崔心禹，夏 琛，金 蒙，蘇 遠(yuǎn)，吳曉琴，沈建福

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

5α-還原酶（5α-Reductase,5α-R）是重要的雄性激素代謝酶，睪酮（Testosterone,T）在5α-還原酶（5α-R）的作用下不可逆地轉(zhuǎn)化雙氫睪酮（Dihydrotestosterone,DHT），過(guò)程中還要依賴(lài)還原性輔酶II（NADPH）[1?2]，如圖1 所示。DHT 是最強(qiáng)的活性雄性激素，因?yàn)樗c雄性激素受體（Androgen receptor,AR）的親和性比T 高2～5 倍，誘導(dǎo)AR 信號(hào)傳導(dǎo)的效力比T 高10 倍[3?4]可引發(fā)雄性激素依賴(lài)性疾病比如痤瘡、雄激素源性脫發(fā)、女性多毛癥、前列腺癌、前列腺增生、假兩性畸形等[5?6]。

圖1 5α-R的作用機(jī)理Fig.1 Catalytic reaction process of 5α-R

5α-R 是皮膚中最重要的雄性激素代謝酶，它具有三種同工酶，其中I 型和II 型酶的特征比較清楚，二者的主要區(qū)別為5α-RI 主要存在于肝臟及非生殖器官皮膚，其發(fā)揮生理作用的最適pH 為范圍較寬為6～9，而5α-RII 主要存在前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊等，其最適pH 為5.5[7?11]。

目前已開(kāi)發(fā)的5α-R 抑制劑包括甾體類(lèi)和非甾體類(lèi)，最常見(jiàn)藥物如非那雄胺、度他雄胺、愛(ài)普列特等。但這些藥物存在不良反應(yīng)，如代表性藥物非那雄胺可能對(duì)男性造成抑郁、焦慮、認(rèn)知障礙、勃起障礙、性欲減退、男性乳房女子化、肌肉生長(zhǎng)受損等副作用[12?13]，統(tǒng)稱(chēng)為非那雄胺后綜合征（Post-finasteride syndrome,PFS）[14]。這些副作用是這類(lèi)藥物本身固有的，難以通過(guò)改造結(jié)構(gòu)來(lái)消除，因此從天然植物中尋找安全、有效且來(lái)源廣泛的5α-R 抑制劑替代這些化學(xué)合成的抑制劑已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Niederprüm 等[15]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鋸葉棕果實(shí)提取物具有5α-R 抑制活性以及治療前列腺增生的效果。Weisser 等[16]發(fā)現(xiàn)鋸葉棕提取物IDS 89 對(duì)人前列腺上皮和間質(zhì)中的5α-R 具有抑制作用，且屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，有效成分是可皂化亞組分中的月桂酸，它對(duì)上皮和基質(zhì)的最大抑制率分別為52%和45%。鄧桂球等[17]從雌性大鼠肝臟、雄性大鼠附睪組織中分別提取I 型、Ⅱ型5α-R，采用HPLC 法測(cè)定出紅花提取物對(duì)I 型、Ⅱ型5α-R 活性均有抑制效果，抑制率分別達(dá)到88.12%和61.65%。另外也有研究報(bào)道大黃[18]非洲臀果木[19]、大蕁麻[20]、薰衣草[21]、蓮子心[22?23]等植物的提取物具有良好的5α-R 抑制活性，是天然來(lái)源的5α-R 抑制劑。

油茶葉是山茶科植物油茶Camellia oleifera的葉，《中華本草》中提到其味微苦，性平，有治療鼻衄，皮膚潰爛瘙癢，瘡疽的功效。羅曉偉等[24]已經(jīng)證明油茶蒲具有5α-R 抑制活性，油茶葉與油茶蒲同為油茶的重要組成部分，推測(cè)油茶葉與油茶蒲可能具有類(lèi)似的生物活性。本文以5α-R 為研究靶點(diǎn)，旨在探究油茶葉提取物對(duì)5α-R 活性的影響，探討其成為潛在的5α-R 抑制劑的可能性，并分析其化學(xué)成分，為其在治療雄性激素依賴(lài)型疾病如痤瘡、前列腺癌等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮采摘的油茶葉 浙江省江山市江山之間生物科技有限公司提供；SPF 級(jí)別雄性大鼠4 只，體重（200±20）g 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，許可證編號(hào)SCXK（浙）2019-0002；還原型輔酶II、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；度他雄胺、睪酮、沒(méi)食子酸、蘆丁分析對(duì)照品 上海阿拉丁試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇等有機(jī)試劑 均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Waters e2695 高效液相色譜、Acquity TM Ultra 型超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters 公司；Luna C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm） 美國(guó)Phenomenex 公司；Ultimate UHPLC LP-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm,1.8 μm） 上海月旭科技股份有限公司；Sciex Triple TOF 5600+四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶提取物的制備以及5α-R 含量的測(cè)定 參考張蓓[25]的方法并稍作修改，取雄性大鼠4 只，禁食不禁水過(guò)夜后脫臼處死。迅速取肝臟，剝離脂肪組織，稱(chēng)重，剪碎，置于燒杯，加入預(yù)冷的提酶緩沖液（提酶緩沖液[26]：0.32 mol/L 蔗 糖；0.1 mmol/L DTT；1 mmol/L EDTA；20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液pH7.4）按照1:4（w/v）的比例在冰水浴中用勻漿器勻漿，制成勻漿液，然后將其分裝至離心管，在4 ℃、10000×g條件下離心20 min，除去漂浮的脂肪，取上層液體，同樣條件下再離心1 h，上清液即為微粒體粗提取物。采用Bradford 法[11]對(duì)粗酶提取物定量，以其總蛋白質(zhì)含量表示5α-R的含量。

1.2.2 5α-R 酶促反應(yīng)體系的建立與5α-R 活性測(cè)定

1.2.2.1 T 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 配制系列濃度T 溶液：5～2000 μmol/L，將不同濃度T 溶液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾至液相瓶，進(jìn)入高效液相色譜儀檢測(cè)，以峰面積A（AU*min）為縱坐標(biāo)，以T 濃度C（μmol/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

液相色譜條件：色譜柱：LunaC18（2）柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）不銹鋼柱；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇/水70/30（V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：242 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.2.2 5α-R 酶促反應(yīng)體系的建立 在1000 μL 測(cè)活體系中[27]，將300 μL PBS 緩沖液（pH7.4）、500 μL粗酶提取物稀釋液、50 μL T、50 μL 50%乙醇、100 μL NADPH 按順序添依次加至離心管，于旋渦混合儀快速混合均勻3 s，37 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)30 min，在t0時(shí)刻與t30時(shí)刻快速分別取樣400 μL，快速加入800 μL 甲醇（甲醇起到失活蛋白酶的作用），渦旋5 s 終止反應(yīng)[17]。上述反應(yīng)液在12000 r/min離心15 min，除蛋白，取上清液，0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾至液相瓶，待檢測(cè)。

1.2.2.3 5α-R 活性測(cè)定 HPLC 檢測(cè)比較反應(yīng)前t0時(shí)刻與反應(yīng)后t30時(shí)刻T 峰面積的變化，液相色譜條件同1.2.2.1。將T 峰面積帶入T 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出相應(yīng)濃度，以及T 濃度的變化量，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)定5α-R的活性。設(shè)置不同的反應(yīng)管包括：空白對(duì)照管（酶提取物用甲醇失活）、酶正常反應(yīng)管、陽(yáng)性對(duì)照管（50%乙醇換成度他雄胺溶液）。

計(jì)算公式如下：

式中，Ct0表示0 min 時(shí)T 濃度，Ct30表示30 min時(shí)T 濃度，ΔT 表示反應(yīng)前后T 濃度的差值。

式中，定義5α-R 活性（μmol T/（g prot·30 min））為每克酶提取物每30 min 轉(zhuǎn)化T的量，C5α-R（g/L）表示5α-R 粗提取物的濃度，即5α-R 粗提取物蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.3 5α-R 酶促反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.3.1 反應(yīng)體系中NADPH、T、粗酶提取物適宜添加濃度的確定 將NADPH 用PBS 配制成一系列梯度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性測(cè)定方法，在固定5α-R 提取物濃度為0.76 mg/mL、T 濃度為1 mmol/L的條件下，以5α-R 活性為指標(biāo)，考察NADPH的適宜添加濃度。

將T 配制成一系列梯度：0.1、0.4、1.0、1.5、2.0 mmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性測(cè)定方法，在固定 5α-R 提取物濃度 為 0.76 mg/mL，NADPH 濃度為2 mmol/L的條件下，以5α-R 活性為指標(biāo)，考察T的適宜添加濃度。

以蛋白質(zhì)濃度表示粗酶提取物的濃度，將其用PBS（pH7.4）緩沖液稀釋成系列梯度：0.38、0.76、1.52、3.08、6.16 mg/mL，采用1.2.2 中提到的5α-R活性測(cè)定方法，在固定T 濃度為2 mmol/L，NADPH濃度為2 mmol/L的條件下，以5α-R 活性為指標(biāo)，考察粗酶提取物的適宜添加濃度。

1.2.3.2 反應(yīng)體系穩(wěn)定性的考察 確定最終反應(yīng)體系各個(gè)組分濃度條件：0.76 mg/mL 粗酶提取物500 μL，2 mmol/L T 50 μL，樣品50 μL，2 mmol/L NADPH 100 μL，分別測(cè)定四次空白對(duì)照管和酶正常反應(yīng)管的T 濃度變化，考察反應(yīng)體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性，計(jì)算相對(duì)偏差RSD。

1.2.3.3 度他雄胺5α-R 抑制活性的測(cè)定 度他雄胺是Ⅰ型5α-R 抑制劑，將其為陽(yáng)性藥物并稀釋成系列梯度：2、4、6、8、12、16 nmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性測(cè)定方法，在適宜的NADPH 濃度、T 濃度、粗酶提取物濃度條件下，把50%乙醇溶液替換成系列濃度的度他雄胺溶液，考察不同濃度度他雄胺對(duì)5α-R 活性的抑制率，繪制抑制曲線(xiàn)，計(jì)算出度他雄胺對(duì)5α-R 活性的半抑制濃度（IC50），公式如下：

1.2.4 油茶提取物的制備及5α-R 抑制活性的測(cè)定

1.2.4.1 不同溶劑油茶葉提取物的制備及得率的計(jì)算 油茶葉經(jīng)過(guò)挑選去除病變?nèi)~后，45 ℃烘箱干燥，粉碎過(guò)60 目篩，稱(chēng)取8 份20 g 油茶葉粉末按1:40（w:v）料液比分別加入水、50%乙醇溶液、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚，先攪拌浸泡3 h 再于50 ℃下超聲振蕩提取兩次（2 h/次），4000 r/min 離心10 min 使得固液分離，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮除去有機(jī)試劑，然后真空冷凍干燥，得到不同極性溶劑的油茶粗提取物分別記為A1～A8，觀(guān)察其顏色及性狀，并計(jì)算得率，計(jì)算公式如下：

式中，m 為提取物的質(zhì)量（g），M 為原料干基質(zhì)量（g）。

1.2.4.2 油茶葉提取物5α-R 抑制活性的測(cè)定 分別取A1～A8 凍干粉末，用50%乙醇均配制成200 μg/mL的稀釋液，按照1.2.2 測(cè)定A1～A8 稀釋液對(duì)5α-R的抑制率，以5α-R 抑制率為指標(biāo)，確定最佳制備溶劑，并測(cè)定、計(jì)算最佳溶劑提取物對(duì)5α-R 活性的半抑制濃度（IC50），相關(guān)計(jì)算公式同公式（3）。

1.2.5 油茶提取物總酚和總黃酮含量的測(cè)定 用50%乙醇溶液將A1～A8 配制成1 mg/mL的稀釋液，采用Folin-Ciocalteu 法，以沒(méi)食子酸計(jì)，測(cè)定不同油茶葉提取物中的總酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：配制梯度濃度的蘆丁溶液0～50 μg/mL。在1 mL 體系中依次加入100 μL 沒(méi)食子酸溶液，250 μL的福林酚試劑，250 μL的15%的碳酸鈉溶液，再補(bǔ)足400 μL 水至1 mL 終體積。充分混合之后80 ℃水浴放置30 min，靜置冷卻10 min，4000 r/min 離心5 min，取上清液于778 nm 測(cè)定吸光值A(chǔ)778nm。依據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的測(cè)定：操作同上，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以沒(méi)食子酸計(jì)，算得樣品總酚含量[28]。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，以蘆丁計(jì)，測(cè)定不同溶劑植物提取物中總黃酮的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密配制梯度濃度的蘆丁溶液0～50 μg/mL。吸取 200 μL 待測(cè)蘆丁溶液，置于5 mL試管中，加入300 μL 60%乙醇溶液，再加入100 μL亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入150 μL 硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入400 μL 氫氧化鈉溶液，最后加入1.35 mL 60%乙醇溶液至終體系為2.5 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm 測(cè)定吸光值A(chǔ)510nm。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的測(cè)定：操作同上，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以蘆丁計(jì)，算得樣品總黃酮含量[29]。

1.2.6 油茶葉提取物化學(xué)組分的分析鑒定 參考王微[30]的方法取得8 mg 油茶葉50%乙醇提取物，加入2 mL 甲醇，配制成4 mg/mL的提取物待測(cè)液，超聲5 min 后用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾至液相瓶中，待測(cè)。

色譜柱：C18柱（2.1 mm×150 mm,1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水溶液（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）；梯度洗脫條件：0～10 min，5%～13% B；10～20 min，13% B；20～40 min，13%～20% B；40～60 min，20%～45% B；60～70 min，45%～100% B；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

UPLC-Triple TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀：負(fù)離子掃描模式；掃描范圍：m/z 100～2000；霧化氣（GS1）：55 psi；霧化氣（GS2）：55 psi；氣簾氣（CUR）：35 psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃（負(fù)）；離子源電壓（IS）：?4500 V（負(fù)）；一級(jí)掃描：去簇電壓（DP）：100 V；聚焦電壓（CE）：10 V；二級(jí)掃描：使用TOFMS-ProductIon-IDA 模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID 能量為20、40 和60 V，進(jìn)樣前，用CDS 泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2 ppm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 5α-R 粗酶提取物蛋白含量的測(cè)定

粗酶提取物呈現(xiàn)粉紅色，采用Bradford 法對(duì)5α-R 粗酶提取物定量，以蛋白質(zhì)含量表示。測(cè)得蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.5753x+0.5269（y 為吸光值，x 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，R2=0.9977），計(jì)算得出蛋白質(zhì)濃度為12.12 mg/mL。

2.2 T的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

如圖2 所示，T 在5～2000 μmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為y=18110x+116886（R2=0.9998）。

圖2 T的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 The standard curve of T

2.3 酶促反應(yīng)體系的確定

如圖3 所示，在0.5～2.5 mmol/L 范圍內(nèi)，隨著NADPH 濃度的增加，酶活性不斷上升，當(dāng)NADPH濃度為2 mmol/L 時(shí)再增加時(shí)對(duì)酶活性的影響不大，而且考慮到NADPH 價(jià)格昂貴，故最終選擇2 mmol/L作為NADPH 在5α-R 酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。如圖4 所示，在0.1～2 mmol/L 范圍內(nèi)，隨著T 濃度的增加，酶活性不斷上升，選擇酶活性最高時(shí)對(duì)應(yīng)的2 mmol/L 作為T(mén) 在5α-R 酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。如圖5 所示，5α-R 提取物濃度在0.38～0.76 mg/mL 范圍時(shí)，隨著提取物濃度增加，酶活力逐漸上升，在濃度為0.76 mg/mL 時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著提取物濃度的增大酶活力反而降低，因此確定0.76 mg/mL 為粗酶提取物濃度在5α-R 酶促反應(yīng)體系中的適宜添加濃度。

圖3 NADPH 濃度對(duì)5α-R 活性的影響Fig.3 Effect of concentrations of NADPH on 5α-R activity

圖4 T 濃度對(duì)5α-R 活性的影響Fig.4 The effect of concentrations of testosterone on 5α-R activity

圖5 粗酶提取物濃度對(duì)5α-R 活性的影響Fig.5 Effect of concentrations of enzyme extract on 5α-R activity

最終確定的反應(yīng)條件如下：pH 為7.4的磷酸鹽緩沖液300 μL，添加濃度為0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，添加濃度為2 mmol/L的T 50 μL，樣品50 μL,添加濃度為2 mmol/L的NADPH 100 μL，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.4 酶促反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

根據(jù)2.3 確定的反應(yīng)條件，分別測(cè)定四份空白對(duì)照管和酶正常反應(yīng)管（同一批次）酶活性分別為(6.11±0.16)、(565.53±9.24) μmol T/（g prot·30 min），相對(duì)偏差均小于2%，說(shuō)明該法可重復(fù)，此5α-R 酶促反應(yīng)體系穩(wěn)定強(qiáng)。

2.5 度他雄胺的5α-R 抑制活性

如圖6 所示，當(dāng)度他雄胺濃度范圍為2～16 nmol/L時(shí)，陽(yáng)性藥物度他雄胺對(duì)5α-R的抑制作用具有量效關(guān)系，曲線(xiàn)擬合度良好，根據(jù)擬合曲線(xiàn)算得度他雄胺對(duì)5α-R的半抑制濃度（IC50）為6.24 nmol/L，有文獻(xiàn)報(bào)道[25,31]度他雄胺對(duì)I 型5α-R的IC50等于6 nmol/L，與本測(cè)定值相近，進(jìn)一步說(shuō)明5α-R 酶促反應(yīng)體系可靠有效。

圖6 度他雄胺對(duì)5α-R的抑制曲線(xiàn)Fig.6 Inhibition curve of dutasteride on 5α-R

2.6 不同油茶葉提取物得率

不同極性溶劑的油茶葉提取物的得率如表1 所示，50%乙醇、甲醇、乙醇、正丁醇油茶葉提取物的得率高均超過(guò)20%，其中油茶葉50%乙醇提取物的得率最高達(dá)29.02%。這是因?yàn)樵撊軇┑娜芙夥秶鷱V，可以富集大多數(shù)的活性成分。

表1 不同極性溶劑對(duì)油茶葉提取物得率的影響Table 1 Effect of different polar solvents on the yield of Camellia oleifera leaves extracts

2.7 油茶葉不同溶劑提取物的5α-R 抑制率

根據(jù)圖7 可知，200 μg/mL的油茶葉提取物對(duì)5α-R的抑制活性有影響，油茶葉石油醚提取物對(duì)其有促進(jìn)作用，而其他油茶葉提取物呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，其中油茶葉50%乙醇提取物對(duì)5α-R 抑制效果最明顯，高達(dá)49.77%±4.43%，其次，二氯甲烷提取物和甲醇提取物對(duì)5α-R的抑制活性也較高，分別為41.26%±0.02%、36.66%±0.71%。由于油茶葉50%乙醇提取物5α-R 抑制率最高，因此最佳制備溶劑為50%乙醇，并將其提取物命名為COLE（Camellia oleiferaLeaves Extract,COLE），測(cè)得其IC50為259.56 μg/mL。已知臨床上使用度他雄胺的治療劑量為0.5 mg/d[32]，經(jīng)過(guò)等效換算，若以5α-R 抑制活性為指標(biāo)，39.35 mg/d COLE 與度他雄胺臨床劑量治療效果相當(dāng)。

圖7 不同油茶葉提取物對(duì)5α-R的抑制率Fig.7 5α-R inhibition rate of different Camellia oleifera leaves extracts

2.8 油茶葉提取物的總酚和總黃酮含量及與5α-R 抑制率的相關(guān)性分析

A1～A8的總酚、總黃酮含量見(jiàn)表2。Pearson 相關(guān)性分析如表3 所示，A1～A8 中總酚、總黃酮含量與5α-R 抑制率相關(guān)系數(shù)分別為0.609 和0.808，即5α-R 抑制率與油茶葉提取物中總多酚含量在高度正相關(guān)（r>0.6），5α-R 抑制率與總黃酮含量存在顯著的強(qiáng)正相關(guān)（r>0.8，P<0.05），這表明油茶葉提取物中的多酚與黃酮是抑制5α-R的重要物質(zhì)。

表2 不同油茶葉提取物（A1～A8）總酚和總黃酮含量Table 2 Contents of total phenols and total flavonoids in different Camellia oleifera leaves extracts（A1～A8）

表3 油茶葉提取物的5α-R 抑制率與其總黃酮、總酚含量與之間的相關(guān)性Table 3 Correlation rate between 5α-R inhibition rate and total flavonoids,total phenolics in extracts of Camellia oleifera leaves

2.9 油茶葉提取物的化學(xué)成分分析

由上述結(jié)果可知油茶葉提取物中的多酚與黃酮可能是抑制5α-R的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，采用UPLCTriple TOF-MS/MS 對(duì)COLE 中的酚類(lèi)化合物進(jìn)行定性分析，結(jié)果在COLE 中共發(fā)現(xiàn)22 種酚類(lèi)化合物。圖8 為負(fù)離子模式下的總離子圖，表4 為COLE中酚類(lèi)化合物鑒定結(jié)果。Richard 等[33]研究證明蘆丁（IC50>100 μmol/L）、槲皮素（IC50=23 μmol/L）具有I 型5α-R 抑制活性。另外還發(fā)現(xiàn)兒茶素等茶多酚類(lèi)物質(zhì)，在無(wú)細(xì)胞狀態(tài)下顯示出有效的5α-R 抑制作用，但在5α-R的全細(xì)胞分析中抑制作用不明顯。周琛媛等[34]在具有高5α-R 抑制活性的油茶蒲聚酰胺組Fr8 中分離純化（采用固相萃取的方式），通過(guò)質(zhì)譜和核磁共振的手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定出F1 為3-O-沒(méi)食子?；?4,6,-[（S）-六羥基聯(lián)苯二?；鵠-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），F(xiàn)4 為3,4,6-三-O-沒(méi)食子?；?α/β-D-吡喃葡萄糖（GAG）。這些物質(zhì)均在COLE 中被發(fā)現(xiàn)，它們是COLE 發(fā)揮5α-R 抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖8 COLE 總離子流圖（負(fù)離子模式）Fig.8 Total ion chromatogram of COLE（Negative ion mode）

表4 COLE 中酚類(lèi)化合物的鑒定結(jié)果總表Table 4 Identification results of phenolic compounds from COLE

續(xù)表 4

3 結(jié)論

本研究以5α-R 為研究靶點(diǎn)建立酶促反應(yīng)體系，通過(guò)確定粗酶提取物、NADPH、T的適宜添加濃度優(yōu)化該體系，確定反應(yīng)體系如下：PBS 緩沖液（pH7.4）300 μL，0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，2 mmol/L的T 50 μL，樣品50 μL，2 mmol/L的NADPH 100 μL，37 ℃下反應(yīng)30 min。按照該體系用HPLC 法測(cè)量臨床上使用的I 型5α-R 抑制劑度他雄胺的5α-R 抑制活性，結(jié)果測(cè)得其IC50為6.24 nmol/L，證實(shí)該法可靠有效。通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)該反應(yīng)體系具有穩(wěn)定性。然后用該法進(jìn)一步測(cè)定、比較不同油茶葉提取物5α-R 抑制活性，其中50%乙醇油茶葉提取物的5α-R 抑制活性最高（IC50=259.56 μg/mL），證明50%乙醇油茶葉提取物是潛在的植物來(lái)源的5α-R 抑制劑。最后采用UPLC-Triple TOF-MS/MS 對(duì)油茶葉提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)22 種酚類(lèi)化合物，其中槲皮素、蘆丁、兒茶素、3-O-沒(méi)食子?；?4,6,-[（S）-六羥基聯(lián)苯二?；鵠-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），3,4,6-三-O-沒(méi)食子?；?α/β-D-吡喃葡萄糖可能是COLE 發(fā)揮5α-R 抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此本研究證明了油茶葉提取物是天然的5α-R 抑制劑，在治療雄性激素依賴(lài)型疾病方面具有良好的應(yīng)用前景。