何欣燃，王黎洲，許 敏，安天志，周 石，李 興

作者單位：550004 貴陽 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院

目前急性缺血性腦卒中的主要治療方式是靜脈溶栓和血管內(nèi)介入治療，如血管內(nèi)機(jī)械取栓、動(dòng)脈溶栓和動(dòng)脈成形術(shù)［1］。然而研究表明，血管成功再通仍可發(fā)生腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI），造成更為嚴(yán)重的腦組織結(jié)構(gòu)和功能損害［2］。因此，探究CIRI 潛在分子機(jī)制，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)以減輕腦損傷，是當(dāng)前缺血性腦卒中研究的主要目標(biāo)。目前已報(bào)道微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）在慢性心血管或腎臟疾病過程中的作用［3］。有研究發(fā)現(xiàn)信使RNA（mRNA）和長(zhǎng)非編碼RNA，與DNA 和組蛋白相似，可被化學(xué)修飾，最為重要的是mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可影響關(guān)鍵蛋白表達(dá)和腦功能［4］。RNA 最豐富的內(nèi)部化學(xué)修飾N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是mRNA穩(wěn)定性、蛋白表達(dá)和其他數(shù)個(gè)細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5］，m6A 上的pri-miRNA 可擾亂miRNA 成熟［6］。近期研究表明mRNA 上m6A 修飾是可逆的，并受催化甲基轉(zhuǎn)移酶如甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（methyltransferase like protein，METTL）3、METTL4、METTL14 等催化［7］。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)miR-155 表達(dá)與腦部神經(jīng)元凋亡呈負(fù)相關(guān)［8］，但CIRI 過程中調(diào)控miR-155 表達(dá)的上游機(jī)制即m6A 甲基化是如何調(diào)控primiRNA，從而調(diào)控miR-155 集中尚未闡明。本研究旨在探討m6A 修飾與miR-155 表達(dá)水平在CIRI形成過程中的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物

小鼠腦神經(jīng)瘤母細(xì)胞（N2a）及293T 細(xì)胞均購(gòu)自湖南豐暉生物科技公司。本研究采用的實(shí)驗(yàn)方案已獲貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。所用動(dòng)物為8月齡C57BL/6雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～25 g。術(shù)前小鼠在12 h 光照和12 h 黑暗條件、控制溫度（21±2）℃、控制濕度60%～75%環(huán)境中飼養(yǎng)1 周，保證充足的實(shí)驗(yàn)室飼料和水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

miR-155 過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技公司），TRIzol 試劑、磷酸緩沖液（PBS）（美國(guó)Thermo Fisher 科技公司），β- 肌動(dòng)蛋白（actin）內(nèi)參抗體、miR-155 mimics、miR-155 inhibitor（英國(guó)Abcam 公司），DL5000 marker、DL2000 marker、限制性內(nèi)切酶（日本TaKaRa 公司），質(zhì)粒小量提取試劑盒（北京索萊寶科技公司），DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（北京擎科生物科技公司）。

1.3 小鼠CIRI 建立和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)組小鼠接受頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型［9］，建模成功24 h 后開始實(shí)驗(yàn)；假手術(shù)組小鼠麻醉后，不置入線栓，不阻塞大腦中動(dòng)脈，其余手術(shù)步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。手術(shù)過程中及結(jié)束后均使用37℃恒溫電熱板維持小鼠體溫，直至其完全蘇醒。共分為7 組，分別為假手術(shù)組（sham）、缺血-再灌注模型組（MCAO）、缺血-再灌注模型右側(cè)腦室注射對(duì)照組（LV-NEG）、缺血-再灌注模型右側(cè)腦室注入miR-155 過表達(dá)組（LV-miR-155）、缺血-再灌注模型右側(cè)腦室注入對(duì)照質(zhì)粒組（LV-minics）、缺血-再灌注模型右側(cè)腦室注入METTL3 高表達(dá)質(zhì)粒組（LVMETTL3）、缺血-再灌注模型右側(cè)腦室注入METTL3沉默表達(dá)質(zhì)粒組（LV-METTL3-inhibitor），每組各6只鼠。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

采用TRIzol 法從處死小鼠腦組織提取RNA，以39 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水稀釋1 μL RNA（1∶40 稀釋），NanoDrop 儀測(cè)定樣品濃度和純度，A260/A280 比值應(yīng)在1.6 以上。總RNA 逆轉(zhuǎn)錄。取聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）混合液20 μL，轉(zhuǎn)移至各孔中；將PCR 板裝入實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）儀，按照如下程序運(yùn)行：95℃2 min，95℃5 s，60℃30 s，95℃5 s，循環(huán)次數(shù)40 次。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并用Image-Pro Plus 圖像分析軟件計(jì)算吸光度值，以與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）相對(duì)值記錄結(jié)果。2-△△Ct 法分析基因相對(duì)表達(dá)［10］，計(jì)算公式：ΔΔCT＝ΔCt（MCAO 組）-ΔCt（對(duì)照組）。引物序列（蘇州金唯智生物科技有公司）如下：miR-155-F：5′-GCTTCGGTTAATGCTAATCGTG-3′；miR-155-R：5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′；GAPDH 上游引物5′-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)

為了構(gòu)建帶His 標(biāo)簽的慢病毒表達(dá)載體，采用PCDH 載體系列行目的基因miR-155 和METTL3 過表達(dá)，PLKO 系列行目的基因miR-155 和METTL3敲除。質(zhì)粒合成由外包公司合作完成。采用293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，大腸桿菌DH5α 行擴(kuò)增慢病毒包裝的質(zhì)粒。細(xì)胞準(zhǔn)備好后取5～10 μg/mL 聚凝胺作為轉(zhuǎn)染濃度，轉(zhuǎn)染后24 h 吸取慢病毒轉(zhuǎn)染液中原有培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入2 μg/mL 嘌呤霉素行選擇性培養(yǎng)細(xì)胞24 h，共計(jì)培養(yǎng)3 代即可得到含有慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞；將轉(zhuǎn)染慢病毒載體的細(xì)胞通過胰酶進(jìn)行消化，然后加入人工腦脊液中，注射至小鼠右腦室；轉(zhuǎn)染后5 d 行造模檢測(cè)，RT-qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

細(xì)胞裂解液PBS 對(duì)小鼠右腦組織樣本進(jìn)行裂解，4℃、12 000×g離心2～3 min，收集上清液，Bradford 法檢測(cè)相關(guān)蛋白濃度；蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；按蛋白印跡位置剪開PVDF 膜，每張膜加入一抗稀釋液2 mL；含一抗溶液的封閉液滴加于搖床塑料膜上，將Western 膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，4℃靜置過夜；一抗試劑孵育結(jié)束后，用含Tween?20 磷酸鹽緩沖液（PBST）對(duì)膜再次清洗，將二抗試劑按1∶1 000 比例加入膠體溶液中，將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后與偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h；PBST 對(duì)膜再次清洗；最后置于Super ECL Plus 超敏發(fā)光液中2 min，凝膠成像儀中成像。Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值，β-actin 作為對(duì)照，室溫下在中封閉1 h 后，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯示目標(biāo)蛋白條帶。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)值均取3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)±s，統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCAO 模型腦細(xì)胞中miR-155 表達(dá)水平

RT-qPCR 檢測(cè)顯示，MCAO 組小鼠腦組織細(xì)胞中pri-miR-155 表達(dá)水平與sham 組相比顯著降低（P=0.009），但pre-miR-155、miR-155 表達(dá)顯著升高（P=0.007、0.000 8），見圖1。

圖1 MCAO 組和sham 組小鼠腦組織中miR-155 表達(dá)水平

2.2 METTL 復(fù)合物在MACO 模型中表達(dá)水平

建模24 h 檢測(cè)顯示，MACO 模型鼠右腦組織細(xì)胞中METTL3、miR-155 表達(dá)水平均升高（P＜0.05）（圖2①），METTL3 蛋白表達(dá)水平隨miR-155 劑量增加而升高（圖2②），但METTL14 mRNA 與腎母細(xì)胞瘤1 相關(guān)蛋白（WTAP）mRNA 表達(dá)水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2③）

圖2 METTL3、METTL14 及WTAP 在MACO 模型中表達(dá)水平分析

2.3 METTL3 過表達(dá)對(duì)miR-155 水平的影響

慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒LV-METTL3 組細(xì)胞中METTL3 過表達(dá)與對(duì)照質(zhì)粒LV-minics 組相比，使pri-miR-155 表達(dá)水平顯著降低（P=0.008），同時(shí)升高pre-miR-155 和miR-155 表達(dá)水平（P=0.04、0.009），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 METTL3 過表達(dá)對(duì)小鼠CIRI過程中miR-155 水平的影響

2.4 METTL3 低表達(dá)對(duì)miR-155 水平的影響

慢病毒沉默表達(dá)質(zhì)粒LV-METTL3-inhibitor 組細(xì)胞中METTL3 沉默表達(dá)與對(duì)照質(zhì)粒LV-minics 組相比，顯著升高pri-miR-155 表達(dá)水平（P=0.006），同時(shí)降低pre-miR-155、miR-155 表達(dá)水平（P=0.03、0.009），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 沉默表達(dá)METTL3 對(duì)小鼠CIRI 過程中miR-155 水平的影響

3 討論

近年來，m6A 修飾成為表觀遺傳研究熱點(diǎn)。m6A 修飾參與哺乳動(dòng)物許多生物學(xué)過程，如RNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯和干細(xì)胞更新［11］。Li 等［12］研究報(bào)道m(xù)6A 上METTL3 可通過與翻譯起始密碼子相互作用促進(jìn)翻譯，進(jìn)一步影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和侵襲。Visvanathan 等［13］研究顯示，METTL3 介導(dǎo)的m6A修飾在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞維持和去分化中具有關(guān)鍵作用，揭示了METTL3 作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中潛在分子靶點(diǎn)的基本作用。上述研究雖然證實(shí)METTL3 在腫瘤細(xì)胞中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，但目前尚無針對(duì)CIRI 過程中M6A 修飾影響的報(bào)道，也很少有研究關(guān)注METTL3 在CIRI 發(fā)生中的潛在機(jī)制［14］，因此本研究探討METTL3 在CIRI 中對(duì)miR-155 是否存在調(diào)控作用。

有研究報(bào)道，miR-155 體內(nèi)表達(dá)能顯著改善腦缺血癥狀，增加血管內(nèi)皮通透性［3］。有研究證實(shí)miR-155 表達(dá)水平變化與腦損傷程度密切相關(guān)，miR-155 表達(dá)升高與腦損傷程度加劇相關(guān)［15］。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑制腦細(xì)胞中miR-155-5p、pri-miR-155 和pre-miR-155 表達(dá)，可改善大鼠腦缺血損傷程度，提示miR-155 可能是一種新型腦血管病治療劑。該結(jié)論為本研究結(jié)果提供了強(qiáng)有力佐證，表明miR-155 在腦損傷中具有重要作用。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)miR-155 在CIRI 過程中異常表達(dá)［8］。本研究將pri-miR-155 中異常m6A 修飾與CIRI 發(fā)生和發(fā)展聯(lián)系起來，結(jié)果提示MCAO 模型小鼠腦組織細(xì)胞中miR-155 水平可能是pri-miR-155 加工和成熟異常造成的。

m6A 在miRNA 成熟過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物由METTL3、METTL14和WTAP 組成，其中METTL3 過表達(dá)能增強(qiáng)pri-miR中m6A 修飾，并加速其向miRNA 成熟［17］。本研究結(jié)果輔證了這一觀點(diǎn)，證實(shí)MCAO 建模24 h 小鼠右腦中METTL3 和miR- 155 表達(dá)均顯著增高，METTL3 蛋白表達(dá)也隨miR-155 劑量增加而顯著增加，但METTL14 和WTAP 并無顯著差異；了解到METTL3 和miR-155 表達(dá)水平呈正相關(guān)后，為進(jìn)一步探究METTL3 表達(dá)對(duì)pri-miR-155 和pre-miR-155表達(dá)的影響，又分別構(gòu)建METTL3 高表達(dá)和低表達(dá)小鼠模型，最終發(fā)現(xiàn)METTL3 表達(dá)升高能促進(jìn)premiR-155 成熟，從而導(dǎo)致miR-155 表達(dá)水平升高。

本研究結(jié)論認(rèn)為，CIRI 過程中METTL3 表達(dá)升高可促進(jìn)pre-miR-155 成熟，進(jìn)而升高miR-155 表達(dá)水平。這可能為未來缺血性腦卒中患者提供一新治療策略。