胡夏恬，張鳳清, ，于 敏

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J.Tseng）為冬青科冬青屬喬木植物，是藥、飲兼用之名貴珍品[1?2]，富含五環(huán)三萜及皂苷類(lèi)、黃酮、甾體、多糖等多種化學(xué)成分[3?4]，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學(xué)活性[5?10]。苦丁皂苷D（Kudinoside D）是從苦丁茶冬青中提取的三萜皂苷類(lèi)化合物[11?12]，研究表明Kudinoside D 能抑制膽固醇腸道吸收，顯著降低血漿中總膽固醇、總甘油三酯且升高血漿高密度脂蛋白的水平，此外還有降低甘油三酯、抗氧化、腎保護(hù)和改善血液流變學(xué)等作用，可以用于治療高血脂及其相關(guān)疾病，具有良好的制藥用途[13]。

雖然Kudinoside D 有良好的保健作用，但Kudinoside D 水溶性差，生物利用度低，這是導(dǎo)致其藥效作用發(fā)揮不佳的重要因素。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米藥物載體在提高難溶性藥物溶解度方面的作用日益凸現(xiàn)[14?19]。聚谷氨酸（γ-PGA）具有無(wú)毒性、生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)[20?21]，L-苯丙氨酸乙酯（L-PAE）可作為疏水基團(tuán)與γ-PGA 形成良好的兩親性納米載藥系統(tǒng)[22?24]。兩親性聚合物γ-PGA-PAE的親脂端可以包裹脂溶性藥物，同時(shí)其親水性可以使被包裹的藥物形成良好的水化層，使藥物水溶性和穩(wěn)定性更高[25]。然而目前納米制劑的研究多為化學(xué)藥物納米制劑，對(duì)植物提取物納米制劑的研究較少，與此同時(shí)大多數(shù)納米粒的相關(guān)研究普遍只從納米粒的制備方面著手，少有篩選載藥納米粒制備方法的研究報(bào)道。

為了提高Kudinoside D的生物利用度，本研究分別采用沉淀法、透析法制備Kudinoside D 納米粒，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征，為開(kāi)發(fā)保健功能效果更好的Kudinoside D 新型制劑提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶冬青 海南省產(chǎn)；聚谷氨酸（γ-PGA） 海寧市紫金港生物科技有限公司；硅膠100～200 目青島海洋化工有限公司；L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽（LPAE） 上海麥克林生化科技有限公司；碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC.I） 美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司；二甲基亞砜（DMSO）、氘代二甲基亞砜 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、二氯甲烷、鹽酸 北京化學(xué)試劑公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國(guó)Fisher 公司；透析袋 北京索萊寶科技有限公司；超純水 實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純。

LC-20A 型高效液相色譜儀 日本島津公司；FW10C 高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；PHS-3E 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Millipor-Q 型超純水機(jī) 美國(guó)Millipor 公司；LKTC-E 恒溫振蕩器 金壇市城東新瑞儀器廠；Hwcb-2 恒溫磁力攪拌器 溫州市醫(yī)療電器場(chǎng)；5424R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AV600 一維及二維核磁共振譜 美國(guó)Bruker 公司；HT7820 透射電鏡 日本日立公司；動(dòng)態(tài)納米粒度儀 英國(guó)Malvem Instruments 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Kudinoside D的分離純化及鑒定 參考文獻(xiàn)[26]方法，稱取7.5 kg 干燥的苦丁茶冬青葉粉碎，用8 BV 70%乙醇浸提3 次，每次5 d，合并提取液減壓濃縮（40 ℃）至無(wú)醇味，制得浸膏。分別用3 L×4 L的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃?。簩⒘黧w狀浸膏轉(zhuǎn)入分液漏斗中，先加入4 L 萃取劑充分振搖，靜置分層，收集有機(jī)溶劑部分，共萃取3 次，合并萃取液；再在流體狀浸膏中加入下一萃取劑用同樣方法重復(fù)萃取3 次。將各萃取部位減壓濃縮、低溫蒸干（40 ℃）后，固體粉碎過(guò)100 目篩。取正丁醇萃取部位粉末100 g，經(jīng)正向硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（4:1）50 倍體積洗脫，收集洗脫部分，再經(jīng)ODS 填料甲醇-水（8:1）50 倍體積洗脫，半制備型高效液相純化，得到化合物I-9 162 mg。

色譜條件：選用YMC-Pack C18柱，流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）二元梯度洗脫，0～15 min 30% A，15～45 min 30%～50% A，分析時(shí)間45 min，流速2.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量40 μL。

鑒定：稱取5 mg 化合物I-9 用0.5 mL 氘代吡啶溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中，進(jìn)行核磁檢測(cè)（1H-NMR、13CNMR）。1H-NMR 測(cè)定條件：測(cè)定溫度298 K，頻率600 MHz，譜寬33333 Hz；13C-NMR 測(cè)定條件：測(cè)定溫度298 K，頻率150 MHz，譜寬33333 Hz。

1.2.2 聚谷氨酸與L-苯丙氨酸乙酯共聚物（γ-PGAPAE）的合成 參考文獻(xiàn)[27]方法，稱取1.01 gγ-PGA，加入超純水50 mL,在恒溫振蕩器中振搖5～6 h（37 ℃，200 r/min）充分溶解。調(diào)節(jié)γ-PGA 溶液的pH 至3.0（1 mol/L HCL 溶液），置于98 ℃恒溫水浴中，降解9 min，立即冰浴冷卻，再將溶液的pH 調(diào)至7.0（1 mol/L NaOH 溶液），結(jié)束降解反應(yīng)，得到小分子γ-PGA 溶液。

稱取EDC.I 2.61 g 加入上述小分子γ-PGA 溶液中，于恒溫振蕩器中振搖15 min（37 ℃，200 r/min），再加入L-PAE 1.06 g，于恒溫振蕩機(jī)中反應(yīng)24 h（37 ℃，200 r/min）。反應(yīng)產(chǎn)生白色沉淀，用超純水洗滌（離心14000 r/min，10 min），棄上清，重復(fù)3 次，將沉淀物質(zhì)真空冷凍干燥48 h，得到產(chǎn)物γ-PGA-PAE 1.24 g。

1.2.3γ-PGA-PAE的純化與鑒定 將1.2.2 中得到的γ-PGA-PAE 材料溶解于5 mL的DMSO 溶液中，再將該溶液用滴管滴加于5 mL 超純水中，滴加后得到乳白色半透明溶液，離心（14000 r/min，10 min）后棄去上清，清洗過(guò)程重復(fù)三次。將沉淀真空冷凍干燥24 h 以上，得到已純化的γ-PGA-PAE 材料。取500～600 μL 氘代DMSO 加入到純化后的γ-PGAPAE 材料（6～8 mg）中，于恒溫震搖器中振蕩24 h 以充分溶解（37 ℃，120 r/min）。將樣品溶液轉(zhuǎn)移至核磁管中，進(jìn)行核磁檢測(cè)（1H-NMR）。

1.2.4 Kudinoside D 納米粒的制備 稱取5 mg Kudinoside D 和20 mgγ-PGA-PAE，溶解于2 mL DMSO 中，將混合溶液用滴管緩慢滴加于2 mL 超純水中，磁力攪拌3～4 h（120 r/min），制成納米粒溶液，同樣方法另制備一份納米粒溶液。將一份納米粒溶液在高速冷凍離心機(jī)中離心10 min（14000 r/min），棄上清，收集底部沉淀；另一份納米粒溶液，轉(zhuǎn)移至透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量1500）中并用循環(huán)水透析24 h，收集底部沉淀。將收集的兩份物質(zhì)真空冷凍干燥24 h 后分別得Kudinoside D 納米粒15.08 mg、24.62 mg。比較兩種方法制得納米粒的包封率與載藥量，擇優(yōu)進(jìn)行表征及體外釋藥特性的考察。

1.2.5 包封率、載藥量測(cè)定 HPLC 色譜條件：Angilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈-水（4:6），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。此色譜條件下對(duì)Kudinoside D 對(duì)照品進(jìn)行線性關(guān)系考察。精密稱取Kudinoside D 10 mg于100 mL 容量瓶中，加入甲醇定容得濃度為100 μg/mL的藥物溶液。取適量溶液配制成1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0 μg/mL的溶液，進(jìn)樣20 μL，以峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸。

稱取Kudinoside D 納米粒5 mg 加入1 mL 丙酮，超聲10 min 溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）去除有機(jī)相，再加入2 mL 甲醇超聲5 min，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后得到供試品溶液。HPLC 法檢測(cè)包封率和載藥量，HPLC 色譜條件同上。

包封率EE（%）=（W1/W2）×100

載藥量DL（%）=（W1/W3）×100

式中：W1為載藥納米粒中藥物的質(zhì)量，mg；W2為總投藥量，mg；W3為載藥納米?？傎|(zhì)量，mg。

1.2.6 Kudinoside D 納米粒的表征 取適量Kudinoside D 納米粒用超純水重懸，通過(guò)動(dòng)態(tài)納米粒度儀檢測(cè)納米粒尺寸、粒徑分布及Zeta 電位。將Kudinoside D 納米粒重懸樣品滴加到銅網(wǎng)上，烘干，用1%的鉬酸銨溶液染色后，通過(guò)透射電鏡檢測(cè)Kudinoside D 納米粒的形態(tài)和尺寸。

1.2.7 Kudinoside D 納米粒的體外釋藥特性考察稱取Kudinoside D 納米粒5 mg，加入適量0.1 mol/L的PBS（pH7.4）超聲分散，轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量1500），將透析袋扎緊后置于含有50 mL PBS的燒杯中，于恒溫振蕩器中振蕩48 h（37 ℃，100 r/min），定時(shí)取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)加同等體積0.1 mol/L的PBS（pH7.4）。用HPLC 外標(biāo)法檢測(cè)Kudinoside D的含量，色譜條件同1.2.5，并計(jì)算釋藥量。

釋藥量DR（%）=（W4/W1）×100

式中：W4為透析后釋放的藥物質(zhì)量，mg；W1為載藥納米粒中藥物的質(zhì)量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所用數(shù)據(jù)為2 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果均值；繪圖軟件采用ChemDraw。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kudinoside D的結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.1 中制得的化合物為白色粉末I-9。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示化合物的色譜峰保留時(shí)間與Kudinoside D 一 致，為6.29 min；1H-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）譜鑒定結(jié)果顯示，δ0.85、0.90、1.07、1.24、1.41、1.55、1.71（各3H，s）為五環(huán)三萜母核上7 個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)，δ3.32（dd，J=11.7 4.4 Hz）為C-3 上連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)，5.79（dd，J=10.6，1.9 Hz）和7.53（dd，J=10.5，3.1 Hz）為一對(duì)順式雙取代的烯質(zhì)子信號(hào)，δ4.90（d，J=5.7 Hz，1H）、5.14（d，J=7.8 Hz，1H）、6.20（s，1H）分別為三個(gè)糖（Ara、Rha、Glc）端基碳質(zhì)子信號(hào)；13C-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）譜圖中共顯示47 個(gè)碳信號(hào)，其中δc175.34 為C-28 羰基信號(hào)，δc127.31、128.55 和140.85、135.12 分別為C-11 和C-12 位及C-13 與C-18 形成的共軛雙鍵碳信號(hào)，δc104.99（3-Ara-1）、δc104.92（Glc-1）、δc102.11（Rha-1）分別為三個(gè)糖基的端基碳信號(hào)。該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]中Kudinoside D的報(bào)道吻合，故確認(rèn)化合物為 Kudinoside D。化合物液相色譜譜圖如圖1，核磁結(jié)果如圖2、圖3，分子結(jié)構(gòu)式如圖4。

圖1 化合物I-9 與Kudinoside D 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of compound I-9 and Kudinoside D

圖2 Kudinoside D 1H-NMR 圖譜Fig.2 1H-NMR spectra of Kudinoside D

圖3 Kudinoside D 13C-NMR 圖譜Fig.3 13C-NMR NMR spectra of Kudinoside D

圖4 Kudinoside D 分子結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The molecular structure of Kudinoside D

2.2 γ-PGA-PAE的鑒定

為改善高分子材料γ-PGA 水溶液黏度過(guò)高不利于L-PAE 進(jìn)行修飾反應(yīng)的問(wèn)題，本文采取了高溫酸解法，將分子量較大的γ-PGA 降解，再加入EDC.I 進(jìn)行縮合反應(yīng)，從而使γ-PGA 側(cè)鏈的羧基和L-PAE 上的氨基都脫去一分子的H2O，形成肽鍵后在γ-PGA的側(cè)鏈上成功連接L-PAE，形成兩親性聚合物γ-PGA-PAE[27,29?30]。1H-NMR 結(jié)果顯示（圖5），圖譜中標(biāo)注的a、b、c、d 處符合γ-PGA的特征峰（δ值分別為7.89、4.27、1.85、2.13 ppm），圖上標(biāo)注的e、f、g、h、i 和j 處符合L-PAE的特征峰（δ值分別為8.34、4.43、3.99、1.07、3.00、7.18 ppm），與文獻(xiàn)[22]一致,說(shuō)明L-PAE 與γ-PGA 已成功連接組裝為兩親性的γ-PGA-PAE 材料。

2.3 Kudinoside D的納米粒包封率和載藥量

經(jīng)HPLC 檢測(cè)，回歸方程為Y=3963.8X?7.875（R2=0.9997），在1.0～15 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于藥物含量的測(cè)定和體外溶解度實(shí)驗(yàn)分析。沉淀法制備的納米粒包封率為44.14%，載藥量為2.99%；透析法制備的納米粒包封率為65.46%，載藥量為13.24%。故選用透析法制備的納米粒進(jìn)行表征和體外緩釋效果的考察。

2.4 Kudinoside D 納米粒的形態(tài)表征

本研究制備的Kudinoside D 納米粒凍干粉末呈白色，溶液為乳白色透明液體。透射電鏡結(jié)果顯示（圖6），Kudinoside D 納米粒呈現(xiàn)規(guī)整的圓球形，大小較均一，分布均勻，無(wú)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，根據(jù)粒徑分布圖可判斷（圖7），Kudinoside D 納米粒平均半徑為（75±25）nm，分散系數(shù)為0.18，Zeta 電勢(shì)為33.7，表明所得納米粒大小理想，分布較集中，帶有較強(qiáng)正電荷，穩(wěn)定性較好。

圖6 Kudinoside D 納米粒的透射電鏡圖Fig.6 The TEM imge of Kudinoside D nanoparticles

圖7 Kudinoside D 納米粒的粒徑分布圖Fig.7 Particle size distribution of Kudinoside D nanoparticles

2.5 Kudinoside D 納米粒的體外緩釋效果考察

由圖8 可知，與Kudinoside D 納米粒相比，游離Kudinoside D 在3 h 時(shí)就已釋放了50%，在10 h時(shí)已經(jīng)完全釋放，而Kudinoside D 納米粒較游離Kudinoside D 無(wú)明顯突釋現(xiàn)象，藥物在10 h 時(shí)才釋放到達(dá)50%，之后釋放趨于平緩。體外緩釋實(shí)驗(yàn)表明Kudinoside D的納米粒具有緩釋特點(diǎn)，這說(shuō)明Kudinoside D 納米粒能增加血藥濃度作用的時(shí)間。

圖8 Kudinoside D 納米粒的緩釋曲線Fig.8 Sustained release curve of Kudinoside D nanoparticles

3 結(jié)論

本研究以γ-PGA-PAE 為載體，采用沉淀法和透析法制備Kudinoside D 納米粒，結(jié)果顯示透析法制備納米粒的包封率為65.46%，載藥量為13.24%；沉淀法制備納米粒的包封率為44.14%，為載藥量2.99%，說(shuō)明所得納米粒包封率較高，載體對(duì)藥物有很好的相容性。高包裹率的納米粒能顯著提高Kudinoside D的穩(wěn)定性，故對(duì)包封率和載藥量更高的透析法制備的Kudinoside D 納米粒進(jìn)行表征和體外緩釋效果考察。結(jié)果顯示所得Kudinoside D 納米粒粒徑均一，平均粒徑為（75±25）nm，分散度良好，同時(shí)Kudinoside D 納米粒與單純Kudinoside D 藥物相比具備了更好的緩釋效果。Kudinoside D 納米粒的緩釋特性能使血藥濃度維持平穩(wěn)，可避免藥物的快速降解，減少給藥次數(shù)，增加藥物作用時(shí)間。此外，Kudinoside D 納米粒具有良好的納米尺寸，對(duì)其進(jìn)行修飾可制備腦內(nèi)藥物遞送系統(tǒng)。本研究對(duì)Kudinoside D 納米粒進(jìn)行了體外表征，其體外生物活性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。雖然納米藥物制劑發(fā)展前景廣闊，但目前大多處于實(shí)驗(yàn)室研究的階段，尤其是靶向納米藥物制劑，體內(nèi)生物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累更少。制備納米藥物制劑過(guò)程中使用的輔料的毒性問(wèn)題及載藥納米粒進(jìn)入機(jī)體后是否會(huì)沉積等問(wèn)題仍需研究。再者，目前納米藥物制劑的制備主要是在實(shí)驗(yàn)室制備，同時(shí)對(duì)所生產(chǎn)的納米藥物制劑尚未有完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量的把控?？偠灾?，納米藥物制劑在藥物制劑乃至臨床醫(yī)藥領(lǐng)域都有很高的研究?jī)r(jià)值，值得深入探究。