洪森輝，楊秀雯，黃曉雪，費 鵬,

（1.閩南師范大學生物科學技術學院，福建漳州 363000；2.閩南師范大學閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室，福建漳州 363000）

花青素是以2-苯基苯并吡喃陽離子為母核的黃酮類物質，一種水溶性色素[1?2]，現(xiàn)已知的花青素有20 多種，主要存在于植物中[3?5]。然而自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見，花青素通常與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7、C3'、C5'位以糖苷鍵相連形成花色苷，其中，C3 位是最常見的結合點[6?8]。迄今為止，人們已從自然界分離鑒定出600 多種花色苷[9?11]?；ㄉ粘俗鳛槎喾宇惿貞糜谑称分鈁12?13]，還具有廣泛的藥理作用，如促進類維生素A 再生、抗炎、增強免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等生理活性[14?16]。

花色苷作為一種天然抗氧化劑和多酚色素，已成為食品添加劑研究的熱點。作為一種抗氧化活性較好的天然色素[17?18]，花色苷經常被用作葡萄酒、飲料、果醬、糕點和糖果的染色劑，以改善顏色、風味、保質期和健康特性[19?21]。但花色苷的脂溶性差，不利于在非水體系中發(fā)揮抗氧化作用，限制了其在某些高脂食品中的應用，如冰激凌、肉制品、油炸制品和食用油等[22]。向花色苷分子上引入親脂性基團是提高其疏水性的一個有效方案。在前期研究中，Cai 等[23]以肉桂酰氯為?；瘎?-二甲氨基吡啶為催化劑，通過固相反應法對藍莓花色苷進行了?；揎?，結果表明花色苷的脂溶性顯著提高。但化學?；óa生較多的副產物，產物的結構難以厘清。Yang等[24]以異丙醇為溶劑，脂肪酶為催化劑，將月桂酸接枝于黑醋栗花色苷上以改善其疏水性。但花色苷在異丙醇中的溶解度很低，酰化花色苷的制備效率難以讓人滿意。

本文擬以脂肪酶為催化劑，阿魏酸和咖啡酸為基供體，在水/四氫呋喃兩相體系中對藍莓花色苷進行?；揎椧愿纳破涫杷裕⑦M一步探討了酚酸基團的引入對花色苷抗氧化活性的影響。本文為藍莓花色苷作為著色劑和功能性食品添加劑在高脂類食品中的應用提供了理論支撐與經驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓花色苷 西安圣青生物科技有限公司（370.2 mg/g，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計）；脂肪酶（≥5000 U/g，重組酶，在黑曲霉中表達）、溴化鉀上海阿拉丁試劑有限公司；阿魏酸、咖啡酸、亞油酸、β-胡蘿卜素 上海麥克林試劑有限公司；無水乙醇、吐溫80、四氫呋喃 西隴科學股份有限公司；本文所用試劑，除非另有說明，否則均為分析純。

MultiSkan Go 全波長酶標儀 美國賽默飛世爾有限公司；LC-RE-2000A 旋轉蒸發(fā)儀 上海力辰儀器科技有限公司；NICOLET IS 10 傅里葉紅外光譜儀 美國賽默飛世爾有限公司；T9 紫外-可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酰化花色苷的制備 本文采用Novozym 435 脂肪酶催化法制備?；{莓花色苷[25]。具體步驟如下：將30 mmol 阿魏酸和4.5 g 天然藍莓花色苷（native anthocyanins,Na-An）分別溶解于100 mL 四氫呋喃和100 mL 去離子水中，然后將兩者混合并加入1 g Novozym 435 脂肪酶；將混合物置于50 ℃下磁力攪拌24 h，使阿魏酸接枝到藍莓花色苷分子上；反應結束后，用旋轉蒸發(fā)儀在50 ℃下除去混合液中的四氫呋喃，再用微孔膜（Φ=0.45 μm）過濾除去脂肪酶和未反應的阿魏酸；通過冷凍干燥去除改性花色苷溶液中的水分，收集固體粉末，即為阿魏酸修飾花色苷，記為Fe-An。

用同樣的方法制備了咖啡酸?；ㄉ?，記為Ca-An。

1.2.2 正辛醇/水分配系數(shù)測定 將100 mL 正辛醇與300 mL 超純水混合，恒溫攪拌24 h，靜置分層后將兩相液體分別保存，即水飽和正辛醇和正辛醇飽和水。取0.01 g 花色苷及改性花色苷，溶解于5 mL 水飽和正辛醇中，測定其吸光度為A0，加入5 mL 正辛醇飽和水，震蕩1 h 后，在3000 r/min 下離心10 min，取上層正辛醇，測定其吸光度A1[24]。

1.2.3 ?；葴y定 參照Pinheiro 等[26?27]測定?；ㄉ盏孽；?。取0.2 g 酰化花色苷加入20 mL 0.1 mo/L NaOH 溶液中，在60 ℃條件下攪拌90 min使花色苷水解并皂化；隨后，向混合溶液中滴加0.05 mo/L 和0.01 mo/L的HCl 直至pH 為8.5，所消耗HCl 體積分別記為V1和V2。按照下面公式計算花色苷的酸值（Acid Value,AV）和?；龋ˋcylation Degree，AD）。

式中：m 為使用的花色苷質量，為0.2 g；C0為0.1 mo/L，V0為20 mL；C1為滴定所使用鹽酸溶液的濃度，為0.05 mo/L，V1為該鹽酸溶液消耗的體積；C2為滴定所使用鹽酸溶液的濃度，為0.01 mo/L，V2為該鹽酸溶液消耗的體積。M 為接枝基團的相對分子質量，阿魏?；鶠?77 g/mol，咖啡?；鶠?63 g/mol。

1.2.4 總花青素含量測定 通過pH 差示法測定藍莓花色苷中的花青素含量[23]。將花色苷分別溶解于pH1.0 和pH4.5的緩沖液中，放在黑暗環(huán)境中靜置60 min，分別測定樣品在520 和700 nm 處的吸光度，按照公式（4）計算花青素含量。

式 中：吸光度值A=（A520nm?A700nm）pH1.0?（A520nm?A700nm）pH4.5；Mw 為矢車菊色素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相對分子量（449.2 g/mol）；ε為摩爾消光系數(shù)（26900 L·mol?1·cm?1）,DF 為稀釋因子（V/Wt）。

1.2.5 DPPH 自由基清除率測定 用無水乙醇稀釋0.25 mmol/L DPPH 自由基溶液，使其在513 nm 處吸光度約為0.8；取4 mL DPPH 自由基溶液置于7 mL 離心管中，用MultiSkan Go 全波長酶標儀測定其在513 nm 處的吸光度，記為A0；向離心管中加入50 μL 花色苷溶液（250 mg/L），在黑暗中放置30 min后，再次測量其在513 nm 處的吸光度，記為A1[28]。

1.2.6β-胡蘿卜素漂白抑制率測定 向梨形瓶中10 mLβ-胡蘿卜素氯仿溶液（1 mg/mL）中加入400 μL 亞油酸和4 mL 吐溫80，混合均勻后在40 ℃旋轉蒸發(fā)除去氯仿；在梨形瓶中加入100 mL 蒸餾水，將混合液攪拌均勻，形成乳化液；取10 mL 乳化液，用去離子水定容至100 mL，制得乳化稀釋液；將約0.2 mL的花色苷溶液加入到4.8 mL的乳化稀釋液中，混合均勻后測定470 nm 處相應的吸光度；將樣品置于50 ℃恒溫水浴中，2 h 后，測定乳化液在470 nm 處的吸光度。對照樣品不加花色苷溶液，用70% 乙醇溶液代替。β-胡蘿卜素漂白抑制率計算如下[25]：

1.2.7 結構表征 采用T9 紫外-可見分光光度儀（UV-Vis）對樣品進行全波段掃描，掃描范圍200～800 nm，掃描步長1 nm；采用NICOLET IS 10 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）測定花色苷的官能團，測定波數(shù)范圍為4000～400 cm?1，分辨率為16 cm?1。

1.3 數(shù)據處理

所有的測試都重復三次并采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和獨立樣本檢驗比較差異，當P<0.05 時認為在統(tǒng)計學意義存在顯著性差別，當P<0.01 時認為存在極顯著差別。

2 結果與分析

2.1 疏水性分析

本文用辛醇-水分配系數(shù)（KOW）來表征藍莓花色苷改性前后的疏水性變化。KOW 是指物質在正辛醇和水兩相中的平衡濃度之比，其數(shù)值越大，物質脂溶性也越大[24]。結果如圖1 所示，Na-An的KOW 值為?0.20，而Fe-An 和Ca-An的KOW 值分別上升至0.66 和0.78。這表明，經阿魏酸和咖啡酸修飾后，花色苷的脂溶性顯著提高。這是由于阿魏酸和咖啡酸均為疏水性物質，當其接枝到花色苷分子上時，從而增強了該物質的疏水性。

圖1 藍莓花色苷及?；ㄉ盏男链?水分配系數(shù)Fig.1 KOW of native and acylated blueberry anthocyanins

2.2 酰化度和花青素含量分析

圖2 反映了藍莓花色苷與?；ㄉ盏孽；群突ㄇ嗨睾?。如圖2（a）所示，F(xiàn)e-An 和Ca-An的AD 值分別為3.65 %和3.71%；兩種?；ㄉ罩g無顯著差異（P>0.05）。圖2（b）顯示，每克天然藍莓花青素含有370.2 mg的花青素（以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等量物表示），經阿魏酸和咖啡酸修飾后，TAC 值分別降低至219.2 mg/g（Fe-An）和222.18 mg/g（Ca-An）。這主要是由于藍莓花色苷中外來基團（阿魏酸或咖啡酸）的增加導致。此外，在?；磻^程中，藍莓花色苷中的部分發(fā)色基團被破壞或降解，也是導致酰化花青素的TAC 值低于未?；瘶悠返囊粋€原因。

圖2 藍莓花色苷及?；ㄉ盏孽；龋╝）和花青素含量（b）Fig.2 AD(a) and TAC(b) of native and acylated anthocyanins

2.3 抗氧化活性分析

以β-胡蘿卜素漂白抑制率和DPPH 自由基清除率為指標，測定藍莓花青素及其?；苌锏目寡趸钚?。結果如圖3 所示，藍莓花色苷在DPPH 自由基清除實驗和β-胡蘿卜素漂白實驗中均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。與阿魏酸和咖啡酸發(fā)生酰化反應后，花色苷對DPPH 自由基的清除能力及對β-胡蘿卜素漂白的漂白抑制率進一步提高[29]。這是由于阿魏酸和咖啡酸均含有有酚羥基，是良好的電子供體，可以通過提供電子清除溶液中的自由基。其中，阿魏酸分子上有一個酚羥基，而咖啡酸分子上有兩個酚羥基，因此，Ca-An 對DPPH 自由基的清除率高于Fe-An。

圖3 藍莓花色苷及?；ㄉ盏腄PPH 自由基清除率（a）和β-胡蘿卜素漂白抑制率（b）Fig.3 DPPH radical scavenging rate (a) and inhibition ratio in β-carotene bleaching assay (b) of native and acylated blueberry anthocyanins

Na-An 對DPPH 自由基的清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率分別為66.3%和63.1%，當其接枝阿魏酸和咖啡酸后，F(xiàn)e-An 和Ca-An 對DPPH 自由基清除率分別上升了3.17%和12.67%，而β-胡蘿卜素漂白抑制率則分別上升了35.5%和43.1%。DPPH 自由基清除率是物質在極性溶劑中抗氧化活性的指標，而β-胡蘿卜素漂白試驗中的抑制率反映了物質在乳液環(huán)境中的抗氧化活性[10]。這表明，?；ㄉ赵谌橐后w系中的抗氧化能力強于其在極性環(huán)境下的抗氧化活性。這一結果可能與藍莓花色苷在DPPH 自由基清除實驗和β-胡蘿卜素漂白實驗中的作用機制不同有關[22?24]。在DPPH 自由基清除實驗中，花青素通過提供電子清除DPPH 自由基，而在β-胡蘿卜素漂白實驗中，花色苷通過抑制脂質氧化發(fā)揮作用。因此，在DPPH實驗中，接枝到花色苷分子上的酚酸可以提供電子，并清除DPPH 溶液中的自由基，從而提高花色苷的抗氧化能力。在β-胡蘿卜素漂白實驗中，酚酸的引入改善了花色苷的脂溶性，使其可以更好地吸附在油酸表面，阻止油酸在加熱過程中被氧化而產生自由基，從而進一步抑制了自由基對β-胡蘿卜素的漂白作用。

2.4 UV-Vis 分析

圖4 展示了天然藍莓花色苷?；昂蟮腢VVis 光譜?；ㄉ赵赨V-Vis 光譜中有兩個特征峰，分別位于500～540 nm（可見光區(qū)）和260～290 nm（紫外區(qū)）。Harborne[30?31]研究表明?；ㄉ赵?90～340 nm 處具有特征性吸收，這是由于酰基上的電子躍遷造成的。從圖4（a）中可以看出，天然藍莓花色苷在278 nm 處有一個特征吸收峰，經阿魏酸和咖啡酸修飾后，該特征峰紅移至283 nm。于此同時，改性花色苷在320 nm 處出現(xiàn)了一個吸收峰，這是花色苷上的?；斐傻?。這表明阿魏酸和咖啡酸通過?；磻又Φ交ㄉ辗肿由稀?/p>

圖4 藍莓花色苷及?；ㄉ盏腢V-Vis 圖譜Fig.4 UV-Vis spectra of native and acylated anthocyanins

另外，在圖4（b）中可以觀察到，經阿魏酸和咖啡酸修飾后，藍莓花色苷在可見光區(qū)的特征峰吸光度降低并發(fā)生藍移，這可能是由于接枝到花色苷分子上的酚酸與花色苷母核（2-苯基并吡喃）產生空間位阻效應造成的。以上結果表明，在脂肪酶的作用下，阿魏酸和咖啡酸通過?；磻又Φ交ㄉ辗肿由?。

除此之外，在圖4（b）的440～460 nm 區(qū)域可以觀察到明顯的肩峰，這表明花色苷中糖苷替代的位置在C3 位置[30?31]，這與之前的文獻報道的一致。

2.5 FTIR 光譜分析

為了進一步驗證藍莓花色苷與阿魏酸及咖啡酸之間的酰化反應，通過FTIR 表征了藍莓花色苷酰化前后分子基團的變化。圖5（a）中，藍莓花色苷及?；ㄉ?134 cm?1處均有一個寬且強的吸收峰，這是花色苷苯環(huán)中的酚羥基和H2O 中-OH 及氫鍵的伸縮振動造成的，1400～1650 cm?1處的多個吸收峰是由苯環(huán)的骨架振動造成的。圖5（b）中，藍莓花色苷在1730 cm?1處有一個吸收峰，這是C=O的伸縮振動造成的。經阿魏酸和咖啡酸修飾后，花色苷在該處的吸收峰紅移至1700 cm?1，且吸收峰強度明顯增強并發(fā)生紅移。這是由于阿魏酸和咖啡酸與花色苷發(fā)生了酯化反應造成的。一般而言，ArCOOR 上的C=O 會因為苯環(huán)的空間位阻效應導致其吸收峰移向大波數(shù)，而芳香酯（RCOOAr）上的C=O 吸收峰因為與C=C 吸收峰共軛，使其吸收峰發(fā)生紅移。由此可以推斷，阿魏酸和咖啡酸分子上的-COOH 與花色苷分子上糖基的-OH 發(fā)生了?；磻闪薃rCOOR結構，造成了C=O 吸收峰的紅移現(xiàn)象。

圖5 藍莓花色苷及?；ㄉ盏募t外光譜圖譜Fig.5 FTIR spectra of native and acylated anthocyanins

3 結論

花色苷作為一種具有良好抗氧化活性的天然色素，其脂溶性較差是阻礙其在油脂中應用的最大障礙之一。為了解決這一問題，本研究通過酶法將阿魏酸和咖啡酸接枝到藍莓花色苷分子上，以提高其疏水性。相較于化學?；ǎ阜；姆磻獥l件相對溫和，且副產物較少。研究結果表明，UV-Vis 和FTIR分析表明，在脂肪酶的作用下，這兩種酚酸接枝到了花色苷分子上，花色苷中的接枝位點可能主要是花色苷糖基上的-OH。KOW 實驗表明，酚酸的引入顯著提高了藍莓花色苷的疏水性。

另外，與天然藍莓花色苷相比，?；ㄉ盏腄PPH 自由基清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率均顯著提高。這是由于一方面，阿魏酸和咖啡酸分子上的酚羥基可以提供電子以清除自由基。另一方面，?；ㄉ罩械牡姆铀峥梢晕皆趤営退岱肿由?，抑制其在高溫下氧化，阻礙自由基的生成。