焦安妮，于 敏，關(guān) 玥，倪帥帥，焦連慶

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130012）

大葉冬青（Ilex latifoliaThunb.）為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬（Ilex）常綠喬木，作為苦丁茶基源植物之一，藥用其葉，俗稱大葉茶，具有清熱解毒、止咳化痰、健胃消積、明目益思等功效[1]。大葉冬青中主要含有三萜及三萜皂苷類、黃酮類、甾體、氨基酸、多糖及核苷等類成分[2]。血清白蛋白是運輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的重要載體，也是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)[3]。藥物小分子被吸收入血后，將可逆性地結(jié)合血漿蛋白，再經(jīng)血液循環(huán)到受體部位，故藥物與BSA的結(jié)合能力直接影響藥物在體內(nèi)的吸收代謝、藥效發(fā)揮、藥理、毒理等方面[3?4]。因此，研究血清白蛋白與藥物小分子間的相互作用對于闡明藥物分子的作用機制，加強藥物的開發(fā)利用以及深入了解藥物毒副作用具有重要意義。

至今對大葉冬青活性成分的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究鮮有報道，因此有必要深入研究大葉冬青苦丁茶的化合物的提取分離以及單體化合物的作用機制，明確大葉冬青苦丁茶的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為大葉冬青皂苷藥用開發(fā)提供技術(shù)支持。

本文利用熒光光譜及圓二色譜法研究從大葉冬青葉中分離得到3 種不同結(jié)構(gòu)的皂苷類化合物：Latifoloside G、Latifoloside C 及Kudinoside G 與BSA的相互作用機理，實驗結(jié)果對于探索大葉冬青皂苷在體內(nèi)的運輸轉(zhuǎn)運機制及相關(guān)藥代動力學(xué)研究具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白 美國Sigma 公司；大葉冬青葉

于2015 年7 月采自浙江省新昌縣，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院牛志多研究員鑒定為冬青科冬青屬植物大葉冬青的干燥葉；水 為超純水；乙腈、甲醇 色譜純，美國Fisher 公司；乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯 分析純，北京化學(xué)試劑公司。

LC-20A 型高效液相色譜儀、SPD-M20A 二極管陣列檢測器、RF-5301PC 型熒光分光光度計 日本島津公司；薄層色譜成像儀YOKO-ZS 武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；PMS 450 圓二色譜儀 法國Biologic 公司；BT25S 型十萬分之一電子天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

上海亞榮生化儀器廠；ZK-82A 型真空干燥箱 上海市實驗儀器總廠；HH-S 型恒溫水浴鍋 常州中捷實驗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大葉冬青皂苷的提取、分離、鑒定 實驗室前期將干燥的大葉冬青葉粗粉（10 kg）分別加10 倍量70%乙醇浸提3 次，每次3 d，合并提取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30 ℃條件下將提取液減壓濃縮成無醇味浸膏（1 L），分別依次以石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取兩次，每次溶劑量為浸膏體積的5 倍量。取正丁醇萃取部位（100 g），經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，再經(jīng)薄層色譜成像儀分析合并相同流分（通過10%硫酸乙醇液顯色鑒別）得到8 個流分。選取2 個流分經(jīng)反相鍵合色譜（ODS）以及半制備型高效液相色譜進行分離純化得到3 個化合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），采用核磁共振1H 譜、核磁共振13C 譜等波譜手段進行結(jié)構(gòu)解析，并與文獻數(shù)據(jù)比對[4?8]，確定化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為Kudinsoide G、Latifoloside G 和Latifolosides C。

1.2.2 相關(guān)試劑配置 以pH7.4，0.02 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配置1.0×10?5mol/L的牛血清蛋白貯備溶液以及1.0×10?2mol/L的大葉冬青皂苷貯備溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 熒光光譜測定 精密吸取3 mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0×10?5mol/L）于1 cm 石英比色皿中，以微量注射器逐次加入大葉冬青皂苷溶液（1.0×10?2mol/L），控制累積加樣體積在100 μL 以內(nèi)，使Latifoloside G、Latifoloside C 及Kudinoside G 最終濃度達到0、0.3322×10?4、0.6623×10?4、0.9901×10?4、1.3158×10?4、1.6639×10?4、1.9608×10?4、2.2801×10?4、2.5974×10?4、2.9126×10?4、3.2258×10?4mol/L。激發(fā)波長設(shè)置為280 nm，發(fā)射波長為340 nm，狹縫均為5 nm，分別記錄298、310 K 兩個溫度下300～500 nm 波長范圍內(nèi)所測量的熒光光譜結(jié)果。再結(jié)合所得到的不同溫度下的熒光猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)，分析不同結(jié)構(gòu)的皂苷類化合物對BSA的熒光猝滅機理。

1.2.4 圓二色譜測定 在室溫下，利用1 mm的石英比色皿進行圓二色譜測定。掃描參數(shù)：狹縫寬度1 nm，反應(yīng)時間5 s，波長掃描范圍190～250 nm，掃描速度5 nm/s。大葉冬青皂苷與BSA的摩爾濃度比設(shè)置為：13:1、26:1、39:1、52:1、65:1。以磷酸鹽緩沖液為參比矯正吸收背景，觀察反應(yīng)體系中圓二色譜值的變化，使用SELCON 3.0 程序得到BSA 中α-螺旋含量的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文章中數(shù)據(jù)采用Excel 2010，圖表使用0rgin 8.5 軟件進行處理。采用SELCON 3.0 程序計算蛋白質(zhì)二級變化的百分比，進一步推算Kudinoside G，Latifoloside C 及Latifoloside G 對BSA 構(gòu)象的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 三萜類皂苷與BSA的相互作用的熒光光譜

2.1.1 熒光猝滅光譜 BSA的熒光強度主要來源于色氨酸殘基，設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，BSA的發(fā)射波長為340 nm，通過熒光光譜得出小分子與蛋白的結(jié)合特征，通過雙對數(shù)方程可以得到不同溫度下的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）等。

圖1 表示在298 K 和310 K 條件下，Kudinoside G、Latifoloside C、Latifoloside G 濃度微量變化對于BSA 熒光強度的影響。可看出，隨著三種藥物小分子濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光強度降低，兩種溫度下BSA的最大發(fā)射峰皆發(fā)生輕微藍移，三種皂苷的發(fā)射波長皆由347 nm 藍移到345 nm。溫度為298 K 時，Kudinoside G、Latifoloside C 和Latifoloside G 對BSA的熒光猝滅程度分別為22.0%、24.1%和27.1%；溫度為310 K 時，三種皂苷對BSA的猝滅程度分別為17.7%、19.0%和22.7%。根據(jù)熒光猝滅程度可判斷出三種皂苷與BSA 結(jié)合能力的順序[9?10]為Latifoloside G>Latifoloside C>Kudinoside G。熒光強度的藍移表明，蛋白的生色團疏水結(jié)構(gòu)變緊密，肽鏈的伸展程度減少，使其所處微環(huán)境的極性減小，疏水性增加[11?16]。

圖1 Kudinoside G、Latifoloside C、Latifoloside G 與BSA 相互作用的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of Kudinoside G,Latifoloside C and Latifoloside G interacting with BSA

2.1.2 三萜類皂苷對BSA的熒光猝滅機理 小分子對蛋白的熒光猝滅主要以靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅為主，動態(tài)猝滅是由分子擴散和碰撞引起的，靜態(tài)猝滅是因猝滅劑與生物大分子之間形成復(fù)合物引起的。兩種猝滅機制均遵循Stern-Volmer 方程：

其中，F(xiàn)0和F 代表無猝滅劑和有猝滅劑時的蛋白質(zhì)相對熒光強度，[Q]是猝滅劑摩爾濃度，mol/L，Kq 為雙分子熒光猝滅常數(shù)，Ksv 為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，代表熒光團對于猝滅劑的敏感性，τ0為無猝滅劑時熒光團的平均壽命，BSA的平均熒光壽命為l0?8s[9]。

結(jié)合表1 和圖2 可看出，三種皂苷的Ksv 值均較低，這可能是因為Kudinoside G、Latifoloside C、Latifoloside G 分子量較大（分別為1074、1074、1220 Da），極性基團較少，很難插入到BSA的疏水局部區(qū)域中[7?8,12]。在不同溫度下，Latifoloside G的Ksv 值大于Kudinoside G 及Latifoloside C的Ksv 值，表明Latifoloside G的熒光猝滅程度較大，這可能與Latifoloside G的結(jié)構(gòu)中C-28 位含有Rha的糖支鏈有關(guān)[6?8]。

表1 不同溫度下的猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)Table 1 Quenching constants and quenching rate constants at different temperatures

圖2 不同溫度下藥物小分子對BSA 熒光猝滅Stern-Volmer 圖Fig.2 Fluorescence quenching of BSA by small moleces at different temperatures stern-volmer diagram

2.1.3 三萜類皂苷與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點通過雙對數(shù)回歸曲線可得到結(jié)合常數(shù)Ka 和結(jié)合位點n 數(shù)，熒光強度和猝滅劑濃度關(guān)系則表示為[9]：

以log[（F0?F）/F]對log[Q]作圖，得出的斜率即為結(jié)合位點數(shù)n，所得截距則為logKa，結(jié)合常數(shù)為Ka，其結(jié)果如表2 所示?？煽闯觯S溫度的增加，Kudinoside G的結(jié)合常數(shù)在降低，結(jié)合熒光猝滅結(jié)果，表明Kudinoside G 對BSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，形成的復(fù)合物穩(wěn)定性較小。Latifoloside C、Latifoloside G 與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)隨著溫度升高而升高，表明作用過程中以動態(tài)猝滅為主[15?18]。

表2 不同溫度下結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點Table 2 The binding constants and binding sites at different temperatures

2.1.4 三萜類皂苷與BSA的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力類型 藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力包括：疏水作用力、范德華作用力、靜電力和氫鍵等；根據(jù)Van’t Hoff 方程（下式1）和熱力學(xué)公式（下式2）計算出反應(yīng)過程中焓變ΔH、熵變ΔS 以及吉布斯自由能ΔG 等參數(shù)，并根據(jù)ΔH 及ΔS的相對大小推斷三種皂苷與BSA 之間的作用力類型。

當(dāng)溫度相對穩(wěn)定時，ΔH 為常數(shù)，R 為氣體常數(shù)，T 為實驗時的溫度，Ka 為相應(yīng)溫度下結(jié)合常數(shù)，以RlnKa 為縱坐標(biāo)對?1/T 作圖，所得斜率即為ΔH，截距則為ΔS，結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知，Kudinoside G 與BSA 相互作用過程中，ΔH<0，ΔS<0，ΔG<0，|ΔH|> T| ΔS|，表明，反應(yīng)為自發(fā)進行，且其會使溫度升高的放熱過程不利于形成穩(wěn)定的復(fù)合物，反應(yīng)過程中的作用力主要為氫鍵和范德華力。Latifoloside C 及Latifoloside G 在與BSA作用的過程中，ΔH>0，ΔS>0，ΔG<0，且T| ΔS|>| ΔH|，這表明此過程為熵驅(qū)動吸熱反應(yīng)，兩者之間的主要作用力為疏水作用力[19?23]。

表3 相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Relevant thermodynamic parameters

2.2 圓二色譜法研究三萜類皂苷對BSA 構(gòu)象的影響

圓二色譜法（CD）在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象方面具有獨特的優(yōu)勢，可獲得蛋白構(gòu)象變化信息以及定量計算α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)則卷曲含量。BSA 含有典型α-螺旋結(jié)構(gòu)，含量為67%，并在CD 遠紫外區(qū)的208、220 nm 處均存在負峰[12]，其余的多肽形成無規(guī)卷曲[20]。圖3 為BSA 與不同濃度的大葉冬青皂苷結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化。

如圖3 所示，隨著大葉冬青皂苷濃度的不斷增加，BSA的負橢圓率峰較未加藥物前總趨勢是增加的。通過計算得到表4，當(dāng)Kudinoside G 與BSA 摩爾濃度比39:1、Latifoloside C 與BSA 摩爾濃度比39:1、Latifoloside G 與BSA 摩爾濃度比65:1 時，復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)α-螺旋含量最高。Kudinoside G 使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)從66.4%增加到78%；Latifoloside C 使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)從61.6%增加到78%，Latifoloside G 使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)從63.8%增加到75.1%。Kudinoside G 使得無規(guī)則卷曲含量由21.5%降低到4.9%，Latifoloside C 使得無規(guī)則卷曲含量由23.3%降低到9.1%，Latifoloside G 使得無規(guī)則卷曲含量由20.3%降低到4.6%。綜上表明皂三種苷與BSA 結(jié)合后，Latifoloside C 及Latifoloside G 與BSA 在疏水作用力下、Kudinoside G 與BSA 在氫鍵及范德華力的作用下均使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變高，均使得無規(guī)則卷曲含量降低[24?28]。

表4 BSA 二級結(jié)構(gòu)在不同濃度藥物小分子作用下的變化(%)Table 4 Changes of BSA’s secondary structure under the effect of small moleces with different concentrations of drugs(%)

圖3 室溫下Kudinoside G、Latifoloside C、Latifoloside G 與BSA 作用的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism of Kudinoside G,Latifoloside C,Latifoloside G and BSA at room temperature

3 結(jié)果與討論

對比具有相同的母核結(jié)構(gòu)的Latifoloside G 和Kudinoside G 發(fā)現(xiàn)，Latifoloside G的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點均大于Kudinoside G，這兩種皂苷僅在C-28 位所連的糖鏈不同，這說明與BSA的結(jié)合能力與C-28 位所連的極性基團有關(guān)。對比Kudinoside G 和Latifoloside C 發(fā)現(xiàn)，兩者分子量相同，Kudinoside G 比Latifoloside C 在C-19 位處多連接一個甲基，這使得C-19 位的羥基空間位阻增大[29]，甲基作為給電子基團，會導(dǎo)致C-19 位羥基的吸電子能力減弱，羥基極性減弱，氫鍵不易斷裂[30]，因而使得Kudinoside G 與BSA的結(jié)合能力變?nèi)酰R墩果烷型的Latifoloside C 更易于插入到BSA的疏水腔中[5?8,12]。三種苷與BSA 結(jié)合后，Latifoloside C 及Latifoloside G與BSA 在疏水作用力下、Kudinoside G 與BSA 在氫鍵及范德華力的作用下均會使得BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變高，使得無規(guī)則卷曲含量降低。

本文研究了298、310 K 溫度下Latifoloside G、Latifoloside C 及Kudinoside G 與BSA 相互作用情況，結(jié)合Stern-Volmer 方程、雙對數(shù)回歸曲線、Van’t Hoff 方程等結(jié)果，推斷出Kudinoside G 對BSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，Latifoloside C、Latifoloside G 與BSA 以動態(tài)猝滅為主。Latifoloside G、Kudinoside G 和Latifoloside G 均與BSA 有結(jié)合位點，坡莫醇酸型皂苷類化合物L(fēng)atifoloside G 與BSA的結(jié)合程度最高，其更容易插入到BSA 內(nèi)部疏水腔中，三種皂苷與BSA 結(jié)合能力的順序為Latifoloside G>Latifoloside C>Kudinoside G。三種大葉冬青皂苷與BSA 結(jié)合皆會改變BSA的結(jié)構(gòu)，增加α-螺旋含量，降低規(guī)則卷曲含量，緊密蛋白的生色團疏水結(jié)構(gòu)，減少肽鏈的伸展程度，減小使其所處微環(huán)境的極性，增加其疏水性。這些結(jié)果為研究大葉冬青皂苷在體內(nèi)運輸及作用機制提供實驗依據(jù)，對于大葉冬青入血成分的研究具有重要意義。