王哲 祝率 劉歡 付薔 胡騰龍

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種侵襲性極強的惡性腫瘤，以易復(fù)發(fā)、高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為特征[1]，OSCC的診斷及治療一直是頭頸腫瘤學(xué)的研究熱點。目前OSCC治療方法還是以手術(shù)治療為主，放、化療為輔，但各期口腔鱗癌患者術(shù)后5年生存率僅為50%～60%，幾十年來未見明顯改善[2]。含Sushi重復(fù)蛋白X連鎖2(Sushi repeat containing protein X-linked 2，SRPX2)由Kurosawa發(fā)現(xiàn)于白血病細胞中，是一種分泌性蛋白質(zhì)。SRPX2的突變可導(dǎo)致癲癇、語言認知功能障礙[3]，并與多種癌癥的發(fā)生、遷徙密切相關(guān)。Ras相關(guān)蛋白31(Ras-related protein 31，Rab31)亦可稱為Rab22b，RAS癌基因家族成員[4]，負責控制人類細胞蛋白和脂類的轉(zhuǎn)運，也頻繁參與惡性腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。研究證實SRPX2、Rab31聯(lián)合可以作為胰腺癌患者的獨立預(yù)后因素[5]，但兩者在OSCC中的作用卻鮮有報道。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，檢測SRPX2、Rab31在口腔鱗癌組織和正?？谇火つそM織(Normal oral mucosal，NOM)中的表達，并進一步分析兩蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩蛋白之間的相關(guān)性，以期為OSCC的靶向治療、預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年—2020年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的OSCC石蠟組織標本68例。所有病理切片均證實為口腔鱗癌，臨床資料完整，術(shù)前均未接受放、化療及其他輔助療法。收集的病例中男性36例，女性32例；年齡范圍為22～90歲，≥60歲患者40例，<60歲患者28例；有吸煙史患者35例，無吸煙史患者33例；根據(jù)腫瘤組織分化程度分組：高分化鱗癌40例，中低分化鱗癌28例；根據(jù)TNM分組：T1～T2期30例，T3～T4期38例。根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組：存在轉(zhuǎn)移25例，不存在轉(zhuǎn)移43例。對照組為2018年—2020年間哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科二病房非腫瘤患者的正?？谇火つOM組織，共30例。

1.2 主要試劑

兔抗人SRPX2蛋白抗體(bs-11967R)和兔抗人ras基因相關(guān)蛋白Rab31抗體(bs-19710R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法

將所有蠟塊修整后，切成厚度為5 μm的切片，放入熱水中燙平，貼載玻片上并烘干。常規(guī)HE染色，鏡下確認病理分型。免疫組織化學(xué)SP法：將切片室溫下放置60 min，二甲苯脫蠟。無水、90%、85%、75%酒精逐級降濃度入水。PBS沖洗三次，5 min/次。80%甲醛滴加后室溫孵育10 min，PBS沖洗三次，5 min/次?？乖迯?fù)后PBS沖洗三次，5 min/次。滴加兔抗人SRPX2蛋白抗體一抗(1∶100)，兔抗人ras基因相關(guān)蛋白Rab31抗體一抗(1∶100)，在37℃下靜置1 h。常規(guī)PBS沖洗后滴加廣譜二抗，37℃下靜置1 h后PBS沖洗。室溫下DAB顯色10 min后蒸餾水沖洗中斷顯色過程。復(fù)染后沖洗10 min，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

結(jié)果判定由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行。每張片子先于低倍鏡下尋找細胞結(jié)構(gòu)清晰、染色均勻的區(qū)域。轉(zhuǎn)高倍鏡(400×)后，于該區(qū)域隨機選取5個不重疊的視野。按鏡下呈現(xiàn)的染色強度進行評分：無陽性著色計分為0；淺黃色計分為1；棕黃色計分為2；深褐色計分為3。陽性細胞百分率評分標準為：≤10%計分為0；10%～50%計分為1；50%～80%計分為2；>80%計分為3。將兩種評分的結(jié)果相乘，乘積作為切片的最終評分：乘積<3分為低表達，記為陰性(-)；乘積≥3分為高表達，記為陽性。

1.5 生物信息學(xué)分析

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(https：//www.oncomine.org/resource/login.html)對SRPX2和Rab31進行分析，分析兩者在OSCC組織和NOM組織中的表達差異。SRPX2和Rab31數(shù)據(jù)均來自Peng Head-Neck數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含57例口腔鱗狀細胞癌標本和22例正?？谇唤M織標本，共計18 148個被測基因。

1.6 隨訪

對實驗組的68例OSCC患者進行電話隨訪，篩除隨訪時間小于6個月、隨訪期間接受外院其他治療患者10人，剩余58例患者隨訪時間范圍(8～82)個月，中位隨訪時間25.5個月。隨訪患者自確診為OSCC開始至隨訪截止或因任何原因引起的死亡的時間為總生存期(OS)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗分析OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達差異及兩種蛋白表達與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用卡方檢驗計算φ系數(shù)分析OSCC中SRPX2和Rab31的相關(guān)性。應(yīng)用R 4.05軟件進行Wilcoxon秩和檢驗，分析Oncomine數(shù)據(jù)庫中OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達差異。采用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗進行生存分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRPX2和Rab31在Oncomine數(shù)據(jù)庫中的表達情況

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，SRPX2和Rab31在OSCC組織中的表達高于NOM組織(P<0.05)(圖1)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中口腔鱗癌和正常口腔黏膜中SRPX2和Rab31的表達

2.2 OSCC和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達

OSCC組織和NOM組織中，SRPX2主要定位于細胞質(zhì)，Rab31主要定位于細胞膜。68張OSCC組織切片中，SRPX2呈陽性表達的切片共48張，陽性表達率70.6%，Rab31呈陽性表達的切片共45張，陽性表達率66.2%；30張NOM組織切片中，SRPX2呈陽性表達的切片共10張，陽性表達率為33.3%。Rab31呈陽性表達的切片共12張，陽性表達率為40.0%。OSCC組織中SRPX2和Rab31的陽性表達率高于NOM組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2，表1)。

圖2 SRPX2、Rab31在OSCC組織與NOM組織中的表達分布(400×)

表1 SRPX2和Rab31在OSCC組織與NOM組織中的表達

2.3 SRPX2和Rab31的表達與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

OSCC組織中，SRPX2和Rab31的表達與患者的性別、年齡、吸煙史、TNM分期無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 68例OSCC患者中SRPX2、Rab31的表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 OSCC組織中SRPX2和Rab31表達的相關(guān)性

SRPX2與Rab31同時呈陽性表達的共40例，同時呈陰性表達的共15例。OSCC組織中SRPX2和Rab31的表達存在相關(guān)性(φ=0.562，P<0.001)(表3)。

表3 OSCC組織中SRPX2和Rab31表達的相關(guān)性

2.5 SRPX2、Rab31高表達組和低表達組生存曲線

SRPX2高表達的患者較SRPX2低表達的患者預(yù)后較差(χ2=7.738，P=0.005)，且Rab31高表達的患者預(yù)后同樣明顯較Rab31低表達的患者差(χ2=8.577，P=0.003)(圖3)。

圖3 SRPX2和Rab31高表達及低表達患者的生存曲線

3 討論

OSCC靶向治療中使用高效、敏感的治療靶點可提高癌癥患者生存率，最大限度的保留患者咀嚼、語言功能，最大程度的減輕術(shù)后牙頜面畸形的程度，從而提高患者生活質(zhì)量。本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對SRPX2和Rab31在OSCC組織和NOM組織中的表達進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRPX2與Rab31在OSCC組織中的表達均高于NOM組織。通過免疫組化法，檢測OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)進一步分析兩種蛋白的表達與OSCC的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，SRPX2與Rab31在OSCC組織中呈現(xiàn)高表達，且兩者存在相關(guān)性，在NOM組織呈現(xiàn)低表達或不表達，生存曲線證實SRPX2和Rab31與OSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示SRPX2和Rab31可以聯(lián)合作為OSCC的靶向治療和預(yù)后評估的指標。

SRPX2作為腫瘤治療的新靶標已在國內(nèi)外進行了廣泛研究，目前多靶點治療已經(jīng)成為靶向治療的普遍模式，我們積極尋找另一個靶點與SRPX2相匹配。Rab31一直被認為是重要的腫瘤啟動因子，所以我們聚焦于Rab31，并將SRPX2和Rab31聯(lián)合研究，猜想兩者聯(lián)合應(yīng)用的廣闊前景。SRPX2是一種硫酸軟骨素蛋白多糖，近年來已有多位學(xué)者研究證實其在肝癌[6]、食管鱗狀細胞癌[7]、非小細胞肺癌[8]等多種惡性腫瘤中呈高表達。SRPX2可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，增高多種惡性腫瘤對順鉑的耐藥性[7]，降低腫瘤的化療敏感性。在鱗狀細胞癌組織中，SRPX2可以通過調(diào)節(jié)血管、淋巴管內(nèi)皮細胞生長來促進血管、淋巴管再生[9]，為癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移提供途徑。PI3K/AKT通過直接調(diào)節(jié)、影響細胞存活調(diào)控作用等途徑抑制細胞凋亡，在腫瘤細胞中影響下游多種效應(yīng)分子發(fā)揮抗凋亡作用促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SRPX2的表達，可以抑制前列腺癌細胞中PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并因此抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移[11]。

Rab31最先克隆于黑素細胞cDNA中[12]，在機體中參與調(diào)控囊泡運輸、胞吞胞吐等生理過程，在惡性腫瘤組織中通過多種分子通路廣泛參與腫瘤的發(fā)展過程[13]。Rab31過表達可促進細胞增長，抑制腫瘤細胞凋亡，激活細胞周期[14]。在乳腺癌細胞中，過表達的Rab31可以導(dǎo)致癌細胞由侵襲性表型向增殖性表型轉(zhuǎn)變，增強細胞的增殖能力，降低黏附、侵襲能力[15]。Rab31可以通過激活PI3K/AKT信號通路提高肝癌細胞中Bcl-2/BAX等級，抑制癌細胞凋亡[16]，提示SRPX2和Rab31存在共同的信號通路，再一次佐證兩者聯(lián)合治療的可行性。本次研究結(jié)果顯示，SRPX2與Rab31在OSCC組織中的陽性表達率明顯高于NOM組織的表達，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步研究分析發(fā)現(xiàn)，SRPX2和Rab31陽性表達率與OSCC患者腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。這提示我們通過檢測SRPX2與Rab31的表達水平，可以做到評估OSCC的惡性等級、作為患者預(yù)后評估指標等，通過下調(diào)兩者的表達來抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而抑制口腔鱗癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase type plasminogen activator，uPA)和其特異性的受體纖溶酶原激活物受體(Urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)組成uPA/uPAR系統(tǒng)，uPA/uPAR系統(tǒng)可以將纖溶酶原激活為纖溶酶，而纖溶酶又裂解并激活基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)[17]。在腫瘤組織中，MMPs通過將細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)組分降解來增強腫瘤細胞遷徙、增殖的能力[18]。在OSCC的腫瘤微環(huán)境中，uPA可以影響全長和uPAR(Ⅱ～Ⅲ)的比值，潛在的影響OSCC細胞的遷移和侵襲[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)SRPX2是uPAR的一種新型配體[20]，可以通過uPAR通路和整合素/FAK通路的協(xié)同作用來促進血管生成[21]。新生的血管可以為腫瘤細胞帶來氧氣和營養(yǎng)，為腫瘤細胞提供轉(zhuǎn)移的途徑。uPAR與活性不依賴二價離子的甘露糖6-磷酸受體(CI-M6PR)相互作用可使uPAR進入核內(nèi)體降解從而調(diào)節(jié)細胞表面uPAR的水平，而Rab31則負責調(diào)節(jié)CI-M6PR從高爾基體到核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運。Rab31可能通過調(diào)節(jié)CI-M6PR的轉(zhuǎn)運從而控制uPAR的活性，影響腫瘤的發(fā)生和侵襲[22]。在OSCC組織中，SRPX2和Rab31可能共同參與調(diào)節(jié)uPA/uPAR系統(tǒng)，增強OSCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這可能是SRPX2、Rab31和OSCC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果提示SRPX2和Rab31聯(lián)合應(yīng)用可以為OSCC患者治療和預(yù)后分析提供新方向。通過對SRPX2和Rab31在OSCC中的陽性表達率以及兩者的相關(guān)性進行了分析后，結(jié)合當前兩種蛋白分別對uPA/uPAR系統(tǒng)的影響，我們雖然有理由猜測SRPX2和Rab31可能共同通過調(diào)節(jié)uPA/uPAR系統(tǒng)促進OSCC的轉(zhuǎn)移，但仍需要進一步的研究確認兩者促進OSCC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移的具體機制。