劉曉柱，張遠(yuǎn)林，李銀鳳，于志海，黃名正

（貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550000）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是一種兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，廣泛分布于我國(guó)西南地域，如貴州、四川、重慶等[1]。目前對(duì)刺梨的研究主要集中活性成分[2]、香氣特性[3]以及基因功能[4]等領(lǐng)域的研究，而對(duì)刺梨微生物資源的篩選、鑒定及應(yīng)用等方面的研究還比較少。謝丹等[5]、劉曉柱等[6]采用高通量測(cè)序方法分析了刺梨果渣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化；劉曉柱等[7]結(jié)合了高通量測(cè)序技術(shù)鑒定了刺梨自然發(fā)酵過(guò)程中非釀酒酵母多樣性變化，并采用純培養(yǎng)技術(shù)從中分離到5 類可培養(yǎng)非釀酒酵母菌。趙湖冰等[8]、劉曉柱等[9]則深入分析了刺梨葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的生理特性，并采用混合接種形式進(jìn)行了刺梨果酒的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)接種刺梨野生酵母影響刺梨果酒的基本理化特性，并可調(diào)節(jié)刺梨果酒的香氣特性。上述研究表明，刺梨果實(shí)上蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，亟待進(jìn)一步深入的研究。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及其含量是食品飲料的一項(xiàng)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[10?11]。然而水果中的一些風(fēng)味物質(zhì)通常以穩(wěn)定的前體形式存在，只有這些風(fēng)味前體物質(zhì)被水解，其芳香類配體風(fēng)味物質(zhì)才能被釋放出來(lái)[12]。β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）是一類可水解含β-D-葡萄糖苷鍵底物的水解酶，能夠釋放出具有香氣特性游離糖苷配體，促進(jìn)香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，被廣泛用于果汁、果酒等食品領(lǐng)域的增香[13?15]。β-葡萄糖苷酶普遍存在于微生物細(xì)胞中，具有酶活性高、底物特異性強(qiáng)、易純化等特點(diǎn)，近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注[16]。但目前分析β-葡萄糖苷酶對(duì)刺梨果酒香氣特性影響方面的研究還比較少。

課題組前期從“貴農(nóng)五號(hào)”刺梨果實(shí)上分離保存的酵母菌資源庫(kù)中篩選到一株產(chǎn)β -葡萄糖苷酶異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）?；瘜W(xué)誘變因其誘變率高、操作簡(jiǎn)單而被廣泛用于各類微生物的選育研究中[17]。本研究采用化學(xué)誘變方法對(duì)一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶W.anomalus菌株進(jìn)行化學(xué)誘變，進(jìn)一步提高其β-葡萄糖苷酶活性。將該菌株及其誘變高產(chǎn)β -葡萄糖苷酶菌株用于發(fā)酵刺梨果酒，頂空固相微萃取-氣相質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)刺梨果酒揮發(fā)性香氣成分，進(jìn)而分析β -葡萄糖苷酶對(duì)刺梨果酒香氣特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

W.anomalusC4 菌株分離于“貴農(nóng)五號(hào)”刺梨，保存于本實(shí)驗(yàn)室;釀酒酵母ZYMAFLORE X16（S.cerevisiaeX16） 法國(guó)LAFFORT 公司；對(duì)硝基苯基-β-D 吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-D-glucopyranoside，p-NPG）、對(duì)硝基苯酚木糖苷（p-nitrophenolxyloside，p-NPX）、對(duì)硝基苯酚阿拉伯呋喃糖苷（pnitrophenolarabinoglycoside，p-NPAG）、對(duì)硝基苯酚鼠李糖苷（p-nitrophenolrhamnoside，p-NPR）、甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）、環(huán)己酮 分析純，上海源葉生物科技有限公司；果膠酶（食品級(jí)，500 U/mg）、偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖以及其它常規(guī)試劑 試劑純，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

GR60DA 型高壓蒸汽滅菌鍋 北京盛科信德科技有限公司；H5300 型紫外分光光度計(jì) 日本日立公司;雷磁PHSJ-3F 型pH 儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZD-85A 型恒溫?fù)u床 常州朗越儀器制造有限公司；DHP-420 型恒溫培養(yǎng)箱 天津天泰儀器有限公司；SA402B 型電子舌味覺(jué)分析系統(tǒng) 日本INSENT 公司;TQ8040NX 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀日本島津儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 YPD 培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固體培養(yǎng)基另加入瓊脂粉20 g/L，pH 自然，115 ℃，0.1 MPa 滅菌30 min，備用。

馬鈴薯葡糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 自然，115 ℃，0.1 MPa 滅菌30 min，備用。

1.2.2 菌株活化 將?80 ℃保存的W.anomalusC4菌株、S.cerevisiaeX16 菌株劃線于YPD 固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，4 ℃保存，用于菌株的誘變及刺梨果酒的發(fā)酵。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定參考劉曉柱等[9]方法，以S.cerevisiaeX16 菌株為對(duì)照，每組平行重復(fù)3 次。

1.2.4 菌株化學(xué)誘變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的W.anomalusC4 菌株培養(yǎng)液，4000 r/min 離心收集菌體細(xì)胞，生理鹽水洗滌2 次，菌體細(xì)胞懸浮于生理鹽水中使其濃度為108CFU/mL。

參考溫智慧等[18]方法對(duì)W.anomalusC4 菌株進(jìn)行化學(xué)誘變。取制備好的W.anomalusC4 菌懸液，加入EMS 使其終濃度分別為0%、1%、2%、3%。28 ℃溫育1 h。4000 r/min 離心收集細(xì)胞，棄上清至廢液收集瓶中。重懸細(xì)胞于5%硫代硫酸鈉溶液中，洗滌2 次，然后再把菌體懸浮于生理鹽水中，并稀釋成10?1～10?5濃度，涂布于YPD 固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，計(jì)算EMS 誘變致死率。致死率（%）=（對(duì)照組菌落數(shù)?處理組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)。

1.2.5 突變菌株篩選 初篩：將EMS 誘變后的W.anomalusC4 菌株單克隆，挑至以p-NPG 為底物的96 孔板PDA 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，加入1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，觀察各孔顯色情況，挑選顏色較深的菌落繼續(xù)進(jìn)行復(fù)篩檢測(cè)。

復(fù)篩：挑取初篩顯色較深的W.anomalusC4 菌株單克隆至YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)72 h，4000 r/min 離心收集上清液，作為粗酶液，用于測(cè)定菌株糖苷酶活性。

1.2.6 糖苷酶活性測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定按照參考文獻(xiàn)方法[19]進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為pH5.0、50 ℃條件下，1 min 水解p-NPG 產(chǎn)生1 μmol p-NP 所需酶量。

分別取300 μL 粗酶液于1.5 mL 離心管中，a.加入100 μL p-NPX、37 ℃反應(yīng)1 h，加入1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，靜置5 min，400 nm 處測(cè)定OD 值，計(jì)算菌株β-D-木糖苷酶活性；b.加入300 μL p-NPAG 底物溶液，37 ℃反應(yīng)30 min，加入1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，靜置15 min，405 nm 處測(cè)量OD 值，計(jì)算菌株α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性；c.加入150 μL p-NPR，45 ℃水浴保溫20 min，加入 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，靜置15 min、測(cè)量OD405值，計(jì)算菌株α-L-鼠李糖苷酶活性。

相對(duì)酶活（relative enzyme activity,REA）計(jì)算如公式1 所示：

式中：EAs，各實(shí)驗(yàn)組酶活；EAc，各對(duì)照組酶活。

突變菌株的酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，以突變前菌株的酶活為對(duì)照；

1.2.7 菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將誘變后產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)8 代，每一代培養(yǎng)條件為：28 ℃，180 r/min，培養(yǎng)72 h，以第一代菌株的酶活為對(duì)照，按照1.2.6 方法測(cè)定各代菌株β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性。

1.2.8 不同酵母菌發(fā)酵刺梨果酒的制備 取新鮮成熟刺梨，榨汁，加入100 mg/L的偏重亞硫酸鉀、20 mg/L的果膠酶過(guò)夜處理，加入白砂糖調(diào)整糖度至24°Brix，分成五組，置于2 L 無(wú)菌三角瓶中，每組平行重復(fù)三次。第一組（S.cerevisiaeX16 組）：接種107CFU/mL的S.cerevisiaeX16；第二組（W.anomalusC4 組）：接種108CFU/mL的W.anomalusC4 酵母；第三組（W.anomalusE3 組）：接種108CFU/mL的W.anomalusE3酵母；第四組（S.cerevisiaeX16+W.anomalusC4 組）：同時(shí)接種108CFU/mL的W.anomalusC4 菌株和107CFU/mL的S.cerevisiaeX16；第五組（S.cerevisiaeX16+W.anomalusE3 組）：同時(shí)接種108CFU/mL的W.anomalusE3 菌株和107CFU/mL的S.cerevisiaeX16 菌株。各組于25 ℃恒溫靜置發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，取刺梨原酒，5000 r/m 離心10 min，取上清用于各種指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.9 刺梨果酒相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.9.1β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定 在刺梨果酒發(fā)酵過(guò)程中，于發(fā)酵第0、2、4、6、8、10、12、14、16 d 分別取樣，以第10 d的酶活為對(duì)照，采用1.2.6 方法檢測(cè)刺梨果酒發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶相對(duì)酶活的變化。

1.2.9.2 刺梨果酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定 刺梨果酒酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸含量的測(cè)定采用酒類國(guó)際檢測(cè)分析方法進(jìn)行[20]；pH 測(cè)定采用pH 計(jì)進(jìn)行。

1.2.9.3 刺梨果酒感官特性的測(cè)定 量取各組刺梨酒80 mL，加入至電子舌專用燒杯中，按照電子舌系統(tǒng)儀器使用說(shuō)明書(shū)對(duì)各組刺梨果酒進(jìn)行檢測(cè)。采樣時(shí)間為120 s，采樣速度為1 次/s，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，每個(gè)平行重復(fù)采集4 次[8]。

1.2.9.4 刺梨果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測(cè)定[21]量取8 mL 各組刺梨果酒，加入1.0 g NaCl、50 μL 環(huán)己酮內(nèi)標(biāo)（273.5 mg/L），密封置于45 ℃水浴中，平衡30 min。插入固相微萃取頭對(duì)揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行頂空萃取，萃取結(jié)束后，將萃取頭插入GC 進(jìn)樣口進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分的解吸附。

GC 條件：進(jìn)樣口溫度240 ℃，進(jìn)樣時(shí)間2 min，不分流進(jìn)樣，載氣為氦氣，恒線速度模式（35 cm/s），吹掃流速3 mL/min，分流比20:1。色譜柱為InertCap Wax 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃保持3 min，3 ℃/min 升至230 ℃，保持8 min。

MS 條件為：EI 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，全掃描模式（Q3 Scan），溶劑延遲2 min。

揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS 分析后，通過(guò)與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫(kù)進(jìn)行匹配，從而對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析；揮發(fā)性成分的定量分析采用內(nèi)標(biāo)法，計(jì)算公式如公式2 所示：

式中：As，內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai，未知物的峰面積；ρs，內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/mL；ρi，未知物的質(zhì)量濃度，μg/mL。

香氣活力值的計(jì)算：查閱各揮發(fā)性香氣成分閾值，計(jì)算各香氣成分風(fēng)味活性值（odour activity value，OAV）。計(jì)算公式如公式3 所示：

式中：Ci為香氣成分質(zhì)量濃度，μg/mL；OTi為香氣成分閾值，mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析

Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖；數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線

W.anomalusC4 菌株的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示，包含了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。其中0～4 h 為適應(yīng)期，4～20 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h 以后為穩(wěn)定期。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（12 h）進(jìn)行EMS 化學(xué)誘變實(shí)驗(yàn)。

圖1 W.anomalus C4 菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of W.anomalus C4

2.2 誘變濃度的選擇

不同濃度誘變劑EMS 對(duì)W.anomalusC4 菌株致死率如圖2 所示，隨著EMS 濃度增加，菌株致死率增大。EMS 濃度為1%時(shí)，菌株致死率為81%，濃度為2%時(shí)，致死率達(dá)到93%，而3%的EMS 致死率達(dá)到100%。通常情況下，75%～85%的致死率，正突變率較高，有利于篩選到優(yōu)良性狀菌株[22]。因此本研究選擇1%的EMS 作為誘變濃度。

圖2 不同濃度EMS 對(duì)W.anomalus C4 菌株致死率影響Fig.2 Effects of different concentrations of EMS on the fatality rate of W.anomalus C4

2.3 突變菌株的篩選

采用p-NPG 法對(duì)EMS 誘變的W.anomalusC4 菌株進(jìn)行篩選，得到三株β-葡萄糖苷酶酶活性較高菌株，編號(hào)為D7、E3、F7的酶活為（48.96±0.95）、（55.05±0.74）、（54.25±0.26）U/L（圖3）。其中E3 菌株酶活最高，較出發(fā)菌株W.anomalusC4（41.80±0.25）U/L 提高了31.70%，因而選擇E3 菌株做后續(xù)分析。

圖3 三株突變菌株β-葡萄糖苷酶活性Fig.3 β-glucosidase activity of three mutant strains

與出發(fā)菌株W.anomalusC4 相比，EMS 誘變明顯提高了W.anomalusE3 菌株的β-葡萄糖苷酶活性。W.anomalusE3 菌株的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-D-木糖苷酶以及α-L-鼠李糖苷酶活性與親本W(wǎng).anomalusC4 菌株相比，沒(méi)有顯著差別（圖4）。

圖4 W.anomalus E3 菌株糖苷酶活性分析Fig.4 Analysis of glucosidase production of W.anomalus E3 strain

2.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將W.anomalusE3 菌株傳代培養(yǎng)，各代菌株β-葡萄糖苷酶活性如圖5 所示，菌株W.anomalusE3 傳至8 代，各代菌株的β-葡萄糖苷酶均保持著較高的活性，且與親本菌株W.anomalusC4 之間無(wú)顯著性差異，因此菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶遺傳穩(wěn)定性較好。

圖5 W.anomalus E3 菌株β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性分析Fig.5 Stability analysis of β-glucosidase production of W.anomalus E3

2.5 W.anomalus E3 菌株對(duì)刺梨果酒品質(zhì)影響

2.5.1β-葡萄糖苷酶活性變化 刺梨果酒發(fā)酵過(guò)程中，β-葡萄糖苷酶活性變化如圖6 所示，在發(fā)酵的前10 d，β-葡萄糖苷酶活性逐漸增加，第10 d 達(dá)到最大值。接著，β-葡萄糖苷酶活性迅速降低，直至發(fā)酵終點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，低于10%（V/V）的乙醇可提高β-葡萄糖苷酶活性，而高于10%（V/V）的乙醇則抑制β-葡萄糖苷酶活性[23]。因而在刺梨果酒發(fā)酵第10 d，其發(fā)酵液中乙醇濃度可能為10%（V/V）左右，故β-葡萄糖苷酶活性達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，發(fā)酵液中乙醇濃度繼續(xù)增大，則反過(guò)來(lái)抑制β-葡萄糖苷酶活性。當(dāng)然，其它因素也可能影響β-葡萄糖苷酶活性，如發(fā)酵液中葡萄糖也可調(diào)節(jié)β-葡萄糖苷酶的活性，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，葡萄糖被不斷分解利用，其抑制效果逐漸被解除，β-葡萄糖苷酶活性逐漸增大，在發(fā)酵第10 d 葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)逐漸被耗盡，菌體活性受到影響，故而β-葡萄糖苷酶活性逐漸降低。

圖6 刺梨果酒發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活性變化分析Fig.6 Changes of β-glucosidase activity during the fermentation of Rosa roxburghii wine

2.5.2 刺梨果酒基本理化指標(biāo) 各組刺梨果酒基本理化參數(shù)如表1 所示，接種W.anomalusC4、W.anomalusE3 可明顯降低發(fā)酵刺梨果酒的酸度值（總酸含量、揮發(fā)酸含量和pH）以及總糖含量。研究表明，接種純種W.anomalus可降低空心李果酒總酸含量，但混合接種發(fā)酵空心李果酒總酸含量則沒(méi)有明顯降低[21]。Ye 等[24]采用純種W.anomalus以及與S.cerevisiae混合發(fā)酵的蘋(píng)果酒（Cider）總酸含量也表現(xiàn)出明顯降低的特點(diǎn)。推測(cè)W.anomalus菌株具有降低發(fā)酵果酒酸度特性。

表1 刺梨果酒基本理化指標(biāo)值Table 1 Physical and chemical indicators of R.roxburghii wine

2.5.3 刺梨果酒電子感官特性 各組發(fā)酵刺梨果酒電子感官特性結(jié)果如圖7 所示，除酸味值外，各組發(fā)酵刺梨果酒在苦味、澀味、后味、鮮味、豐富度以及咸味之間無(wú)區(qū)別。釀酒酵母發(fā)酵刺梨果酒酸度高于其它四組刺梨果酒。

圖7 刺梨果酒電子感官特性Fig.7 Electronic sensory properties of R.roxburghii wine

2.5.4 刺梨果酒揮發(fā)性香氣特性 采用HS-SPMEGC-MS 方法分析了各組刺梨果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類與含量。S.cerevisiaeX16 發(fā)酵刺梨果酒中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最少，為26 種；接種W.anomalusC4 菌株或E3 菌株發(fā)酵刺梨果酒揮發(fā)性物質(zhì)種類增多，W.anomalusC4 組、W.anomalusE3 組、S.cerevisiaeX16+W.anomalusC4 組、S.cerevisiaeX16+W.anomalusE3 組分別為46、47、56、48 種。

酯類化合物為各類發(fā)酵果酒中重要的香味物質(zhì)，通常具有花香和水果香[25]。接種W.anomalus可顯著增加刺梨果酒中酯類香氣化合物的含量，其中接種純種W.anomalusE3 組刺梨果酒酯類香氣物質(zhì)含量最高。乙酸乙酯是發(fā)酵果酒中最主要的酯類香氣化合物之一，具有菠蘿、甜果香味，閾值150 mg/L 左右[26]。在葡萄酒中，乙酸乙酯含量在80 mg/L 左右時(shí)，可較好的賦予葡萄酒水果香味，還可以增加酒體的復(fù)雜性。采用純種S.cerevisiaeX16 發(fā)酵生產(chǎn)的刺梨果酒中未檢測(cè)到乙酸乙酯，而四組接種W.anomalus發(fā)酵生產(chǎn)的刺梨果酒中乙酸乙酯含量均顯著增加，其中接種純種W.anomalusC4 發(fā)酵的刺梨果酒中乙酸乙酯含量最高，為（33.84±2.51）mg/L。研究表明，W.anomalus是乙酸乙酯良好的生產(chǎn)者，某些菌株合成的乙酸乙酯高達(dá)150 mg/L。乙酸乙酯的閾值為（150～200）mg/L，但過(guò)高濃度的乙酸乙酯則使得酒體具有腐敗特性[27]。本研究中，接種W.anomalus生產(chǎn)的刺梨果酒，其乙酸乙酯濃度為30 mg/L 左右，因而有助于增加刺梨果酒的水果香味特性。

醇類化合物由酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌代謝產(chǎn)生，對(duì)酒體的香氣特性具有重要影響[28]。接種純種W.anomalusC4、W.anomalusE3 菌株以及混合接種W.anomalusC4 菌株，均明顯提高了刺梨果酒中醇類香氣化合物的含量（圖8）。但混合接種W.anomalusE3酵母，發(fā)酵刺梨果酒中醇類香味化合物未顯著提高。

圖8 刺梨果酒揮發(fā)性香氣化合物含量Fig.8 Volatile aroma compounds contents of R.roxburghii wine

研究表明，提高β-葡萄糖苷酶活性可促進(jìn)萜烯類化合物的釋放[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，與親本W(wǎng).anomalusC4菌株（0.83±0.05）mg/L 相比，化學(xué)誘變提高β-葡萄糖苷酶活性，可使W.anomalusE3 菌株（1.16±0.09）mg/L發(fā)酵刺梨果酒中芳樟醇含量提高。但接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株（W.anomalusC4、E3）發(fā)酵的刺梨果酒中僅檢測(cè)到芳樟醇這一種萜烯類化合物，未發(fā)現(xiàn)其它類的萜烯類化合物，其原因還需要做進(jìn)一步的分析。

此外，接種純種W.anomalusC4 菌株、混合接種W.anomalusC4 菌株明顯提高發(fā)酵刺梨果酒中其它類化合物的含量。因而接種W.anomalusC4 菌株、E3菌株顯著可增加刺梨果酒中揮發(fā)性酯類、醇類以及其它類物質(zhì)含量，降低揮發(fā)性酸類物質(zhì)含量（圖8）。

進(jìn)一步分析各組發(fā)酵刺梨果酒的主要風(fēng)味化合物OAV 值，從而評(píng)價(jià)不同發(fā)酵方式對(duì)刺梨果酒香氣特性貢獻(xiàn)度[30?31]。OAV 大于1 時(shí)，表明該化合物對(duì)酒體香氣貢獻(xiàn)度突出，反之OAV 小于1，該化合物對(duì)酒體香氣貢獻(xiàn)度不突出[15]。S.cerevisiaeX16 純種發(fā)酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為12 種，接種W.anomalusC4 菌株發(fā)酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，接種W.anomalusE3 菌株發(fā)酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，共同接種S.cerevisiaeX16 與W.anomalusC4 菌株發(fā)酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，共同接種S.cerevisiaeX16 與W.anomalusE3 菌株發(fā)酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為16 種。與接種S.cerevisiaeX16 組相比，接種W.anomalus可顯著增加芳樟醇、正己醇、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、乙酸己酯等香氣化合物的OAV。相反，乳酸乙酯化合物的OAV 在接種W.anomalus組中明顯降低表2。

表2 不同酵母發(fā)酵刺梨果酒主要風(fēng)味化合物OAV 值Table 2 The odour activity values（OAVs）for main compounds of R.roxburghii wine fermentation with different yeasts

3 結(jié)論

采用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯，誘變得到一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性能穩(wěn)定，酶活為（55.05±0.74）U/L的突變菌株W.anomalusE3。與W.anomalusC4菌株相比，W.anomalusE3 菌株酶活提高了31.70%。在刺梨果酒發(fā)酵過(guò)程中，W.anomalus β-葡萄糖苷酶活性逐漸增大，第10 d 達(dá)到最大值，然后迅速降低。接種W.anomalusC4、及其突變菌株E3 可降低刺梨果酒包括總酸含量、揮發(fā)酸含量、pH 在內(nèi)的酸度值以及總糖含量；同時(shí)還可增加刺梨果酒中揮發(fā)性酯類、醇類物質(zhì)的種類和含量以及主要香氣成分風(fēng)味活性值（OAV）。因此，接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶W.anomalus菌株有助于調(diào)節(jié)刺梨果酒的香氣特性，增加刺梨果酒的復(fù)雜性和豐富度。