王雪梅，龍葉峰，林勇濤，周楚升，孔泳欣，吳思英，周春暉

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510030；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303）

羊肚菌（Morchella esculenta）別名羊蘑、羊肚菜、草笠竹，是世界上珍稀的食藥用真菌之一，其香味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，在我國主要分布在云南、四川、甘肅、陜西等地。多糖類組分是菌體中重要的生物活性物質(zhì)，具有提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、降血脂等功能[1]。

多糖常用提取方法有熱水浸提法、酶解法、微波萃取法和超聲波輔助提取法等[2?4]。酶解法常用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，減少提取時細(xì)胞結(jié)構(gòu)的阻力[5]。超聲波破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，加速多糖的溶出[6]。與熱水浸提法相比，酶解法和超聲輔助提取法提取羊肚菌多糖，提取得率更高。此外，酶解法作用條件溫和，耗能低[7]，超聲輔助提取法提取時間短、效率高[8]。使用纖維素酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解可以提高多糖的溶出率和提取得率，將酶解與超聲輔助兩種提取方法結(jié)合起來進(jìn)行二次提取，將更有利于提高羊肚菌多糖的提取得率。目前羊肚菌多以鮮食或加工成干制品為主，而將羊肚菌開發(fā)成功能性食品、保健食品等高附加值產(chǎn)品研究相對較少。付天宇[9]經(jīng)羊肚菌深層發(fā)酵制備緩解體力疲勞、輔助降血脂的羊肚菌口服液；劉超[10]曾研究表明羊肚菌多糖的抗結(jié)腸癌的作用；田雨[11]制備了羊肚菌抗氧化肽。羊肚菌功效成分經(jīng)提取后開發(fā)成新型功能性食品具有巨大的市場和發(fā)展前景。羊肚菌多糖含片，易于服用，便于攜帶，給工作節(jié)奏快、機(jī)體免疫力低下等人士提供一款體驗(yàn)感好的便利產(chǎn)品，豐富了羊肚菌健康食品的品類。

本文主要采用超聲波輔助酶解法，以羊肚菌多糖的提取得率為指標(biāo)，優(yōu)化獲得羊肚菌多糖的高效提取工藝，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得出羊肚菌多糖含片的最佳制備配方，以期為羊肚菌多糖功能性食品開發(fā)提供技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌子實(shí)體 購自云南省麗江市；纖維素酶（酶活力為10 萬 U/g） 和氏璧生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為10 萬 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活力為10 萬 U/g） 鑫誠生物科技有限公司；磷酸、苯酚、三氯乙酸 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵 天津市百世化工有限公司；水楊酸、七水合硫酸亞鐵 廣州化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀 廣州市番禺區(qū)建興試劑廠；DPPH 試劑 上海金穗生物科技有限公司；30%過氧化氫 廣州市海珠化學(xué)試劑有限公司；山梨糖醇河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；乳糖、甘露醇 山東佰晨食品配料有限公司；硬脂酸鎂 湖州市菱湖新望化學(xué)有限公司；維生素C 粉末 谷知味生物科技有限公司；95%乙醇溶液 河南鑫河陽酒精有限公司。

pH-100 筆式酸度計 上海力辰邦西儀器科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋、101-3AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW177 型中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；JJ500A 型分析天平 福建艾杰爾進(jìn)出口有限公司；JY96-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SC-3614 型高容量低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；V-5100 型分光光度計上海元析儀器有限公司；Zp19 型旋轉(zhuǎn)壓片機(jī) 泰州市黎明制藥機(jī)械有限公司；SY-3D 型片劑四用測定儀 廣州市深華生物技術(shù)有限公司；BCD-331WDGQ型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌多糖的提取

1.2.1.1 羊肚菌預(yù)處理 將羊肚菌子實(shí)體置于60 ℃的干燥箱中干燥3 h，然后將子實(shí)體進(jìn)行粉碎并過20 目篩，干粉置于干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 羊肚菌多糖的提取 稱取羊肚菌干粉2.00 g，參考陳超等[12]的方法，分別添加質(zhì)量比為2:1的纖維素酶和木瓜蛋白酶，加去離子水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH，置于55 ℃恒溫水浴鍋中酶解，酶解后分別進(jìn)行150 W 超聲處理，95 ℃滅酶，5000 r/min 離心15 min，上清液儲存?zhèn)溆?；將離心后的沉淀用相同體積的去離子水溶解，二次提取，離心得上清液；合并兩次上清液，減壓濃縮[13]，醇沉12 h[14]后，離心取沉淀、溶解，得到粗多糖溶液。

1.2.1.3 粗多糖的純化 取粗多糖溶液，加入1%菠蘿蛋白酶，加入1%活性炭，置于50 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，6000 r/min 離心15 min，取上清液，即為羊肚菌多糖溶液。

1.2.1.4 羊肚菌多糖提取單因素實(shí)驗(yàn) 選擇液料比、酶用量、酶解pH、超聲時間與酶解時間為影響因素，以多糖提取得率為指標(biāo)設(shè)計單因素實(shí)驗(yàn)，研究其對羊肚菌多糖提取得率的影響。設(shè)置單因素各因素的條件和范圍如下：固定酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，液料比分別為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min，酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，酶解pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；固定液料比為15:1 mL/g、酶解pH 為5.5、超聲時間15 min、酶解時間1.5 h，酶用量分別為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；固定液料比為15:1 mL/g、酶用量為1.4%、酶解pH 為5.5、酶解時間1.5 h，超聲時間分別為10、15、20、25、30 min。

1.2.1.5 響應(yīng)面優(yōu)化羊肚菌多糖提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果挑選出影響羊肚菌多糖提取得率的顯著因素，分別為液料比、酶解pH、超聲提取時間，以這三個因素為響應(yīng)面優(yōu)化因素，以羊肚菌多糖的提取得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.05 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)[15]響應(yīng)面的因素和水平見表1。

表1 羊肚菌多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels table of optimization experiment of Morchella esculenta polysaccharide extraction process by response surface methodology

1.2.2 羊肚菌多糖提取得率的測定

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確配制0.004、0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028 mg/mL的葡萄糖溶液，分別移取2 mL 不同濃度的葡萄糖溶液至試管中，并加入現(xiàn)配的6%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，靜置30 min，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個平行，以空白組為參比溶液，490 nm 測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.2.2 換算因子的測定 準(zhǔn)確配制0.01 mg/mL的羊肚菌精多糖溶液，按照1.2.2.1 方法測量，得到結(jié)果根據(jù)回歸方程計算出精多糖溶液中葡萄糖的含量，并根據(jù)以下公式計算換算因子f。

式中，C 表示精多糖中葡萄糖的濃度，mg/mL；D 表示溶液的稀釋倍數(shù)；m 表示精多糖的質(zhì)量，g。

1.2.2.3 多糖提取得率的測定 結(jié)合苯酚-硫酸法[16]測定多糖提取得率：將提取得到的羊肚菌多糖溶液定容到50 mL的容量瓶中、準(zhǔn)確吸取2 mL 并定容到100 mL的容量瓶中，按照1.2.2.1 方法測量，并根據(jù)以下公式計算多糖提取得率。

式中，C 表示多糖溶液中葡萄糖的濃度，mg/mL；D 表示溶液的稀釋倍數(shù)；V 表示定容的體積，mL；f 表示換算因子；m 表示羊肚菌粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 羊肚菌多糖含片的制備

1.2.3.1 羊肚菌多糖含片的制備 參考劉梁等[17]的方法并加以改良，將最優(yōu)提取條件下獲得的羊肚菌多糖溶液濃縮成浸膏，后加入填充劑和維生素C 混合，過14 目篩網(wǎng)制粒，置于60 ℃烘箱中干燥3 h，過20 目篩網(wǎng)整粒，加入硬脂酸鎂總混，旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)壓片，即得羊肚菌多糖含片。

1.2.3.2 含片制備單因素實(shí)驗(yàn) 填充劑的選擇：分別比較乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘露醇與山梨糖醇混合物（1:1）四種填充劑[18]，按照1.2.4 中的方法進(jìn)行綜合評價選出最佳填充劑。

填充劑的用量：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇填充劑與多糖浸膏的質(zhì)量比為6:1、8:1、10:1、12:1、14:1，按照1.2.4 中的方法進(jìn)行綜合評價確定最佳用量。

硬脂酸鎂的用量：比較不同硬脂酸鎂的添加量為總質(zhì)量的0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，按照

1.2.4 中的方法進(jìn)行綜合評價確定最佳用量。

維生素C的用量：比較維生素C的添加量2、3、4、5、6 g/kg，按照1.2.4 中的方法進(jìn)行綜合評價確定最佳用量。

1.2.3.3 含片制備正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取填充劑山梨糖醇與甘露醇混合物（1:1）、硬脂酸鎂用量和維生素C 用量三個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。以此確定填充劑與多糖的最佳比值、硬脂酸鎂和維生素C的最佳用量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置三因素三水平正交試驗(yàn)，見表2。

表2 羊肚菌含片正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels tabke of orthogonal experiment of Morchellabuccal tablets

1.2.4 含片綜合評價 邀請20 名具有豐富經(jīng)驗(yàn)的感官評價員，分別從含片的風(fēng)味、口感、組織狀態(tài)、色澤四個方面進(jìn)行評分鑒定。風(fēng)味、口感各占30 分，組織狀態(tài)占25 分，色澤占15 分，滿分100 分[19]，評價標(biāo)準(zhǔn)見表3。以感官評價70 分、硬度15 分、脆碎度10 分、崩解時限5 分、總分100 分為綜合評分指標(biāo)，對含片進(jìn)行綜合評價，綜合評價表見表4。

表3 感官評價標(biāo)準(zhǔn)表Table 3 Sensory evaluation standard table

表4 含片綜合評價表Table 4 Comprehensive evaluation table of buccal tablets

1.2.5 含片質(zhì)量檢測

1.2.5.1 片重差異的測定 按照2020 年版《藥典》片劑章節(jié)所述方法測定。

1.2.5.2 多糖含量的測定 使用苯酚-硫酸法測定。

1.2.5.3 硬度的測定 制備三個批次的含片，每批次隨機(jī)選出二十顆，使用片劑四用測定儀測定。

1.2.5.4 脆碎度的測定 取20 片樣品吹去表面粘附的粉末并稱量其質(zhì)量A，置于片劑四用測定儀中4 min轉(zhuǎn)動100 r，結(jié)束后取出吹去表面的粉末并稱量其質(zhì)量B，按照以下公式計算脆碎度。

式中，A 表示檢測前質(zhì)量，g；B 表示檢測后質(zhì)量g；

1.2.5.5 崩解時限測定 利用量筒靜態(tài)法[20]測定，將羊肚菌多糖含片放入盛有2 mL 去離子水的10 mL量筒中，水溫37 ℃，放入含片后開始計時，觀察含片至沒有崩散現(xiàn)象停止計時，記錄崩解時長。

1.2.6 含片抗氧化活性研究

1.2.6.1 羥自由基清除能力測定 參考Opa 等[21]的方法并加以改良，精確配制9.0 mmol/L的水楊酸溶液、9.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、9.0 mmol/L的過氧化氫溶液，和不同濃度的樣品溶液（0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL），準(zhǔn)確移取不同樣品溶液2 mL 于試管中，準(zhǔn)備空白組，并分別向每管溶液中準(zhǔn)確移取2 mL 硫酸亞鐵溶液、過氧化氫溶液、水楊酸溶液，37 ℃的恒溫水浴30 min，用去離子水作參比溶液，510 nm 測其吸光度，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次平行，以維生素C 作為陽性對照，得到結(jié)果按照以下公式計算：

式中，Ax表示樣品清除羥自由基后的吸光值；Axo表示樣品本身的吸光值；Ao表示空白組的吸光值。

1.2.6.2 清除DPPH 自由基實(shí)驗(yàn) 參考Ma 等[22]的方法并加以改良，準(zhǔn)確配制0.05 mg/mL的DPPH 溶液、0.02、0.2、2、4、8、10 mg/mL的樣品溶液，準(zhǔn)確移取2 mL 不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入4 mL 濃度為0.05 mg/mL的DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min,以去離子水為參比溶液，517 nm 測其吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次平行，以維生素C 作為陽性對照，結(jié)果按以下公式計算：

式中，Ax表示樣品清除DPPH 自由基后的吸光值；Axo表示樣品本身的吸光值；Ao表示空白組的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Expert 8.05 軟件處理，正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用正交助手Ⅱ v3.1 軟件處理，其他數(shù)據(jù)使用Excel 2010 處理。

2 結(jié)果和分析

2.1 檢測羊肚菌多糖含量

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

由圖1 可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=16.286x?0.0271，R2=0.997，吸光度值和多糖濃度在0～0.028 mg/mL 之間具有良好的線性關(guān)系，代入精多糖的吸光度求出換算系數(shù)f=1.23，將其代入提取得率公式即可計算出提取得率。

2.2 羊肚菌提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖2 所示，隨著液料比的上升，羊肚菌多糖的提取得率先上升后下降，當(dāng)液料比在10:1～25:1（mL/g）之間呈上升趨勢，液料比達(dá)到25:1（mL/g）時，提取得率達(dá)到最大值9.28%，當(dāng)液料比大于25:1（mL/g）時，提取得率呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是，液料比大于25:1（mL/g）時，加入的蒸餾水多，稀釋了酶的濃度。實(shí)驗(yàn)得出可將液料比為20:1～30:1（mL/g）列為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

圖2 液料比對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.2 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖3 所示，隨著酶解時間的延長，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解時間低于2 h 時，多糖的提取得率逐漸上升，當(dāng)酶解時間為2 h 時，羊肚菌多糖的提取得率達(dá)到最大值8.55%，大于2 h 時，羊肚菌多糖的提取得率呈下降趨勢。其原因有可能是酶解時間的延長，使得酶開始失活，且多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，導(dǎo)致提取得率下降[23]，由此可得適宜的酶解時間為2 h。

圖3 酶解時間對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.3 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖4 所示，隨著酶解pH的增大，羊肚菌多糖提取得率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解pH 小于5.0 時，羊肚菌多糖的提取得率呈上升趨勢，當(dāng)酶解pH 等于5.0 時，羊肚菌多糖提取得率達(dá)到最大值9.57%,當(dāng)酶解pH 大于5.0 時，羊肚菌多糖的提取得率下降，其原因可能為pH 影響酶的活性。由此可得最佳酶解pH 為5.0，據(jù)研究，纖維素酶最適pH 為4.5～6.0，木瓜蛋白酶最適pH 為5.0～7.0，因此該pH 為5.0 時效果較好與兩種酶的最適pH 具有一致性。

圖4 酶解pH 對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.4 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖5 所示，隨著酶用量增大，羊肚菌多糖提取得率呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)酶用量為1.4%，羊肚菌多糖提取得率達(dá)到8.48%；當(dāng)酶用量少于1.4%時，羊肚菌多糖的提取得率呈現(xiàn)快速上升趨勢；當(dāng)酶用量大于1.4%時，羊肚菌多糖提取得率呈緩慢上升趨勢，其原因可能是當(dāng)酶用量達(dá)到一定量時，底物大部分被反應(yīng)完，故提取得率上升趨勢極緩慢，結(jié)合成本考慮，確定酶用量為1.4%。

圖5 酶用量對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.2.5 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響如圖6 所示，隨著超聲波處理時間的延長，羊肚菌多糖提取得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)超聲波處理時間少于20 min 時，羊肚菌多糖的提取得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)超聲波處理時間為20 min 時，羊肚菌多糖提取得率達(dá)到最大值8.51%,當(dāng)超聲波處理時間大于20 min 時，羊肚菌多糖的提取得率下降，原因可能是超聲時間過長，多糖鏈的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取得率下降[24]。由此可得超聲波較優(yōu)的處理時間為20 min。

圖6 超聲波處理時間對羊肚菌多糖提取得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.3 羊肚菌提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 對響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合[25]，得到多糖含量與各因素的二次多項回歸方程，提取得率Y=9.28+0.34A?0.069B?0.23C+0.21AB+0.26AC?0.28BC+0.26AC?0.28BC?0.24A2?0.32B2?0.50C2，R2=0.9323。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test

F值越大表明該因素對含量影響越顯著，各因素對羊肚菌多糖含量的影響大小依次為：A-液料比>C-超聲時間>B-酶解pH。其中A、C、AC、BC、A2、B2、C2為顯著性因子項。對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，模型的F為10.70，P<0.01，模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為0.77，P>0.05，無顯著性差異，回歸方程與實(shí)際擬合的非正常誤差所占的比例較小，能反映實(shí)際情況，說明是可靠的、合適的、有意義的表6。

表6 回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation

2.3.2 響應(yīng)面圖及等高線圖分析 通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到多元二次回歸模型所作響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7 所示，對回歸模型進(jìn)行分析，得到羊肚菌多糖提取的最佳工藝為：液料比為28.62:1（mL/g）、酶解pH 為5.08、超聲波處理時間為19.55 min，此工藝下羊肚菌多糖提取得率為9.40%。為方便操作，將羊肚菌多糖的提取工藝修改為:液料比29:1（mL/g）、酶解pH 為5.1、超聲波處理時間20 min。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，羊肚菌多糖得率為9.21%，此工藝優(yōu)化效果明顯。

圖7 不同兩因素交互作用對羊肚菌多糖提取得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7 Response surface diagram and contour map of the interaction of different two factors on the extraction yield of Morchella esculenta polysaccharide

2.4 含片制備單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 填充劑的選擇對含片的影響 四種填充劑均不粘沖、片劑成形情況均良好。但乳糖和甘露醇的吸濕率低，成型的片劑太硬，不利于含服融化。山梨糖醇吸濕率高，成型的片劑脆碎度相對較高，易掉粉。結(jié)合乳糖不耐受癥患者由于體內(nèi)缺乏乳糖酶導(dǎo)致不能消化吸收乳糖而不宜食用[26]，故確定填充劑為山梨糖醇:甘露醇=1:1 組合，壓出來的片劑硬度適中、口感好、適用人群較廣，且糖醇類不易引起齲齒，不會大幅度引起血糖的上升。在濕度較低的干燥環(huán)境下所測得填充劑吸濕率如圖8 所示，綜合得分如圖9 所示。

圖8 不同填充劑的吸濕曲線圖Fig.8 Moisture absorption curves of different fillers

2.4.2 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏的比值對含片的影響 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏的比值對含片的影響如圖10 所示，隨著比值的增大，含片的綜合得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)比值為8:1 時，綜合得分達(dá)到最大，比值大于8:1 時，綜合得分下降，原因可能在于多加的填充劑降低了多糖的濃度，降低了含片的功能性。由此可得最佳山梨糖醇、甘露醇混合物與浸膏比值為8:1。

圖10 山梨糖醇、甘露醇混合物與多糖浸膏比值綜合評分圖Fig.10 Comprehensive score chart of ratio of sorbitol,mannitol mixture and polysaccharide extract

2.4.3 硬脂酸鎂的添加量對含片的影響 硬脂酸鎂的添加量對含片的影響如圖11 所示，隨著硬脂酸鎂添加量的增大，含片的綜合得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)添加量為1.0%時，綜合得分達(dá)到最大，添加量大于1.0%時，綜合得分下降，原因可能在于硬脂酸鎂的添加量過大，影響了含片的崩解時限。

圖11 硬脂酸鎂添加量對含片的綜合評分圖Fig.11 Comprehensive score chart of magnesium stearate addition on buccal tablets

2.4.4 維生素C的添加量對含片的影響 維生素C 添加量對含片的影響如圖12 所示，隨著維生素C 添加量的增大，含片的綜合得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)添加量為4 mg/g 時，綜合得分達(dá)到最大，當(dāng)添加量大于4 mg/g 時，綜合得分下降，原因在于維生素C的添加量增加引起口感的變化，含片變酸。

圖12 維生素C 添加量對含片綜合評分圖Fig.12 Comprehensive score chart of vitamin C addition on buccal tablets

2.5 含片制備正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7 可知，3 個因素對結(jié)果影響的大小為A>B>C,即填充劑與多糖的比值>維生素C的添加量>硬脂酸鎂的添加量，填充劑與浸膏的比值對含片整體的影響最大，硬脂酸鎂的添加量對含片整體的影響最小。最優(yōu)組合為A2B3C1,最佳的制備工藝為填充劑與多糖的比值為8:1、維生素C的添加量5 mg/g、硬脂酸鎂的添加量為0.8%。

表7 含片正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 7 Orthogonal test results of buccal tablets

2.6 含片質(zhì)量檢測結(jié)果

多糖含片片重差異為3.2%（低于5%）、脆碎度為0.5%±0.1%，兩項指標(biāo)符合2020 年版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)；羊肚菌多糖含量為8.5%±0.5%；崩解時限為12 min、硬度為（126.4±3.0）N，該兩項指標(biāo) 在2020 年版《中國藥典》中未做規(guī)定，主要影響到產(chǎn)品得分綜合評價，測量值符合評分要求。

2.7 抗氧化活性研究結(jié)果

2.7.1 清除羥自由基實(shí)驗(yàn) 羥基自由基（·OH）清除能力測定：如圖13 所示，在羊肚菌多糖含片濃度0.02～10 mg/mL的范圍內(nèi)，羊肚菌多糖含片對·OH的清除率隨濃度的增大而不斷增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，羊肚菌多糖含片10 mg/mL 時對羥自由基清除率高達(dá)46.78%，研究結(jié)果表明，羊肚菌多糖含片有良好的羥自由基清除能力。含片中作為輔助原料的維生素C，在樣液中的濃度遠(yuǎn)低于陽性對照維生素C的濃度（濃度比為1:200），因此，含片對羥自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用，配方中維生素C 或起到一定的協(xié)同效果。

圖13 羊肚菌多糖含片和維生素C 對羥自由基的清除能力Fig.13 Scavenging ability of Morchella esculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on hydroxyl radical

2.7.2 清除DPPH 自由基實(shí)驗(yàn) DPPH 自由基清除能力測定：如圖14 所示，羊肚菌多糖含片濃度在0.02～10 mg/mL的范圍內(nèi)，對DPPH 自由基的清除率隨濃度增大而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，表現(xiàn)出穩(wěn)定的清除能力。當(dāng)羊肚菌多糖含片濃度為10 mg/mL時，清除率達(dá)到75.38%，證明多糖含片有極好的清除DPPH 自由基的能力。同理，含片對DPPH 自由基的清除能力主要是羊肚菌多糖的作用。

圖14 羊肚菌多糖含片和維生素C 對DPPH 自由基的清除能力Fig.14 Scavenging ability of Morchella elculenta polysaccharide buccal tablets and vitamin C on DPPH free radicals

3 結(jié)論

羊肚菌多糖提取中，設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)，通過分析方差挑選出3 個對提取得率影響較顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理，得到最終的結(jié)果為液料比29:1 mL/g、酶解pH 為5.1、超聲波處理時間20 min、酶解時間為2 h、酶用量為1.4%；制備含片部分，設(shè)計單因素實(shí)驗(yàn)挑選出最佳的填充劑、填充劑和提取物的適用量、維生素C的適用量、硬脂酸鎂的適用量，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計三水平三因素正交試驗(yàn)，探索出各因素最佳用量，最終配方為：填充劑為山梨糖醇:甘露醇=1:1 混合粉末，填充劑與多糖提取物比值為8:1，維生素C的使用量為5 mg/g，硬脂酸鎂的用量為0.8%；在檢測部分所得結(jié)果如下：含片的pH 為6.3±0.1，硬度為（126.4±3.0）N，脆碎度為0.5%±0.1%，崩解時限為12 min，多糖含量（31.4±0.5）mg/粒，含片濃度為10 mg/mL 時，羥自由基清除率為46.78%，DPPH 自由基的清除率為75.38%，抗氧化活性良好。本研究對高效提取羊肚菌多糖并加工成易于攜帶、便于進(jìn)食、口感優(yōu)良的羊肚菌多糖功能食品，具有一定的參考價值，后續(xù)可以在功能機(jī)理上作更深入的研究；同時也可以將羊肚菌多糖在其他保健功能如緩解疲勞、預(yù)防腫瘤等功能產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用上做更廣泛的研究與探討。