梁夏夏，袁倩云，劉 蕾，郭珊珊，王文彬,

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇連云港 222005；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005）

食源性疾病是世界上日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，可導致嚴重的經(jīng)濟損失[1]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于全球近岸海水、海底沉積物和魚類、貝類等海洋生物中，是引起我國沿海地區(qū)及大城市食物中毒的首要病原菌[2]。食用污染副溶血性弧菌的魚、蝦、貝等海鮮產(chǎn)品可以引發(fā)食物中毒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、頭痛、腹瀉等癥狀，嚴重的可引起敗血癥[3?6]。副溶血性弧菌也是海水養(yǎng)殖中細菌性病害的常見病原，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[7]。因此，研究副溶血性弧菌診斷抗原對食品安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖領域具有重要意義。

細菌外膜蛋白主要為受體蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白，主要作用是協(xié)助細菌與外環(huán)境聯(lián)系以獲取所需的營養(yǎng)物質(zhì)。外膜蛋白具有組成型膜蛋白、脂蛋白、LPXTG-樣末端蛋白、非共價偶聯(lián)蛋白等類型，典型結(jié)構(gòu)為β-桶狀結(jié)構(gòu)，外膜蛋白除了有常規(guī)的滲透特性、維持細胞膜膜穩(wěn)定性等功能外，與弧菌致病性等諸多方面均具有密切關系。部分外膜蛋白具有黏附作用，可促進致病菌的侵襲和體內(nèi)增殖[8?10]；外膜蛋白還具有良好的免疫原性，其不僅可以刺激機體的體液免疫，對細胞免疫也有刺激作用[11]。部分外膜蛋白具有細菌表面的暴露表位和在不同的血清型之間的保守性[12?13]，是潛在的診斷抗原。目前弧菌保守性外膜蛋白研究較多，副溶血性弧菌特異性外膜蛋白報道較少。其它已研究的弧菌外膜蛋白有OmpK、OmpU、OmpW、OmpA 等[14?17]，弧菌OmpK 重組蛋白抗體對不同副溶血性弧菌弧菌有一定效價，OmpU 重組蛋白血清對不同弧菌有較好的免疫交叉反應力，OmpW 重組蛋白制備的單抗對多種弧菌有交叉反應。

鐵是絕大多數(shù)細菌生存所需要的元素，而宿主細胞體內(nèi)的鐵多以亞鐵紅素、鐵結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白等形式存在[18]，細菌難以直接獲取。副溶血性弧菌擁有多種攝鐵系統(tǒng)，在缺鐵環(huán)境下，其本身產(chǎn)生一種載鐵體稱為弧菌鐵蛋白vibrioferrin 以促進鐵的獲取[19]。弧菌鐵蛋白與環(huán)境中Fe3+絡合后，被運送到與之特異性結(jié)合的表面受體蛋白，即弧菌鐵蛋白受體；該蛋白分子量78.7 kDa，由pvuA基因表達，其轉(zhuǎn)運過程需要TonB 系統(tǒng)的幫助[20]。目前對于弧菌鐵蛋白受體的免疫原性研究未見報道。

前期研究從副溶血性蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫出發(fā)，采用生物信息學預測所有外膜蛋白，通過蛋白序列BLAST 篩選出包括VP1008、弧菌鐵蛋白受體在內(nèi)的17 種副溶血性弧菌差異性外膜蛋白，這些蛋白在副溶血性弧菌內(nèi)保守性均大于92%，VP1008 與弧菌屬外的細菌相似性<27%，弧菌鐵蛋白受體與弧菌屬外細菌的同源性較低[21]。本研究旨在重組表達并分析副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體新型抗原小鼠免疫血清的效價水平、特異性和交叉性，為副溶血性弧菌免疫分析方法和檢測試劑盒的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ（酶活：10000 U/mL）、NcoⅠ（酶活：10000 U/mL）、DNA Marker、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、異丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、雙色預染蛋白 Marker、SDSPAGE 凝膠電泳所需試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；6～8 周齡的BALB/c 小鼠（許可證號：SCXK（蘇）2017-0007） 揚州大學獸醫(yī)學院；弗氏完全佐劑、不完全佐劑和牛血清蛋白（BSA）Sigma 公司；羊抗鼠二抗 Jackson Immuno Research公司；沉淀型TMB 底物緩沖液 廣州捷倍斯生物科技有限公司；蛋白酶K（酶活：40 U/mg） Solarbio 公司；原核表達載體pET-28a（+）、大腸桿菌DH5α、和BL21（DE3）為本實驗室保存；本研究所用的菌株見表1；其他化學試劑 均購自上海國藥化學試劑有限公司。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

Minin-PROTEAN 小型蛋白垂直凝膠電泳系統(tǒng)上海坤科儀器設備有限公司；DGGE 凝膠電泳設備 美國伯樂公司；透析袋（截留相對分子質(zhì)量14000 Da）上海橋星貿(mào)易有限公司；96 孔酶標板 無錫國盛生物工程有限公司；Infinite F50 酶標儀Tecan 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 副溶血性弧菌VP1008 和弧菌鐵蛋白受體結(jié)構(gòu)模擬 根據(jù)NCBI 中VP1008（GenBank：GI：28897782）和弧菌鐵蛋白受體（GenBank：GI：28901511）的基因序列，提交TrRosetta[22]在線服務器進行模擬，Tm 值>0.5 表明模擬質(zhì)量較高。蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋采用紅色表示，無規(guī)則卷曲采用綠色表示，β-折疊采用黃色表示。

1.2.2 副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體基因克隆 外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體的目的基因序列插入限制性酶切位點XhoⅠ、NcoⅠ后，使用軟件primer premier 5.0 設計引物，如表2。用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）提取基因組：將VP CICC21617 培養(yǎng)至對數(shù)期，3 mL VP CICC21617 菌液8000 r/min 離心5 min 后向沉淀中加入TE 緩沖液和蛋白酶K 混勻，37 ℃反應1 h，加入NaCl 溶液、CTAB/NaCl 溶液混勻，65 ℃反應15 min，加入體積比為25:24:1的酚、氯仿、異戊醇的混合物除去蛋白層物質(zhì)，加入約是上清溶液0.6 倍體積的異丙醇，冰上靜置1 h，12000 r/min 離心15 min，無菌風吹干多余水分，無菌超純水充分溶解?；蚪MDNA 作為模板，PCR 反應程序均為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，反應30 個循環(huán)，72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后切膠回收[23]。

表2 引物序列Table 2 Primers sequence

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性克隆篩選 外膜蛋白VP1008、弧菌鐵蛋白受體的目的基因VP1008 和pvuA，以及pET-28a（+）質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，通過T4 連接酶連接得到重組質(zhì)粒pET-28a（+）-VP1008 和pET-28a（+）-pvuA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)，在平板上挑取6 個單菌落做PCR 驗證，抽提重組質(zhì)粒并由生工生物測序，將測序驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主E.coliBL21（DE3），制作陽性轉(zhuǎn)化子甘油菌，保藏于?80 ℃[24]。

1.2.4 重組蛋白VP1008、弧菌鐵蛋白受體的表達與純化 將陽性轉(zhuǎn)化子的甘油菌在含100 μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h 后，用接種環(huán)挑取單菌落至50 mL 含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)14 h。陽性轉(zhuǎn)化子種子液按1%比例接種于50 mL 含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600nm0.6～0.8），向菌液中加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃、180 r/min搖床振蕩過夜。5000 r/min 離心20 min 后收集菌體，用無菌水重懸后，冰浴超聲破碎（400 W，30 min）后，8000 r/min 離心20 min 并收集上清和沉淀，用SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達情況。將蛋白包涵體用8 M 尿素變性后進行鎳柱親和層析純化。配制1 L濃度為6 mol/L 尿素溶液作為透析液，將純化蛋白轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，再將裝有純化蛋白的透析袋放入盛有提前配制好的透析液燒杯中，燒杯中放入轉(zhuǎn)子，將燒杯放在磁力攪拌器上進行磁力攪拌，4 ℃ 環(huán)境中透析12 h 后，將透析液濃度降低至3 mol/L 尿素溶液，按照同樣的方法進行透析，之后透析液濃度分別為：2、1、0.5 mol/L 尿素溶液進行梯度透析復性實驗，透析實驗結(jié)束后用Millipore 超濾管（截斷分子量：10 kDa）濃縮樣品，Bradford 法定量后凍存于?20 ℃[25]。

1.2.5 動物免疫鼠多抗制備 8 周齡的雄性BALB/c小鼠適應環(huán)境一周后，進行免疫實驗。首次免疫將重組蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體分別與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，采用背部多點注射免疫，免疫劑量為80 μg/只，兩種蛋白分別免疫10 只小鼠，空白組小鼠5 只，共計25 只小鼠。加強免疫每隔20 d 免疫一次，第二次免疫劑量為80 μg 蛋白/只，使用弗氏不完全佐劑乳化，免疫方法與首次免疫相同。第三次免疫劑量為40 μg 蛋白/只，乳化和免疫方法同第二次免疫?？瞻捉M小鼠免疫PBS，乳化和免疫方式同上。三免過后一周，對小鼠進行尾部采血，采血結(jié)束后室溫靜置30 min，離心機6000 r/min 離心15 min，上清即為抗血清，?20 ℃保存?zhèn)溆肹26]。

1.2.6 間接ELISA 法和Western blot 法測定血清效價及交叉反應 將表1 中細菌用LB 培養(yǎng)基液體（弧菌培養(yǎng)添加3% NaCl）培養(yǎng)18 h 后煮沸滅活15 min，將菌液和重組蛋白分別用碳酸鹽緩沖液稀釋到3×107CFU/mL、0.5 μg/mL 后包被96 孔酶標板，加入小鼠免疫血清（500 倍開始，3 倍梯度稀釋）37 ℃反應30 min，洗板后加入HRP 標記的羊抗鼠IgG（0.12 μg/mL）37 ℃反應30 min，洗板后加入顯色液顯色15 min，用2 mol/L H2SO4終止反應后用酶標儀測定OD450nm吸光值。用抗體稀釋液做陰性對照，當血清某一稀釋度下OD450nm與陰性對照OD450nm之比（P/N）≥2.1 時，則該稀釋度就是血清效價。用Western blot 方法檢測抗血清特異性，將表1中細菌用LB 液體培養(yǎng)基（弧菌培養(yǎng)添加3% NaCl）培養(yǎng)18 h，5000 r/min 離心20 min，超聲破碎的細菌全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE 膠分離后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氯乙烯膜（PVDF）上，37 ℃封閉2 h；加入稀釋4000 倍的小鼠抗血清后室溫反應1 h，用緩沖液洗滌3 遍后加入稀釋0.2 μg/mL的羊抗鼠二抗室溫避光反應1 h，再用緩沖液洗滌5 遍；隨后加入TMB 沉淀型底物顯色5～10 min，出現(xiàn)清晰條帶后水洗終止反應，拍照并觀察[27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定血清效價實驗，每組實驗重復三次，測得的OD450nm吸光值結(jié)果以平均值和標準偏差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Microsoft Excel 2016 軟件進行處理。血清效價以柱狀圖的形式表示，使用Origin 2019 軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體的結(jié)構(gòu)模擬

目前關于VP1008 蛋白和弧菌鐵蛋白受體蛋白的結(jié)構(gòu)相關研究較少，使用TrRosetta 模擬的蛋白結(jié)構(gòu)圖表明VP1008 和弧菌鐵蛋白受體模擬結(jié)構(gòu)的Tm 值分別為0.734 和0.789，均大于0.5，說明蛋白結(jié)構(gòu)模擬質(zhì)量較好。如圖1 所示，兩種蛋白均具有典型的β-桶狀結(jié)構(gòu)，進一步說明VP1008 蛋白和弧菌鐵蛋白受體蛋白是副溶血性弧菌外膜蛋白。

圖1 VP1008 和弧菌鐵蛋白受體蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein structure of Omp VP1008 and ferric vibrioferrin receptor

2.2 目的基因的PCR 擴增與陽性重組質(zhì)粒的篩選

外膜蛋白VP1008 基因和弧菌鐵蛋白受體pvuA的PCR 擴增產(chǎn)物（圖2）分別出現(xiàn)在1000、2000 bp 左右，與理論分子量1080 bp（VP1008）、2139 bp（pvuA）相近。將轉(zhuǎn)化后的重組質(zhì)粒進行PCR 驗證（圖3）表明，pET-28a（+）-VP1008的1、3、4、5、6 號單菌落擴增出VP1008 基因大小相近的條帶，pET-28a（+）-pvuA的1、3、4、5 號單菌落可擴增出pvuA基因大小相近的條帶。重組質(zhì)粒雙向測通序列，得到的測序結(jié)果與目的核苷酸序列對比結(jié)果（圖4），VP1008和pvuA測序基因序列（圖4a,b）分別與NCBI 數(shù)據(jù)庫中各自對應的目的核苷酸序列用軟件MEGA 進行序列對比，可以看到兩條測序核苷酸序列均有突變，但送檢質(zhì)粒核酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中目的基因核酸序列相似性均在98.5%以上，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 VP1008（a）和弧菌鐵蛋白受體pvuA（b）目的基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product of VP1008（a）and pvuA（b）

圖4 VP1008 測序基因序列（a）和弧菌鐵蛋白受體pvuA 測序基因序列（b）Fig.4 Detection of gene sequence of VP1008（a）and pvuA（b）

2.3 重組蛋白的表達與純化

誘導結(jié)果如圖5a 所示，泳道1 和泳道2 分別對應加誘導劑的空質(zhì)粒pET-28a 上清和沉淀，泳道3 和泳道4 分別對應加誘導劑的重組質(zhì)粒pET-28a（+）-pvuA上清和沉淀，泳道5 和泳道6 分別對應加誘導劑的重組質(zhì)粒pET-28a（+）-VP1008 上清和沉淀。圖中對照組加誘導劑的空質(zhì)粒pET-28a 上清（泳道1）和沉淀（泳道2）中均未見兩種蛋白目的條帶，說明空質(zhì)粒未插入目的基因不表達目的蛋白；弧菌鐵蛋白受體目的條帶在重組質(zhì)粒pET-28a（+）-pvuA上清（泳道3）中未有出現(xiàn)，而在沉淀（泳道4）中出現(xiàn)，與蛋白弧菌鐵蛋白受體理論分子量78.752 kDa大小相近；pET-28a（+）-VP1008 上清（泳道5）中未見蛋白VP1008 目的條帶，pET-28a（+）-VP1008 沉淀（泳道6）出現(xiàn)目的條帶，與VP1008 理論分子量39.325 kDa 大小相近。兩種重組質(zhì)粒誘導的上清中未出現(xiàn)目的條帶，沉淀中均出現(xiàn)目的條帶說明兩種蛋白均以包涵體形式表達。優(yōu)化IPTG 濃度和誘導溫度后也仍以包涵體形式表達。隨后用高濃度尿素分別溶解兩種包涵體后采用鎳柱進行親和層析純化（圖5b,c），圖5b 是純化后的重組弧菌鐵蛋白受體蛋白，圖5c 是純化后的重組VP1008 蛋白。將洗脫下來的蛋白進行尿素梯度透析復性，當尿素濃度降低至0.5 mol/L 后蛋白析出為不可溶狀態(tài)，最終均采用包涵體蛋白進行后續(xù)免疫。

圖5 重組蛋白誘導表達和蛋白純化結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of the recombinant proteins after IPTG induction and purification

2.4 重組蛋白的免疫血清效價和交叉反應

經(jīng)間接ELISA 檢測外膜蛋白VP1008、弧菌鐵蛋白受體、PBS 免疫的小鼠血清對重組蛋白和菌體的效價。圖6 結(jié)果顯示，蛋白VP1008 免疫的小鼠血清與副溶血性弧菌CICC 21617、CICC 21618、CICC 21528、CGMCC 1.1614、CGMCC 1.1616 反應效價為13.5 K，與副溶血弧菌CICC 21619、CICC 10552反應效價為4.5 K，與鰻弧菌、哈維氏弧菌、解藻酸弧菌、殺巖龍蝦弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、費氏另類弧菌、霍氏格力蒙特弧菌無交叉反應，與大腸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌的交叉反應效價分別為81.0、27.0、3.0 K，與免疫的VP1008 蛋白反應的效價最高達到1045.5 K。對照組小鼠對測試菌的效價均<1 K。全菌蛋白的免疫印跡結(jié)果顯示，蛋白VP1008 免疫的小鼠血清與上述7 株副溶血性弧菌的主要反應條帶在35 kDa 左右，與VP1008 理論分子量較為接近，該印跡條帶在其它弧菌中未出現(xiàn)或條帶較弱。此外，印跡顯示血清與大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、無丙二酸檸檬酸桿菌的反應條帶也主要出現(xiàn)在25～30 kDa 左右。這些蛋白與目的蛋白具有同源性反應，或者為大腸桿菌殘留蛋白，引起了與腸桿菌的交叉反應。這說明鎳柱洗脫過程中，應該收集純度更高的穿透液以減少殘留蛋白對血清交叉反應評價的影響，并通過后續(xù)細胞融合和抗體篩選中采用不同菌體包板排除這些交叉反應。

圖6 VP1008 免疫原血清效價和免疫印跡Fig.6 The antibody titer and immunoblotting results of Omp VP1008

如圖7 所示，弧菌鐵蛋白受體免疫的小鼠血清與本實驗檢測的副溶血性弧菌CICC 21618、CICC 21619、CICC 10552 反應效價為13.5 K，與副溶血弧菌 CICC 21617、CICC 21528、CGMCC 1.1614、CGMCC 1.1616 反應效價為4.5 K，與鰻弧菌、哈維氏弧菌、解藻酸弧菌、殺巖龍蝦弧菌、魔鬼弧菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、費氏另類弧菌、霍氏格力蒙特弧菌無交叉反應，與大腸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌的交叉反應效價分別為27.0、27.0、1.0 K，僅與測試弧菌中的坎氏弧菌有輕微交叉反應（1.0 K），與弧菌鐵蛋白受體蛋白反應的效價達到29524.5 K。免疫印跡結(jié)果顯示，蛋白弧菌鐵蛋白受體血清與副溶血性弧菌在25 kDa 和70 kDa 附近出現(xiàn)印跡條帶，其中在70 kDa 處發(fā)生的反應條帶與弧菌鐵蛋白受體的理論分子量較為接近，但70 kDa 左右的反應條帶微弱，說明弧菌鐵蛋白受體的免疫原性較弱或重組蛋白與天然蛋白結(jié)構(gòu)存在差異。此外，免疫印跡實驗結(jié)果中出現(xiàn)的非特異性反應條帶與本實驗所用的抗體為小鼠多抗血清也有一定關系，一般單克隆抗體識別單一表位，具有更好的特異性。

圖7 弧菌鐵蛋白受體免疫原血清效價和免疫印跡Fig.7 The antibody titer and immunoblotting results of ferric vibrioferrin receptor

3 討論與結(jié)論

近年來副溶血性弧菌感染引起的食物中毒案例呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為我國食源性疾病的首要致病菌。在免疫分析和疫苗領域，細菌外膜蛋白受到越來越多的學者關注，已有研究表明外膜蛋白通常具有較強的免疫原性，可以作為免疫檢測抗原和特異性檢測抗體[28?29]，但目前副溶血性弧菌特異性較好的表面外膜蛋白和抗體仍鮮有報道。因此發(fā)掘新型副溶血性弧菌特異性抗原對于開發(fā)快速檢測副溶血性弧菌的診斷抗體是十分重要的[30?31]。

本文利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)成功構(gòu)建了兩種新型副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體的重組質(zhì)粒，并經(jīng)誘導純化后制備出重組蛋白。兩種重組外膜蛋白經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后最終均以包涵體形式表達，這與細菌外膜蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白大小以及大腸桿菌表達系統(tǒng)特點有關。細菌外膜蛋白的β-折疊區(qū)域具有較強的疏水性，常規(guī)大腸桿菌表達系統(tǒng)的折疊速度較快，部分外膜蛋白未能正確折疊形成包涵體，尤其是分子量較大的蛋白。外膜蛋白VP1008 免疫血清對副溶血性弧菌的整體效價比弧菌鐵蛋白受體免疫血清高，但兩種重組蛋白的鼠多抗對副溶血性弧菌的效價均不高（4.5～13.5 K），一方面可能因為重組蛋白以包涵體形式表達，結(jié)構(gòu)上存在一定差異。另一方面可能是副溶血性弧菌表面的莢膜（K 抗原）等多糖抗原影響了蛋白的暴露。莢膜是副溶血性弧菌的主要抗原，已有報道莢膜的長度在100～500 nm 之間[32]，可以保護細胞逃避免疫系統(tǒng)和抗體（10 nm 左右）的識別[33]。后續(xù)研究將通過莢膜突變菌株來進一步驗證莢膜對免疫血清識別的影響。血清與其它細菌特異性方面，本研究測試了與多株副溶血性弧菌、序列同源性較高的部分弧菌及海洋細菌等的交叉反應，VP1008的免疫血清與對不同來源的副溶血性弧菌具有良好的識別性，與其它測試弧菌均無交叉反應，弧菌鐵蛋白受體免疫血清也僅與坎氏弧菌有輕微交叉，這與序列同源性分析結(jié)果有一定差異，可能與蛋白的保守序列位于細胞膜內(nèi)或被弧菌莢膜等表層多糖掩蓋有關。以往副溶血性弧菌外膜蛋白的免疫原性研究發(fā)現(xiàn)OmpK、OmpU、OmpW 等弧菌保守性外膜蛋白的免疫血清具有弧菌屬內(nèi)交叉反應[14?16]；最近，王亞磊等[34]的研究發(fā)現(xiàn)OmpA 重組蛋白免疫血清可與不同血清型的副溶血性弧菌發(fā)生特異性反應,而與其他非副溶血性弧菌無交叉反應,提示OmpA 可能是副溶血性弧菌的特異性抗原。

免疫印跡中抗弧菌鐵蛋白受體蛋白血清與副溶血弧菌全菌蛋白發(fā)生反應條帶應該出現(xiàn)在78 kDa（理論分子量）處，圖上顯示反應條帶出現(xiàn)在70 kDa處，抗VP1008 血清與副溶血弧菌以及重組蛋白VP1008 反應條帶應出現(xiàn)在40 kDa 處，免疫印跡顯示反應條帶出現(xiàn)在35 kDa 處，與理論有所偏差。王亞磊等[34]的研究成功表達、純化了可溶性的副溶血性弧菌外膜蛋白OmpA，其蛋白分子理論分子量為33.8 kDa，免疫印跡產(chǎn)生的特異性條帶表觀分子量約36 kDa，說明這種實際誤差是客觀存在的。

本研究首次構(gòu)建了副溶血性弧菌新型差異性外膜蛋白VP1008 和弧菌鐵蛋白受體的PET-28a 重組質(zhì)粒，誘導純化后獲得了2 種重組蛋白包涵體。小鼠免疫和血清評價表明，重組外膜蛋白VP1008的鼠多抗對7 株副溶血性弧菌菌體均有一定效價，對其它測試的10 種弧菌的特異性也較好，說明外膜蛋白VP1008 具有較好的序列特異性及與菌體的反應性，可用于進一步制備副溶血性弧菌檢測抗體。同時，兩種重組蛋白免疫血清與副溶血性弧菌菌體的效價均未達到27 K，這可能與副溶血性弧菌莢膜等多糖抗原的位阻作用等有關，具體有待進一步研究證實。本研究為建立新型副溶血性弧菌免疫檢測方法提供了理論和數(shù)據(jù)基礎。