0.0127<0.05）顯著，AC（P=0.0305<0.05）顯著，BC（P=0.0274<0.05）顯著，AB（P=0.1011>0.05）不顯著。但是B（P=0.0045<0.01），C（P=0.0014<0.01）極顯著，同時(shí)由表4 中F值可知，各因素對產(chǎn)品綜合得分的影響大小順序?yàn)椋簠f(xié)同滲糖方式中超聲時(shí)間（C）>賦形劑添加量（B）>木糖醇添加量（A）。表明各因素對響應(yīng)值Y的影響并不是簡單線性關(guān)系。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analyses of variance of regression equation

響應(yīng)面和等高線圖能夠直觀反映各試驗(yàn)因素之間的交互作用，等高線圖可以反映交互作用的強(qiáng)弱，圖形越趨向橢圓表明交互作用越強(qiáng)。如圖3 所示，木糖醇添加量（A）和協(xié)同滲糖中超聲時(shí)間（C），賦形劑添加量（B）和協(xié)同滲糖中超聲時(shí)間（C）之間的等高線圖趨于橢圓，響應(yīng)面圖的曲面較陡，交互作用顯著。木糖醇添加量（A）和賦形劑添加量（B）的等高線圖趨于圓形，表明兩者交互作用不明顯。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour plots of the interaction of various factors

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇最優(yōu)工藝條件對二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行檢驗(yàn)，得到最優(yōu)條件為：木糖醇添加量27.77%，賦形劑復(fù)合添加量0.16%，超聲時(shí)間1.23 h。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作，需要對最佳工藝條件稍作修改：木糖醇添加量28%，賦形劑復(fù)合添加量0.16%，超聲時(shí)間1.25 h，進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得產(chǎn)品綜合得分為61.93±0.52，與預(yù)測值61.46 無顯著差異。以上結(jié)果證實(shí)了該模型能夠充分、可靠地優(yōu)化無糖益生菌獼猴桃脯加工工藝。對比單一滲糖方式，結(jié)果表明在微波基礎(chǔ)上輔以超聲，利用超聲波產(chǎn)生的“空穴效應(yīng)”，可加快滲糖過程中物質(zhì)交換速率，從而提高滲糖效率。劉婷婷等[31]研究同樣發(fā)現(xiàn)相比傳統(tǒng)工藝,微波-超聲波協(xié)同法可大大節(jié)省提取多糖的時(shí)間并可提高得率，這與本研究結(jié)果一致。

2.6 不同滲糖方式營養(yǎng)品質(zhì)對比分析

獼猴桃內(nèi)含有豐富的Vc、游離氨基酸、多酚及黃酮類等營養(yǎng)物質(zhì)，使其具有更高的功能性利用價(jià)值。利用優(yōu)化后的微波-超聲協(xié)同滲糖工藝對比單一滲糖方式所得產(chǎn)品，同時(shí)參考鮮樣進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)對比分析，其中協(xié)同滲糖為響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后的最優(yōu)工藝，微波滲糖和超聲滲糖分別參考單一滲糖單因素實(shí)驗(yàn)中的較優(yōu)工藝，具體為微波滲糖45 min、超聲滲糖4 h。加工過程會對獼猴桃果實(shí)體內(nèi)原有Vc 造成一定的損傷，由圖4A 可知，對比鮮樣，單一微波滲糖對Vc 破壞程度最大，協(xié)同滲糖Vc 保留含量相對較高，單一超聲次之，但兩者之間無顯著差異（P>0.05），其中協(xié)同滲糖維持了鮮樣中Vc的86%。由圖4B可知，獼猴桃脯加工過程會增加游離氨基酸含量，可能由于一定程度上破壞了果實(shí)內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，其中，單一超聲滲糖游離氨基酸顯著高于其他組（P<0.05），協(xié)同滲糖含量相對鮮樣也提高了52%。由圖4C 和D 可知，對比鮮樣，單一微波滲糖總酚與類黃酮含量并無明顯變化，而超聲與協(xié)同滲糖中含量顯著增加（P<0.05），可能由于在加工過程中促進(jìn)了酚類物質(zhì)的合成，其中協(xié)同滲糖所得獼猴桃脯中總酚和類黃酮含量分別提高了38%、56%。綜上所述，對比單一微波滲糖處理，微波-超聲協(xié)同滲糖一定程度上維持并豐富了獼猴桃脯的營養(yǎng)品質(zhì)，對比單一超聲滲糖處理，優(yōu)化后協(xié)同滲糖明顯提高了滲糖效果，但并未產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖4 不同滲糖方式對獼猴桃脯營養(yǎng)品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of different sugar penetrating methods on the nutritional quality of kiwifruit

2.7 不同滲糖方式有機(jī)酸含量對比分析

獼猴桃中有機(jī)酸組分及含量變化是影響果實(shí)品質(zhì)及風(fēng)味形成的重要因素之一[32]。采用HPLC 法檢測了不同滲糖方式及新鮮獼猴桃中8 種常見有機(jī)酸的含量，結(jié)果如表5 所示。新鮮獼猴桃中主要有機(jī)酸組分為蘋果酸、酒石酸、奎寧酸、檸檬酸、乳酸，而草酸和琥珀酸含量較低，富馬酸并未檢出，這與王剛等[33]檢測結(jié)果并不一致，可能由于獼猴桃產(chǎn)地差異及成熟度不同導(dǎo)致。對比鮮樣，單一滲糖方式增加了檸檬酸、酒石酸、乳酸及琥珀酸含量，而蘋果酸含量顯著降低（P<0.05），另外單一微波滲糖還導(dǎo)致了奎寧酸含量的降低。對比單一滲糖方式，優(yōu)化后協(xié)同滲糖顯著增加了檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、奎寧酸、乳酸及琥珀酸的含量（P<0.05），這可能與果實(shí)內(nèi)糖酸轉(zhuǎn)化有關(guān)。綜上而言，協(xié)同輔助滲糖明顯提高了有機(jī)酸的含量，有機(jī)酸總量達(dá)22.692 mg/g，并使檸檬酸成為主導(dǎo)組分。

表5 不同滲糖方式有機(jī)酸的組成及含量（mg/g）Table 5 Composition and content of organic acids in different sugar penetration methods(mg/g)

2.8 不同滲糖方式揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對比分析

在新鮮獼猴桃及三組不同滲糖方式所得獼猴桃脯中共檢測出85 種揮發(fā)性化合物，根據(jù)食品風(fēng)味化學(xué)，感覺閾值越低的物質(zhì)越易被感知，一般揮發(fā)性化合物對果實(shí)風(fēng)味的貢獻(xiàn)度由其含量和閾值共同決定，某些含量高而閾值高的物質(zhì)不一定對總體風(fēng)味起重要作用[34]。ROAV 值法是一種新的確定關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的有效方法[35]。ROAV 值越大說明該化合物對總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。

新鮮獼猴桃和不同滲糖方式加工所得獼猴桃脯中各揮發(fā)性化合物的ROVA 值及含量如表6 所示。根據(jù)已有閾值計(jì)算所得的ROVA 值，其中新鮮獼猴桃中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物（ROAV≥1）有9 種，起重要修飾作用的化合物組分（0.1≤ROAV≤1）有4 種，貢獻(xiàn)最大的為2-己烯醛，這與陳麗[36]研究結(jié)果一致，但酯類檢測結(jié)果差別較大，可能是由于加工所用原料為八成熟左右以及品種產(chǎn)地不同導(dǎo)致；單一微波滲糖加工所得獼猴桃脯關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物有15 種，主要為酯類、酮類和醛類，起修飾作用的化合物組分有2 種；單一超聲滲糖加工所得獼猴桃脯中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物有19 種，主要為酮類、醛類、酯類和烯烴類，起修飾作用的有5 種；優(yōu)化后微波-超聲協(xié)同滲糖所得樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物有18 種，主要為酯類、酮類、醛類和醇類，起修飾作用的有2 種。相對于鮮樣，加工后產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更豐富，單一超聲滲糖組關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)最多，協(xié)同滲糖組次之，同時(shí)加工成獼猴桃脯貢獻(xiàn)最大的風(fēng)味物質(zhì)由2-己烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)榧核嵋阴?，主要表現(xiàn)為由青草香味主導(dǎo)風(fēng)味變?yōu)楦S富的果香味[37]。此外，由于部分揮發(fā)性風(fēng)味成分未能查詢到其對應(yīng)的感官閾值未做相應(yīng)分析。

表6 不同滲糖方式揮發(fā)性成分的組成ROAV 值及含量Table 6 Composition ROAV value and content of volatile components in different sugar infiltration methods

續(xù)表 6

四組樣品中各類揮發(fā)性化合物的含量和數(shù)量如圖5 所示，其中由圖5A 可知，優(yōu)化后協(xié)同滲糖工藝所得樣品總含量最高，達(dá)438.04 ng/g，未加工新鮮獼猴桃次之，含量為369.88 ng/g，單一微波滲糖組含量為328.75 ng/g，單一超聲滲糖組含量最低，僅為187.52 ng/g。鮮樣中醛類化合物為揮發(fā)性成分的主要組分，這可能與果實(shí)成熟度有關(guān)。經(jīng)一系列工藝加工為無糖獼猴桃脯后，酯類、酮類及烯烴類物質(zhì)明顯增加，賦予了產(chǎn)品更多果香、香脂香氣等風(fēng)味[37?38]。如圖5B 所示，對比鮮樣，優(yōu)化后協(xié)同滲糖工藝中，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的數(shù)量顯著增加（P<0.05），單一滲糖組也有不同程度的增加，但超聲組中揮發(fā)性化合物數(shù)量與加工前新鮮獼猴桃之間無顯著差異（P>0.05）。綜上所述，優(yōu)化后協(xié)同滲糖組中揮發(fā)性風(fēng)味成分最為豐富，含量也有所提高。因此，優(yōu)化后微波-超聲協(xié)同滲糖工藝不僅在一定程度上保留了新鮮獼猴桃原有的風(fēng)味，還有其他獨(dú)特的風(fēng)味產(chǎn)生，使無糖益生菌獼猴桃脯滋味更豐富。

圖5 不同滲糖方式對各類揮發(fā)性化合物含量及數(shù)量的影響Fig.5 Effects of different sugar penetrating methods on the content and quantity of various volatile compounds

3 結(jié)論

無糖益生菌獼猴桃脯的最佳工藝條件為：木糖醇添加量28%、賦形劑添加量0.16%、協(xié)同滲糖方式為微波35 min 后超聲1.25 h，結(jié)合總糖含量與感官評價(jià)的綜合得分可達(dá)61.93。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝處理后的獼猴桃脯，色澤鮮亮，表面益生菌粉分散均勻，脯體飽滿度良好，口感綿軟有嚼勁，酸甜可口。營養(yǎng)品質(zhì)分析表明優(yōu)化工藝不但提高了滲糖效果，減少了Vc的損失，還使獼猴桃脯中游離氨基酸、總酚及類黃酮含量明顯增加。HPLC 檢測分析顯示，對比單一滲糖工藝，優(yōu)化后協(xié)同滲糖處理的果脯中檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、奎寧酸等7 種有機(jī)酸含量有所增加。另外，GC-MS 分析結(jié)果表明新鮮獼猴桃加工成無糖益生菌獼猴桃脯后主要風(fēng)味物質(zhì)由2-己烯醛變?yōu)榧核嵋阴?，同時(shí)協(xié)同滲糖在最大程度保留獼猴桃原有風(fēng)味的同時(shí)，還有更多果香、脂質(zhì)香氣等風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，使產(chǎn)品口感更為豐富。由此，本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化工藝在改善了無糖獼猴桃脯滲糖效果的同時(shí)，保證了其營養(yǎng)品質(zhì)與風(fēng)味，為無糖益生菌獼猴桃脯的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定參考。