張一鳴，李思儀，沈曉溪，石晨暉，尚宏麗

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121001）

加熱處理是魚糜制品重要的加工步驟，魚糜加熱成魚糜凝膠的過程中，蛋白質(zhì)在凝膠形成過程中分為兩個階段，即為凝膠化階段和凝膠劣化階段。低于50 ℃是魚糜凝膠化階段，又稱為低溫凝膠化，肌原纖維蛋白在鹽分的作用下溶出，形成松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白從溶膠變?yōu)槟z；50～70 ℃時是凝膠劣化的階段，魚糜中蛋白質(zhì)可以被內(nèi)源性組織蛋白酶所降解，迫使魚糜中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)斷裂，從而造成凝膠劣化[1?3]。因此，在魚糜生產(chǎn)過程中要盡量避開這個溫度段，降低凝膠劣化的程度，當(dāng)溫度達到85 ℃以上后，進入魚糕化階段，凝膠變成有序、非透明狀，魚糜凝膠強度明顯增大。因此加熱的方式可直接影響魚糜凝膠的形成[4]。傳統(tǒng)的水浴加熱、高溫蒸汽加熱、微波加熱、超高壓熟制等都是應(yīng)用范圍較廣的魚糜加熱方式[5]。其中，微波加熱因具有加熱時間短、加熱速度快的特點，可以快速經(jīng)過魚糜凝膠劣化區(qū)間，能夠有效改善魚糜的凝膠特性，但同時因為快速經(jīng)過魚糜凝膠的階段，會影響肌原纖維蛋白的展開以及后續(xù)的交聯(lián)[6]。所以在原有基礎(chǔ)上采用將水浴與微波相結(jié)合的水浴微波聯(lián)用法比單獨的微波加熱法制備的混合魚糜制品既可以在40 ℃低溫凝膠狀態(tài)下保持穩(wěn)定又可以快速經(jīng)過凝膠劣化階段。目前，在魚糜的加熱選擇中，大多還是選擇水浴二段加熱法，也有研究者研究出不同的加熱方式，用來彌補水浴二段加熱法的不足，但是不同研究人員認為的好壞加熱方式也不一樣[7?8]，所以在此研究基礎(chǔ)上將不同加熱方式進行比較。

本文選擇外源添加馬鈴薯淀粉、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）以及蛋清蛋白的鰱魚與鱈魚的混合魚糜為原料，研究5 種不同加熱方式（水浴二段加熱、微波加熱、水浴微波聯(lián)用、蒸汽加熱、高壓熟制）對混合魚糜凝膠特性的影響，結(jié)合質(zhì)構(gòu)儀、SDS-PAGE 凝膠電泳和掃描電鏡技術(shù)分析，選取適合的加熱方式為產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)質(zhì)的混合魚糜制品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍鰱魚糜、冷凍鱈魚糜 湖北洪湖市井力水產(chǎn)食品有限公司；聚乙烯材料腸衣 鵬翼腸衣工廠店；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（酶活100 IU/g） 江蘇一鳴生物股份有限公司；食鹽、馬鈴薯淀粉 市售；蛋清蛋白粉 蘇州歐福蛋業(yè)股份有限公司；tris 鹽 天津大茂試劑公司；2.5%戊二醛 山東利爾康醫(yī)療器械股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇 天津化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、溴酚藍、SDS（十二烷基硫酸鈉） 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；冰乙酸、甲醇（均為AR） 沈陽試劑廠；實驗室自制重蒸水和三蒸水。

TA-XT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；SS300 型三足離心機 上海浦東天本離心機械有限公司；CT15RT 型臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；SC-80C 型全自動色差計 北京康光儀器有限公司；HH 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；85-2B 雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 濟南歐萊博技術(shù)有限公司；BYNJ1-3 實驗室微波爐 長沙巴躍儀器有限公司；164-5050電泳儀 美國伯樂Bio-Rad；KYKY-EM8000F 型掃描電鏡 北京中科科儀股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合魚糜的制備 將鰱魚與鱈魚魚糜在室溫下解凍，鰱魚魚糜與鱈魚魚糜按照5:1的比例復(fù)合，再添加0.4%谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，16%馬鈴薯淀粉以及4%蛋清蛋白粉調(diào)節(jié)至水分含量為70%，加入2.5%NaCl 擂潰成型后將其灌入準備好的腸衣中[9]。

1.2.2 混合魚糜凝膠的制備 將灌好的混合魚糜通過不同加熱方式進行加熱，然后迅速放入涼水中使其凝膠化后放入4 ℃冰箱冷藏保存，待測。

1.2.3 混合魚糜五種不同加熱方式 根據(jù)目前研究出的加熱方式整理如表1。

表1 不同加熱方式的加熱時間Table 1 Heating time of different heating modes

1.2.4 凝膠強度的測定 將混合魚糜凝膠切成高為20 mm的圓柱體，選擇用5 mm的通用柱形探頭的質(zhì)構(gòu)儀對樣品進行兩次壓縮，測前速度為2 mm/s，測試中的速度和測試后的速度共同選擇1 mm/s，壓縮百分比為50%，停留時間為5 s；破斷強度為測試過程中第一個出現(xiàn)的峰的最大力，凹陷深度為第一個峰對應(yīng)的壓縮距離，破斷強度與凹陷深度的乘積即為求得的凝膠強度值[13]。

1.2.5 持水性的測定 將混合魚糜凝膠切成大約3 mm 厚度的薄片并稱重量（W1），先將3 張濾紙置于下方，上面再放2 張濾紙，用5 kg的重物壓制并保持2 min，取出濾紙，再次稱重（W2），持水性按式（1）計算[14]:

式中：W1—第一次稱重的質(zhì)量（g）；W2—第二次稱重的質(zhì)量（g）。

1.2.6 白度的測定 將混合魚糜凝膠切成約5 mm厚度的薄片，白度值需要用全自動測色色差計來測定，混合魚糜凝膠樣本每一個取3 片，每片測定5 次，取5 次測試值得平均值。白度按式（2）計算[15]：

注：L*—亮度；a*—正值偏紅，負值偏綠；b*—正值偏黃，負值偏藍。

1.2.7 質(zhì)構(gòu)的測定 將混合魚糜凝膠切成高為20 mm的圓柱體，各組魚糜平行測定5 次，選擇用5 mm的通用柱形探頭的質(zhì)構(gòu)儀,測試前的速度選擇為2.00 mm/s,測試中的速度為1.00 mm/s,選擇測試后速度為1.00 mm/s,選擇壓縮百分比為50%,并且兩次壓縮間隔的時間為5.00 s,觸發(fā)力5.0 g[16]。

1.2.8 SDS-PAGE 凝膠電泳分析 稱取3 g 混合魚糜凝膠樣品，切碎后置于27 mL，85 ℃的5%的SDS 溶液中，均質(zhì)15 min 后，將含有均質(zhì)液的離心管放于85 ℃的水浴鍋中保溫1 h，冷卻后在25 ℃，4000 r/min 下離心10 min，取上清液，與上樣緩沖液按1:1 比例混合，沸水浴4 min，采用8%分離膠和5%濃縮膠進行電泳分離，蛋白上樣量為 15 μL。電泳結(jié)束后用0.1%（m/V）的考馬斯亮藍 R-250 染色液（含有50%的甲醇，10%的乙酸）染色1 h，然后用脫色液（含有50%的甲醇，10%的乙酸）蛋白質(zhì)條帶清晰即為脫色成功[17]。

1.2.9 掃描電鏡（SEM）微觀結(jié)構(gòu)觀察 參考余永名等[18]的方法，略作修改。將混合魚糜凝膠切成3 mm×3 mm×3 mm 小塊，用 2.5%的戊二醛固定12 h，去除固定液后用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH7.2）漂洗3 次，每次5 min，再分別用體積分數(shù)為 30%、50%、70%、90%、95%和100%的乙醇各脫水一次，15 min/次，再將樣品放入真空冷凍干燥機中干燥8 h，離子濺射鍍金，用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，選用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA），P<0.05 為差異性顯著。所有指標檢測均測定三次取平均值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱方式對混魚糜凝膠強度的影響

凝膠強度即凝膠破斷力和破斷距離的乘積，是反映復(fù)合魚糜凝膠性能的一個重要指標[20]。由圖1可知，不同加熱方式對混合魚糜凝膠強度影響力不同，水浴微波聯(lián)用法加熱的混合魚糜凝膠強度顯著（P<0.05）高于其余四種方法制備的混合魚糜凝膠強度。水浴微波聯(lián)用的混合魚糜凝膠強度相比于傳統(tǒng)水浴二段法增強了22.4%，較單獨微波加熱法增強了14.8%，與高壓熟制法相比增強了34.9%，比蒸汽加熱法增強了43.9%，而凝膠強度增強是由于混合魚糜在經(jīng)過40 ℃水浴1 h的低溫凝膠化后，再用微波爐快速加熱使混合魚糜快速經(jīng)過凝膠劣化階段，進而改善混合魚糜凝膠強度，使混合魚糜凝膠強度達到最優(yōu)值。

圖1 不同加熱方式對混合魚糜凝膠強度影響Fig.1 Effect of different heating modes on gel strength of mixed surimi gel

2.2 不同加熱方式對混合魚糜凝膠持水性的影響

混合魚糜凝膠持水性是指魚糜凝膠經(jīng)過重力壓制前后能將水分保持在其微觀結(jié)構(gòu)中的能力[21]，是判斷混合魚糜凝膠優(yōu)劣的一個重要參數(shù)，較高的持水性是優(yōu)質(zhì)混合魚糜的重要特點，其值越高表示凝膠中游離水份越少。通過圖2 可以明顯看出，加熱方式顯著影響（P<0.05）混合魚糜凝膠的持水性，根據(jù)朱玉安等[22]研究表明，微波加熱法制備的魚糜在蒸制和煮制中持水性最大，而本文在此基礎(chǔ)上選擇五種加熱方式，并將水浴和微波聯(lián)用，此時水浴微波聯(lián)用組制備的混合魚糜凝膠持水性高于其他四組加熱方式。水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜持水性高是因為魚糜從溶膠變?yōu)槟z的過程中，魚糜中肌原纖維蛋白在前期低溫水浴過程中充分展開，有助于后期微波加熱中蛋白間的交聯(lián)作用，相對于其他四種加熱方式，水浴微波聯(lián)用加熱可以使魚糜凝膠結(jié)構(gòu)更為緊密（圖5c）將魚糜凝膠中的水分保留的更高。

圖2 不同加熱方式對混合魚糜凝膠持水性影響Fig.2 Effect of different heating modes on water holding capacity of mixed surimi gel

2.3 不同加熱方式對混合魚糜凝膠白度的影響

由圖3 看出，不同加熱方式下加熱的混合魚糜凝膠白度有所不同，水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠白度值顯著（P<0.05）高于水浴二段加熱、微波加熱、蒸汽加熱以及高壓法。因為高溫處理不僅影響混合魚糜凝膠中水分子的重新排列，而且破壞蛋白質(zhì)分子間的非共價鍵，影響共價鍵的破壞和形成，兩者都會改變凝膠的白度。陳海華等[23]研究指出魚糜凝膠的白度變化與蛋白變性的程度有關(guān)，而水浴微波聯(lián)用法法可以使混合魚糜凝膠快速經(jīng)過凝膠劣化溫度段，減小蛋白質(zhì)變性，所以白度也會高于其他加熱方法。

圖3 不同加熱方式對混合魚糜凝膠白度影響Fig.3 Effect of different heating methods on the whiteness of mixed surimi gel

2.4 不同加熱方式對混合魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

由表2 可知，五種不同的加熱方式對混合魚糜凝膠的硬度、彈性、膠粘性、咀嚼性和內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)特性有顯著（P<0.05）影響。對于不同加熱方式下的混合魚糜凝膠的硬度值，由大到小排列為：水浴微波聯(lián)用>微波加熱>高壓熟制>水浴二段加熱>蒸汽加熱，且水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠硬度顯著（P<0.05）高于其他方法。水浴微波聯(lián)用法中先在40 ℃水浴下1 h，這一階段添加物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）催化魚糜蛋白分子之間形成ε-（γ-谷氨酰胺）賴氨酸共價交聯(lián)鍵，隨后因為微波加熱時間快速的特點使形成的ε-（γ-谷氨酰胺）賴氨酸共價交聯(lián)鍵不易被分解[24]，可以讓混合魚糜形成穩(wěn)定且致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（如圖5c 所示），增強其持水性進而增強混合魚糜凝膠硬度[25]。而不同加熱方式下的混合魚糜凝膠的彈性、膠粘性、咀嚼性的值由大到小排列為：水浴微波聯(lián)用>微波加熱>水浴二段法加熱>高壓熟制>蒸汽加熱，且水浴微波聯(lián)用下混合魚糜凝膠的彈性、膠粘性、咀嚼性顯著（P<0.05）高于其他加熱方式，這可能使由于微波加熱可以使混合魚糜快速經(jīng)過凝膠階段，減少劣化現(xiàn)象，所以微波方式在加熱過程中可以在短時間內(nèi)制備出凝膠特性較好的混合魚糜凝膠。對于魚糜的內(nèi)聚性，不同加熱方式的混合魚糜凝膠沒有顯著性變化（P>0.05）。

表2 不同加熱方式對混合魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different heating modes on gel texture of mixed surimi gel

2.5 不同加熱方式的混合魚糜凝膠SDS-PAGE 凝膠電泳

由圖4 可知，水浴微波聯(lián)用混合魚糜凝膠（第1 道）和水浴二段加熱混合魚糜凝膠（第2 道）其肌球蛋白重鏈（MHC）條帶明顯細于微波加熱，因為微波加熱速度快的特點，使魚糜快速通過凝膠化，而水浴二段法和水浴微波聯(lián)用法都會使魚糜在40 ℃下MHC 充分交聯(lián)，MHC的數(shù)量會隨著低溫凝膠化時間的延長而減少，形成 MHC 聚集體，MHC 聚集體因分子過大而無法進入分離膠[26?27]。但是蒸汽加熱混合魚糜凝膠（第4 道）和高壓熟制混合魚糜凝膠（第5 道）的MHC 完全消失，說明這兩種方法制備得混合魚糜凝膠蛋白質(zhì)發(fā)生了降解現(xiàn)象。水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠（第1 道）其肌動蛋白（Actin）含量顯著多于其他四種加熱方式，在魚糜肌原蛋白中，肌球蛋白和肌動蛋白含量占75%，肌球蛋白重鏈（由肌球蛋白和肌動蛋白組成）是與魚糜凝膠化過程相關(guān)的重要蛋白質(zhì)[27?28],由以上結(jié)論可得出水浴和微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠蛋白質(zhì)保留程度顯著高于其他四組加熱方式。

圖4 混合魚糜凝膠SDS-PAGE 圖Fig.4 SDS-PAGE of mixed surimi gel

2.6 不同加熱方式的魚糜凝膠掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖5a 可知，傳統(tǒng)水浴加熱的混合魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為稀疏，有較大的孔洞且空隙較大，這樣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不牢固，不能抵抗外界施加的力，造成持水能力減弱，而圖5d 中通過蒸汽加熱法制備的混合魚糜凝膠的凝膠結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出大小不一的凝膠孔洞，凝膠網(wǎng)絡(luò)的致密性下降，且可以觀察到部分組織有斷裂的現(xiàn)象，使得混合魚糜凝膠的持水力、凝膠強度、彈性等下降。圖5e 中混合魚糜凝膠在高壓條件下，混合魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為致密，但是表面較為粗糙，有少許孔隙，這可能由于水分狀態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在高壓處理后的魚糜中發(fā)生了變化的結(jié)果[29]，這與前面持水性結(jié)果吻合。由圖5b 和圖5c 可以看出，單獨微波和水浴微波聯(lián)用下的混合魚糜凝膠孔隙較小結(jié)構(gòu)較為緊密，可以形成均一穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這可能是因為快速微波加熱產(chǎn)生的熱效應(yīng)使聚集的蛋白質(zhì)發(fā)生膨脹，這樣可以讓魚糜吸收足夠熱量，顯著提高了斷裂力和的影響研究[J].食品科技，2018，43（10）：195?199.［Zheng J,Ma A N,Hu A J,et al.Effect of heating method on quality of compound vegetable fish pills[J]. Food Technology，2018，43（10）：195?199.］

圖5 不同加熱方式的魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Microstructure of surimi gels with different heating modes

［5］曹洪偉.微波對魚糜加工過程中肌球蛋白和關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)的影響[D].無錫:江南大學(xué),2019.［Cao H W.Effects of microwave on myosin and key enzymes structure in surimi processing[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.］形變力[30]，但是兩種微波加熱方法中，水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠相對于單獨微波加熱表面較為平滑，結(jié)構(gòu)更為緊密，這可能是因為前期1 h的低溫凝膠化階段，有效提高混合魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。通過觀察混合魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)，水浴微波聯(lián)用法凝膠結(jié)構(gòu)最致密，可以制備出凝膠特性強的混合魚糜凝膠。

3 結(jié)論

在5 種不同加熱方式中，水浴微波聯(lián)用法制得的混合魚糜制品持水力為94.33%，白度為83.75，凝膠強度為2979.47 g·cm，硬度為21.50 N，彈性4.30 mm，膠粘性20 N，咀嚼性49.27 mJ 均顯著（P<0.05）高于其他加熱方式所制得的混合魚糜凝膠，并通過掃描電鏡圖顯示水浴微波聯(lián)用法制備的混合魚糜凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，凝膠孔洞較小且表面平滑，結(jié)合SDSPAGE 凝膠電泳分析得出，水浴微波聯(lián)用法制得的混合魚糜凝膠主要蛋白質(zhì)成分保留較好。在五種加熱方式中水浴微波聯(lián)用法可以制備出品質(zhì)優(yōu)良的混合魚糜凝膠制品，可為混合魚糜制品的改良提供參考。