李楓燁，吳靜顏，蘭艷妮，黃揚(yáng)玉，譚福洋，梁光健，浦月霞*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市530007）

家蠶良種繁育制度采用三級繁育四級制種的形式，原原母種是良種繁育的最高種級。為了保持品種的優(yōu)良性狀、延長品種使用年限，原原母種的擇優(yōu)選留尤為關(guān)鍵。母種單蛾的產(chǎn)卵量和不良卵數(shù)是評判母蛾產(chǎn)卵質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是催青期間進(jìn)行卵期選擇的重要參考。本研究在母種收蟻孵化后，對收蟻卵圈的孵化卵數(shù)、未孵化卵數(shù)、死卵數(shù)和不受精卵數(shù)進(jìn)行調(diào)查計(jì)數(shù)，可計(jì)算出孵化率、不良卵率等調(diào)查數(shù)據(jù)，為母種進(jìn)行優(yōu)選留種提供數(shù)據(jù)支撐。

廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站（以下簡稱廣西蠶業(yè)站）是廣西唯一的原原母種繁育單位，承擔(dān)全區(qū)主推品種的母種繁育任務(wù)，母種繁育品種多、數(shù)量多、責(zé)任大，因此調(diào)查蠶種孵化率、不良卵率的任務(wù)也十分艱巨，需要在短時(shí)間內(nèi)調(diào)查所飼育的全部蠶種蛾圈。傳統(tǒng)的蠶卵計(jì)數(shù)方法是用彩色筆手動打點(diǎn)，耗時(shí)長、效率低、強(qiáng)度大、操作人員易疲勞，如若期間受到干擾或打斷時(shí)，常面臨返工風(fēng)險(xiǎn)，隨著操作人員疲勞感加重，計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差率也會增大。

經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，通過基于機(jī)器視覺的圖像分析技術(shù)來實(shí)現(xiàn)自動計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)方式已經(jīng)大量應(yīng)用到了生物學(xué)科的研究上。如馬健錦［1］設(shè)計(jì)的菌落自動計(jì)數(shù)軟件，是通過利用Open CV 庫函數(shù)對培養(yǎng)皿圖像進(jìn)行濾波、灰度化、二值化、查找輪廓、色差比對、形態(tài)學(xué)比對等一系列操作，找出識別、分割、統(tǒng)計(jì)出圖片中菌落數(shù)量的準(zhǔn)確方法。蘇凌霄［2］以馬鈴薯晚疫病為研究對象，應(yīng)用圖像處理的方法對孢子圖像開展計(jì)數(shù)研究，完成了基于圖像處理的細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)軟件的設(shè)計(jì)，該系統(tǒng)軟件能夠?qū)崿F(xiàn)孢子圖像的在線和離線獲取，也能通過點(diǎn)擊按鈕完成孢子圖像的各處理流程的結(jié)果預(yù)覽和自動計(jì)數(shù)。萬路瑤［3］以大豆（黃豆）為試驗(yàn)對象，分析了現(xiàn)有的兩種黏連種子圖像的分割計(jì)數(shù)方法，針對黏連種子區(qū)域分割效果不佳的問題，采用基于圖像識別的方法先識別種子黏連類型后精準(zhǔn)分割，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的種子計(jì)數(shù)。不同領(lǐng)域的研發(fā)人員會根據(jù)樣品的實(shí)際圖像效果采用不同的算法設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的自動計(jì)數(shù)［4-7］。

圖形識別計(jì)數(shù)軟件應(yīng)用范圍廣泛，但在紙面蠶卵識別上的應(yīng)用還未見報(bào)道，而蠶卵作為相似的規(guī)則顆粒狀樣品，是可以很好地應(yīng)用圖像識別技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動計(jì)數(shù)的。為了準(zhǔn)確、快速地對母種收蟻卵圈的孵化卵數(shù)、未孵化卵數(shù)、死卵數(shù)和不受精卵數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，廣西蠶業(yè)站聯(lián)合軟件設(shè)計(jì)人員研發(fā)了紙面蠶卵計(jì)數(shù)系統(tǒng)（以下簡稱計(jì)數(shù)系統(tǒng)），形成一套紙面蠶卵自動計(jì)數(shù)方法，并將其與人工計(jì)數(shù)的工效進(jìn)行對比分析，以期更好地提高該方法的科學(xué)性、實(shí)用性。

1 蠶卵自動計(jì)數(shù)方法

1.1 蠶卵自動計(jì)數(shù)的應(yīng)用場景

蠶卵自動計(jì)數(shù)方法通常應(yīng)用于收蟻后卵圈的卵粒計(jì)數(shù)。原原母種的繁育采用單蛾區(qū)飼育，催青期選擇發(fā)育良好的卵圈包種收蟻，收蟻后的卵圈經(jīng)過掃描儀形成圖像導(dǎo)入計(jì)算機(jī)程序，通過色塊識別、分割等圖像分析技術(shù)標(biāo)記卵粒并進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法也可用于收蟻前的卵圈卵粒計(jì)數(shù)，但存在影響孵化的情況，一是卵圈暴露在光照環(huán)境下影響蠶卵發(fā)育，二是用掃描儀取像時(shí)易壓壞蠶卵。

1.2 儀器設(shè)備和材料

1.2.1 儀器設(shè)備 EPSON DS1610 平板式掃描儀，由精工愛普生株式會社生產(chǎn)。聯(lián)想510S 臺式電腦，由聯(lián)想LENOVO生產(chǎn)。

1.2.2 材料 桂蠶8號的4個(gè)母種錦（9MN）、繡（芙H）、壯（7MH）、麗（87H）的蠶卵由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站家蠶遺傳育種研究室提供。

1.3 蠶卵自動計(jì)數(shù)操作流程

蠶卵自動計(jì)數(shù)的操作流程見圖1。

圖1 蠶卵自動計(jì)數(shù)的操作流程

1.4 蠶卵自動計(jì)數(shù)方法步驟

1.4.1 掃描儀取像 將卵殼圈整齊排列，置于平板式掃描儀的掃描區(qū)域后，合上蓋子，按下掃描鍵一步完成掃描和存儲。所使用掃描儀1 次最多可同時(shí)取像24 個(gè)卵圈。為了演示清楚，下面圖示將使用2 個(gè)卵圈的計(jì)數(shù)過程作描述（圖2）。

1.4.2 導(dǎo)入圖片到計(jì)數(shù)軟件 打開計(jì)數(shù)軟件，點(diǎn)擊“打開圖片”按鈕，選擇需要處理的圖片，點(diǎn)擊確定，把待計(jì)數(shù)的卵圈圖片導(dǎo)入程序的主界面。

1.4.3 檢測目標(biāo)區(qū) 圖片導(dǎo)入后，點(diǎn)擊“檢測目標(biāo)區(qū)”按鈕，對卵圈進(jìn)行計(jì)數(shù)區(qū)域的框選。此步驟可以手動校正框選區(qū)域，以免出現(xiàn)框選卵圈不完整的情況。

1.4.4 自動計(jì)數(shù) 點(diǎn)擊“蠶種計(jì)數(shù)”按鈕，程序即對圖片上的所有卵圈按設(shè)定的排列規(guī)則進(jìn)行逐一編號，然后開始標(biāo)記計(jì)數(shù)，并在界面右邊數(shù)據(jù)區(qū)域顯示出蠶卵初步計(jì)數(shù)結(jié)果（圖2）。

圖2 蠶卵計(jì)數(shù)

1.4.5 手動編輯校正 操作人員逐一檢查每個(gè)卵圈初步計(jì)數(shù)的標(biāo)記準(zhǔn)確度，對少量錯標(biāo)、多標(biāo)的蠶卵進(jìn)行取消標(biāo)記修正，對漏標(biāo)的情況用不同顏色增加標(biāo)記修正（圖3）。手動編輯的數(shù)量也會相應(yīng)列示在界面右邊的表格里，此時(shí)的計(jì)數(shù)結(jié)果隨著手動編輯數(shù)校正而修正。

圖3 手動編輯校正

1.4.6 導(dǎo)出Excel 文件及計(jì)數(shù)圖 計(jì)數(shù)完成后，點(diǎn)擊“導(dǎo)出計(jì)數(shù)結(jié)果為Excel文件”按鈕，可把計(jì)數(shù)結(jié)果以Excel 文件導(dǎo)出保存，點(diǎn)擊“保存計(jì)數(shù)圖”按鈕，可以保存計(jì)數(shù)圖片。

1.5 選取家蠶品種和計(jì)數(shù)設(shè)置

選取桂蠶8 號的4 個(gè)母種錦（9MN）、繡（芙H）、壯（7MH）、麗（87H）的母種卵圈進(jìn)行自動計(jì)數(shù)和人工計(jì)數(shù)比較。收蟻后對以上4 個(gè)品種分別隨機(jī)抽取10個(gè)卵圈，共40 個(gè)卵圈，先用電腦自動計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，后用人工點(diǎn)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，對比計(jì)數(shù)結(jié)果及所需時(shí)長，分析計(jì)數(shù)效果。

2 計(jì)數(shù)效果分析

2.1 計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率分析

以人工計(jì)數(shù)為對照，人工計(jì)數(shù)與自動計(jì)數(shù)對比分析見表1。從表1可以看出，品種錦、壯的自動計(jì)數(shù)結(jié)果小于人工計(jì)數(shù)結(jié)果的情況較繡、麗多，即漏標(biāo)卵粒更多，估計(jì)是由于錦、壯卵殼顏色較接近蠶種紙的顏色導(dǎo)致。品種繡、麗的初步偏差值多為正數(shù)，平均值分別為27 粒和28 粒。估計(jì)與繡、麗的卵粒數(shù)較多、排列更緊密，圖像識別難度加大有關(guān)，更容易發(fā)生錯標(biāo)、多標(biāo)。初步計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，錦、繡、壯、麗4個(gè)品種的平均偏差比例分別為3.63%、4.97%、3.55%、4.54%，偏差比例均在5%之內(nèi)，屬可接受范圍，已基本滿足實(shí)用化的需求。經(jīng)編輯校正后，錦、繡、壯、麗4 個(gè)品種的平均偏差比例分別為0.63%、0.66%、0.84%、1.44%，除品種麗外，其余3 個(gè)品種的平均偏差比例均小于1%，相比自動直接計(jì)數(shù)有了大幅度降低，誤差可忽略不計(jì)。值得一提的是，手動校正的準(zhǔn)確度與時(shí)長成正比，但為了兼顧效率與準(zhǔn)確度，試驗(yàn)認(rèn)為目前手動校正所用時(shí)長及修正程度是較為合理的。

表1 40個(gè)卵圈的人工計(jì)數(shù)與電腦計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)對比

續(xù)表1

2.2 計(jì)數(shù)工效分析

設(shè)定每次掃描識別20 個(gè)卵圈，從開始計(jì)數(shù)到生成Excel文件為標(biāo)準(zhǔn)流程，對比分析人工計(jì)數(shù)與自動計(jì)數(shù)2 種方法的工效。人工計(jì)數(shù)的時(shí)長是在保證計(jì)數(shù)人的操作準(zhǔn)確、速度快且身體不疲勞的前提下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共記錄了4位技術(shù)人員所用時(shí)長（表2）。自動計(jì)數(shù)在操作過程中，時(shí)間主要消耗在手動編輯校正的環(huán)節(jié)，如前文所述，目前手動校正所用時(shí)長及修正程度是兼顧了效率與準(zhǔn)確度，因此是較為合理的。經(jīng)計(jì)算得出，不經(jīng)過手動編輯校正的自動計(jì)數(shù)，工效比人工計(jì)數(shù)提高42～48 倍，加上手動編輯校正的時(shí)長后，工效比人工計(jì)數(shù)亦提高7～8倍。實(shí)際上，掃描儀每次最多可取像24 個(gè)卵圈，而工人的精力有限，就母種繁育中蠶種計(jì)數(shù)的實(shí)際工作量而言，在手動編輯校正過后，自動計(jì)數(shù)方法的工效會比人工計(jì)數(shù)提高7～8倍。

表2 40個(gè)卵圈的自動計(jì)數(shù)與人工計(jì)數(shù)時(shí)長對比

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

通過對蠶卵人工計(jì)數(shù)與自動計(jì)數(shù)效果進(jìn)行對比分析，顯示自動計(jì)數(shù)方法操作簡便、省時(shí)高效，自動計(jì)數(shù)與人工計(jì)數(shù)的4 個(gè)品種的平均偏差比例分別為3.63%、4.97%、3.55%、4.54%，偏差率均小于5%，已基本滿足實(shí)用化的需求。蠶卵自動計(jì)數(shù)的工效比人工計(jì)數(shù)的工效提高42～48倍。經(jīng)手動編輯校正，4個(gè)品種的平均偏差率分別為0.63%、0.66%、0.84%、1.44%，蠶卵自動計(jì)數(shù)的工效比人工計(jì)數(shù)的工效提高7～8 倍，蠶卵自動計(jì)數(shù)法省力高效，誤差小，解決了以往人工計(jì)數(shù)耗時(shí)長、效率低、用眼強(qiáng)度大、易疲勞且不能長時(shí)間連續(xù)工作的問題。

本套蠶卵自動計(jì)數(shù)方法是通過平板式掃描儀獲得圖像，與通過數(shù)碼相機(jī)、智能手機(jī)等拍照獲得圖像的方式相比，具有掃描成像不受環(huán)境光源的影響，大大減少了圖像的灰度差異的優(yōu)點(diǎn)，為計(jì)數(shù)軟件處理圖像提高準(zhǔn)確度和效率提供了良好的條件；與通過高清攝像頭將樣品置于封閉空間內(nèi)取像相比，該方式只需要基本的辦公設(shè)備就可操作，具有操作簡單、使用方便、價(jià)格低廉和容易普及等優(yōu)勢。并且計(jì)數(shù)軟件可將計(jì)數(shù)結(jié)果直接形成Excel文件并導(dǎo)出，為技術(shù)人員節(jié)省了整理數(shù)據(jù)的時(shí)間。

3.2 討論

蠶卵自動計(jì)數(shù)方法在實(shí)際操作時(shí)，程序自動計(jì)數(shù)存在一定的誤差，并存在影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率的可能因素：一是不同品種的卵圈形狀、產(chǎn)附排列影響準(zhǔn)確性；二是單圈卵粒數(shù)越多，卵粒排列越緊密，容易發(fā)生漏標(biāo)和錯標(biāo)；三是不同品種的卵殼顏色與蠶種紙底色相似時(shí)，容易發(fā)生錯標(biāo)；四是不受精卵、死卵等不良卵顏色與孵化卵卵殼色不同，會發(fā)生漏標(biāo)。

針對以上的問題，應(yīng)繼續(xù)對計(jì)數(shù)軟件進(jìn)行技術(shù)上的升級，并進(jìn)一步完善自動計(jì)數(shù)方法的整套流程。首先是通過軟件輸入大量的數(shù)據(jù)入庫，提高軟件識別圖像的處理能力，精準(zhǔn)抓取每一粒蠶卵，減少因不同品種、不同產(chǎn)附密度對準(zhǔn)確度的影響；定制應(yīng)用于自動計(jì)數(shù)方法的母種專用蠶種紙，使得卵殼顏色與蠶種紙底色對比更明顯，能顯著提高軟件處理圖像的準(zhǔn)確度。通過軟件升級和配套使用專用蠶種紙，可提高直接計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確率，減少手動編輯校正的操作，大幅度提高蠶卵計(jì)數(shù)的工效。

目前的計(jì)數(shù)方法只能實(shí)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)總卵粒數(shù)，在處理圖像時(shí)不能區(qū)分已孵化卵、未孵化卵、不受精卵、死卵，不良卵的情況仍然依靠人工肉眼來辨別統(tǒng)計(jì)，這也是一項(xiàng)較耗時(shí)、易疲勞的工作。今后的研究方向便是開發(fā)計(jì)數(shù)軟件的識別與統(tǒng)計(jì)未孵化卵、不受精卵、死卵等不良卵數(shù)據(jù)的功能，可直接計(jì)算出孵化率、不受精率、死卵率等數(shù)據(jù)并形成Excel文件，徹底解決蠶卵計(jì)數(shù)的工作難題，實(shí)現(xiàn)蠶種篩選的一步到位。